Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления о классификации лечебных грязей, методах исследования гумусовых кислот и их свойствах 9
1.1. Генетическая классификация лечебных грязей 9
1.2. Современные методы исследования гумусовых кислот и их свойства 12
1.3. Биологическая активность гуминовых кислот 34
Глава 2. Объекты и методы исследования 38
2.1. Выбор и характеристика объектов исследования 38
2.2. Методы исследования 44
2.2.1. Методы выделения, очистки и количественного определения 45
2.2.2. Методы химического исследования гумусовых кислот 49
2.2.3. Физические методы 53
2.2.4. Методы изучения биологической активности 55
Глава 3. Химический состав и свойства гумусовых кислот 57
3.1. Элементный состав 57
3.2. Молекулярно-массовое распределение 73
3.3. Функциональные группы и пороги агрегации 81
3.4. Кислотный гидролиз 86
3.5. Щелочное окисление перманганатом калия 97
Глава 4. Результаты изучения гумусовых кислот физическими методами 100
4.1. Электронные спектры поглощения 100
4.2. Инфракрасные спектр поглощения 103
4.3. Рентген-дифрактограммы 115
4.4. Электронная растровая микроскопия 118
4.5. Термограммы гуминовых кислот 123
4.6. ЭПР-спектры и концентрация парамагнитных центров 127
Глава 5. Изучение биологической активности гуминовых кислот Тамбуканской лечебной грязи 134
5.1. Противовоспалительная активность 134
5.2. Влияние гуминовых кислот на гематологические показатели у животных при экспериментальной лейкопении 136
Выводы 141
Литература 144
- Современные методы исследования гумусовых кислот и их свойства
- Методы выделения, очистки и количественного определения
- Функциональные группы и пороги агрегации
- Влияние гуминовых кислот на гематологические показатели у животных при экспериментальной лейкопении
Введение к работе
Шундаментальные исследования органического вещества почв, современных и ископаемых осадков показали единство и глобальный характер процесса гумификации на Земле. Использование ранее разработанных Д.С.Орловым теоретических представлений и экспериментальных приёмов анализа позволили нам впервые изучить гумусовые кислоты различных типов лечебных грязей (пелоидов), широко применяющихся в лечебных целях и являющихся ценным источником получения различных лекарственных средств.
Актуальность темы. Одной из важнейших задач Советского здравоохранения является поиск, всестороннее изучение биологически активных природных соединений и разработка на их основе высокоэффективных лекарственных препаратов.
Среди биогеохимических объектов пелоиды относятся к наиболее древним и эффективным природным средствам лечения различных заболеваний, приобретающим в настоящее время всё большее применение.
В научной проблеме использования природных факторов в лечебных и профилактических целях важным является вопрос о возможности получения биологически активных препаратов из объектов биогеохимического происхождения (лечебных грязей, рапы и др.), которые не уступали бы им по эффективности, могли быть использованы в комплексном лечении с различными физическими факторами, были бы удобны для транспортировки и хранения, экономически недорогостоящи-ми I08.
В настоящее время известно около 15 наименований различных грязевых препаратов: отгоны, отжимы, фильтраты, центрифугаты, возгоны, экстракты ит.д. Кроме того, существует несколько фармакопейных форм: пелоидодистиллят, гумизоль, пелоидин, торфот,пФиБС,!, "грязевой препарат". В Румынии широко используется экстракт сапро-
пелей - пелобиоль; в Австрии - водный экстракт торфа п$миїшШтп, «Jloor-fiifl&ivz», ^coi-&ui^enbion-Bct/e^jn^ в Польше разработана технология приготовления грязевой пасты из верховых торфов 75».
В пользу грязевых препаратов свидетельствуют их преимущества по сравнению с природной лечебной грязью: их применение почти не имеет противопоказаний, что обусловлено лёгкой их переносимоство
из-за отсутствия нагрузочного влияния на сердечно-сосудистую сис-
74 тему; грязевые препараты экономически значительно выгоднее .
С точки зрения биогеохимии применение грязевых препаратов позволит рационально использовать природные ресурсы и в меньшей степени нарушать природное равновесие, т.к. для получения грязевых препаратов потребуется в сотни - тысячи раз меньше лечебной грязи, чем при использовании её в здравницах для аппликаций. Например, из тонны Тамбуканской лечебной грязи можно получить около двух тонн фармакопейной формы грязевого препарата , в то время как ежегодно на нужды грязелечения расходуется местными здравницами и вывозится в другие города нашей страны свыше 14-ти тысяч
тонн грязи .
Вопросам изучения механизма действия лечебных грязей в целом, а также грязевых препаратов, посвящено немало исследований, но следует отметить, что механизм действия в настоящее время до конца не изучен.
В последнее время многие исследователи высказывают мнение о том, что эффект грязелечения определяется в основном химическим действием органических веществ, содержащихся в лечебных грязях "***
* . Преобладающим компонентом органических веществ лечебных
тем грязей являются гумусовые кислоты , однако они недостаточно
изучены в физико-химическом аспекте и с точки зрения биологического действия на организм, несмотря на имеющиеся литературные данные о высокой биологической активности гуминовых кислот (ГК), вы-
деленных преимущественно из почв и торфов. Химический состав гумусовых кислот иловых минеральных сульфидных и сопочных лечебных грязей современными методами исследования никем не изучался.
Широкое использование лечебных грязей для лечения больных с различными заболеваниями и недостаточный уровень знания о химическом составе и механизме действия лечебных грязей в целом, и особенно, органических веществ, в том числе гумусовых кислот, выдвигают необходимость изучения на современном уровне химического состава, физико-химических свойств и биологического действия лечебных грязей и составляющих компонентов органических веществ.
Это и явилось главной предпосылкой для проведения экспериментальных исследований в области изучения структуры и свойств гумусовых кислот пелоидов.
Цель и основные задачи исследования. Наши исследования имели целью дать научное обоснование к расширению терапевтического применения ГК на основе физико-химических и биологических исследований. Для осуществления этой цели были поставлены следующие основные задачи:
Изучить в физико-химическом аспекте гумусовые кислоты иловых минеральных сульфидных и сопочной лечебных грязей современными методами исследования.
Оценить биологическую активность ГК одной из лечебных грязей.
Решению поставленных задач посвящены исследования, составившие содержание настоящей диссертационной работы.
Научная новизна. Впервые изучены гумусовые кислоты иловых минеральных сульфидных и сопочной лечебных грязей с применением современных методов исследования и установлена принадлежность гумусовых кислот пелоидов к типичным гумусовым кислотам, аналогичным гумусовым кислотам почв, современны};: и ископаемых осадков. Разрабо-
тана спектрофотометрическая методика определения содержания ГК в лечебных грязях с использованием дифференцированных коэффициентов экстинкции. Изучена зависимость структуры и свойств гумусовых кислот иловой минеральной сульфидной лечебной грязи (Тамбуканс-кой) от глубины залежи лечебной грязи и сезона года.
Впервые установлено, что ГК Тамбуканской лечебной грязи обладают противовоспалительным действием и способностью нормализовать содержание лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови у животных при экспериментальной лейкопении.
Практическая значимость. Предложен новый лекарственный препарат для лечения заболевания крови - лейкопении, обладающий также противовоспалительной активностью. Установлено классификационное положение гумусовых кислот пелоидов в системе гумусовых кислот почв, современных и ископаемых осадков. Предложена методика определения содержания ГК в лечебных грязях с использованием дифференцированных коэффициентов экстинкции (внедрена в практику физико-химической лаборатории минеральных вод и лечебных грязей Пятигорского НИИ курортологии и физиотерапии, рационализаторское предложение № 12 от 15 июня 1982 года).
Апробация работы и публикации. Основные результаты проведённых исследований доложены на конференциях молодых учёных Пятигорского НИИ курортологии и физиотерапии (1980, 1984 гг.) , Пятигорского фармацевтического института (1981, 1982 гг.), на 3-ей республиканской научной конференции "Проблемы использования сап-ропелей в народном хозяйстве" (Минск, 1981 г.), на расширенном заседании кафедры органической химии Пятигорского фармацевтического института (1983 г.), на заседании кафедры химии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (1984 г.); опубликованы в материалах: а) зональной научно-технической конференции "Химия гумусовых кислот, их
роль в природе и перспективы использования в народном хозяйстве" (Тюмень, 1981 г.) ; б) 3-ей республиканской научной конференции "Проблемы использования сапропелей в народном хозяйстве" (Минск, 1981 г.); в) УП-го Всесоюзного семинара "Органическое вещество в современных и ископаемых осадках" (Ташкент, 1982 г.) ; г) УШ-го Всесоюзного съезда физиотерапевтов и курортологов (Сочи, 1983 г); д) 11-го Международного совещания по химии и биотехнологии биологически активных природных веществ (Будапешт, 1983 г.) ; 14-го Международного симпозиума по химии природных веществ (Познань, 1984 г., Гданьск, 1984 г.); одна статья депонирована во ВНИИМИ (март, 1983 г.); одна заявка на изобретение Сполучено положительное решение из Госкомитета по делам изобретений и открытий на новый лекарственный препарат).
Номер Государственной регистрации проблемы во ВНИИМИ центре - 81050246. УЖ 615.32:547.992.2/015.11.
Современные методы исследования гумусовых кислот и их свойства
Диаграмма атомных отношений по Ван-Кревелену позволяет сделать вывод только о суммарном итоге процесса трансформации и не раскрывает его стадий . Результаты изучения элементного состава гумусовых кислот различного происхождения свидетельствуют о присутствии в их составе углерода, водорода, азота, кислорода и в малых количествах фосфора серы 77.122,62,61,
В настоящее время многочисленными исследованиями установлено, что гумусовые кислоты различного генезиса являются высокомолекулярными и полидисперсными соединениями -"ДОЗ»"1 40,156,185 В 1963 году Мэта, Дубач и Дойель впервые показали возможность применения гель-хроматографии для характеристики молекулярно-массового состава гумусовых кислот почв. Используя метод гель-фильтрации на декстрановом геле "Сефадекс", авторы показали полидисперсность макромолекул ГК. Им удалось выделить фракции с молекулярными массами от 3000 до 100000.
Полидисперсность гумусовых кислот заставляет пользоваться средними величинами, не тождественными характеристикаи индивидуальных соединений. Гумусовые кислоты представлены смесью молекул, различающихся молекулярными массами и составом. Возможны случаи, когда: - молекулы различаются только длиной цепи (размерами); - близкие по размерам молекулы имеют переменный состав; - одновременно изменяются и размеры и состав молекулы; - однородные или неоднородные молекулы вступают во взаимодействие за счёт водородных связей или минеральных мостиков. Первые три случая связаны с истинной молекулярной полидисперсностью, последний случай характеризует образование ассоциатов, если возникают водородные связи. Ассоциаты частиц, образованные за счёт сил побочных валентностей и межмолекулярных сил, относят к надмолеку-лярным структурам (( ,
Имеющиеся сведения о размерах и форме частиц гумусовых кислот разнообразны и противоречивы, но всё же приводимые разными авторами значения молекулярных масс удаётся разделить на две группы 77: от нескольких сотен до 10000-20000 и от 20000-30000 до 100000-200000 (иногда и более высокие).
Д.С.Орловым и Е.И.Горшковой было показано, что группировки величин молекулярных масс в значительной мере связаны с методами их определения. З&гчисленные и найденные химическими методами молекулярные массы ГК лежат, как правило, в пределах 1300-13000; методы осмометрии, криоскопии, эбулиоскопии, диффузии и вискозиметрии дают величины порядка 700-26000 (для Ж нижний предел опускается до 200-300], методы ультрацзнтрифугирования и светорассеива-ния - порядка 30000-80000 58 4,168,36_ зависимость результатов измерений от применяемого метода объясняется полидисперсностыо гумусовых кислот, хотя определённое значение имеют и другие причины: агрегативная неустойчивость и зольность ГК, значение рН, ионная сила, а также неидентичность методов выделения гумусовых кислот 82 81.
Средние значения молекулярных масс ГК по данным различных методов находятся в пределах от 40 до 80 тысяч; результаты опытов по определению молекулярных масс методами седиментации и светорас 77 R? RT сеивания совпадают . Средневесовые молекулярные массы И, выделенных методом Шорсита, по данным гель-фильтрации лежат, как правило, в пределах 5000-12000 . Современная наука располагает большим набором методов определения молекулярных масс, пригодных для соединений различных классов, несмотря на это, вопрос о молекулярных массах гумусовых кислот до конца не решён, что вызвано не столько техническими трудностями, сколько особенностями этих веществ,, Наиболее значительную роль при этом играют полидисперсность гумусовых кислот, склонность к образованию ассоциатов, ограниченная растворимость, переменный состав и очень сильная окраска гумусовых кислот . Для определения молекулярных масс и размеров молекул гумусовых кислот одним из наиболее перспективных является метод гель-хроматографии, оказавшийся информативным при изучении закономерностей изменения состава и свойств гумусовых кислот в конкретных биогеохимических ситуациях, однако этот метод требует методических доработок, касающихся подготовки вытяжек к гель-фильтрации, включая время и условия хранения, состава фонового растворителя, регламентирования приёмов гель-фильтрации и контроля за характером элюирования (выбор элюента, калибровка гелей, взаимодействие вещества с матрицей геля и пр.) и т.д. -т Для изучения структуры гумусовых кислот широко используются методы гидролиза. Независимо от типа почв и методов гидролиза в гумусовых кислотах найдены пентозы.» метилпентозы, гексозы, амино-сахара, аминоспирты и уроновые кислоты " Д Д52Д4,1о5. в гвд_ ролизатах ГК сапропелей обнаружены моносахариды: глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, рибоза, причём глюкоза определяется в наибольшем количестве . В гидролизатах ГК почв,сапропелей и дру-гих биогеохимических объектов найдены также аминокислоты = = Методами кислотного и щелочного гидролиза удалось выделить и идентифицировать почти все компоненты, входящие в состав периферической части ГК, Это, главным образом, аминокислоты и углево 19 ды , и хотя характер их сочленения и происхождения остаются недос 79 таточно ясными, Д.С.Орлов считает , что баланс структурных фрагментов периферической части IK подведён почти полностью, а в составе фрагментов так называемой "ядерной" части ГК остаётся ещё много пробелов, что отчасти вызвано несовершенством методов деструкции гумусовых кислот. Метод перманганатного окисления вызывает глубокое разрушение гумусовых кислот, в результате чего из поля зрения исследователя выпадает часть структурных фрагментов . О.Б.Максимов и также обращает внимание на то, что окисление перманганатом калия в щелочной среде достаточно жёсткий метод, вызывающий разрушение алифатических и метоксиароматических структур, а образующиеся при окислении алифатические и бензолполикарбоноше кислоты , рассматриваются как "эхо" или "отпечатки пальцев" исходной структуры, но не как структурные единицы.
Несмотря на эти недостатки, метод перманганатного окисления в щелочной среде широко используется для изучения природы гумусовых кислот, их строения. При использовании в качестве окислителя щелочного раствора перманганата калия алифатические боковые цепи ароматических соединений окисляются до карбоксильной группы и образуются соответствующие карбоновые кислоты, причём многократно замещённые ароматические кольца окисляются в таких условиях до бензоллоликарбоновых кислот, а конденсированные соединения с пиридиновыми и пиримидиновыми гетероциклами образуют в основном пири-дин- и гшримидинкарбоновые кислоты ,
Методы выделения, очистки и количественного определения
Пробы лечебной грязи вулкана Бабазанан были отобраны также осенью (в сентябре) в кратерах грязевого вулкана Бабазанан с глубины 0,4-0,5 м. В кратере вулкана находится небольшое озеро (100 х 50 м), в нём постоянно бурлит в нескольких точках грязевой раствор под действием выделяющихся из недр земли газов вместе со свежей жидкой грязью. Результаты физико-химических исследований лечебной грязи вулкана Бабазанан представлены также в таблице 2.1., из которой следует, что по физико-химическим показателям лечебная грязь вулкана Бабазанан отвечает техническим требованиям, предъявляемым к высокоминерализованным слабосульфидным сопочным лечебным грязям х.
Из таблицы 2.1. следует, что по содержанию органических веществ, в том числе ГК и ФК, иловые минеральные сульфидные грязи близки, а в сопочной грязи значительно меньше содержание органического углерода (0,39%), а также ГК (0,12%) и ФК ( ОДОЗб).
Исследования физико-химических свойств пелоидов проводились в основном по схеме и методикам, описанным в методическом руководстве В.Й.Бахман и др. . Сопочная грязь вулкана Бабазанан использована для физико-химических исследований после естественного отстоя (отделения грязевого раствора).
В методическом руководстве по исследованию пелоидов описана методика выделения и определения содержания ГК, которая предусматривает в процессе выделения неоднократный нагрев раствора, содержащего гумусовые кислоты, до кипения, что, конечно, недопустимо в связи с денатурацией гумусовых кислот при нагревании, что исключает в дальнейшем проведение тонких структурных исследований.
Учитывая это, мы выделяли гумусовые кислоты из пелоидов по методике, описанной Д.С.Орловым и др. ь для почвенных гумусовых кислот, которая исключает нагрев в процессе выделения гумусовых кислот. Сущность метода заключается в декальцировании лечебной грязи разбавленными кислотами, экстракции разбавленными растворами щелочей гумусовых кислот и разделении гумусовых кислот путём подкисления щелочного раствора до рН 1-2.
Б ёмкость, вместимостью 20 л, помещали 5-6 кг сырой грязи, которую заливали 0,1 н. раствором НСІ почти до полного объёма стеклянной ёмкости, грязь хорошо перемешивали. При этом наблюдалось сильное вспенивание в результате разрушения карбонатов, гидрокарбонатов, сульфидов, гидросульфидов и выделения COg, Hg, особенно для Тамбуканской грязи (содержание карбонатов в грязевом растворе около 0,20 г/л, гидрокарбонатов - около I г/л; данные по содержанию гидросульфидов в пелоидах см. табл. 2.I.). Несколько в меньшей степени вспенивание наблюдалось для Чокракской грязи (содержание гидрокарбонатов составляет 2,26 г/л, карбонаты не обнаружены) и совсем незначительной вспенивание - для сопочной грязи вулкана Ба-базанан (содержание гидрокарбонатов -0,09 г/л). Затем оставляли смесь на 10-12 часов для отстаивания, после чего жидкость декантировали и снова заливали ОД н, раствором НИ, хорошо перемешивали и оставляли для отстаивания. Так продолжали до тех пор, пока проба на Са + (с оксалатом аммония) и проба на железо для иловых грязей (с-роданидом аммония)становилась отрицательной. После этого грязь промывали 3-4 раза дистиллированной водой до нейтральной реакции и экстрагировали гумусовые кислоты ОД н. раствором Л"аОН. Для этого заливали отмытую дистиллированной водой грязь указанным раствором щёлочи, плотно закрывали ёмкость и давали настаиваться в течение 10-12 часов (для сопочной грязи было принято более длительное настаивание в связи с низким содерка-нием гумусовых кислот). Щелочной раствор гумусовых кислот декантировали, остаток снова заливали щёлочью; экстракцию продолжали до тех пор, пока не прекращалась экстракция гумусовых кислот. Экстракты собирали вместе в одну стеклянную ёмкость, которую плотно закрывали и давали время для отстаивания (происходило постепенное оседание минеральных коллоидов, о чём судили по прозрачности щелочного раствора и образующемуся светло-серому осадку минеральных коллоидов). Затем щелочной раствор декантировали в другую ёмкость и подкисляли раствор до рН-1-2; происходило постепенное отделение ГК в виде хлопъе видного осадка тёмно-коричневого цвета от ЗК, остающихся в растворе, окрашенном в слабо-жёлтый цвет.
Кислый фильтрат после отделения ГК пропускали через активированный уголь АГ-3 (концентрирование ggj по методу Форсита ,оо Снятие Ш с угля проводилось по методике А.А.Юхнина и Д.С.Орлова . Были выделены щелочные (2Кщ) и ацетоновые (Ша.) фракции Ж. Щелочные растворы Щ нейтрализовали (до рН=7), упаривали, фильтровали, диализовади и сушили при температуре 30-40С. Сухие образцы Ш растирали в ступке до порошкообразного состояния и хранили в бюксах.
Выделенные гумусовые кислоты имели высокую зольность (около 7($ и даже выше). Очистку ГК проводили путём неоднократного пе-реосаждения (3-4 раза) и центрифугирования при 6000 об/мин, а затем - электродиализа. Очищенные ГК сушили при температуре в пределах 50-60С, сухие образцы ГК также, как и Ж, растирали в ступке до порошкообразного состояния и помещали в стеклянные бюксы. Перед проведением физико-химических исследований гумусовые кислоты дополнительно сушили в вакууме {Ш при температуре 30-40С, ГК - при температуре 50С в течение 3-4 часов), после чего определяли зольность, которая для гумусовых кислот после очистки находилась в интервале от 2 до 15%. Всего было выделено 36 образцов гумусовых кислот, в том числе 12 ГК и 24 Ш (12 Шщ и 12 Ка). Методика определения содержания ГК по Бахман очень длительная (3 недели) и включает весовое окончание, что ведёт к большой погрешности метода.
Функциональные группы и пороги агрегации
Данные по анализу ИК-спектров исходных ГК и остатков после гидролиза 2%-ной и б н. HGI свидетельствуют о значительном вкладе гидролизуемьк структур в построение макромолекул ГК пелойдов. При гидролизе отщепляется значительная часть структурных единиц по эфирным и пептидным связям, что ведёт к повышению интенсивности полос, характерных для СООН-групп, причём при более жёстком гидролизе происходит более полное отщепление. Исчезновение полосы 1650 см после жёсткого гидролиза также свидетельствует об отщеплении периферической части макромолекул ГК.
Б последнее время для изучения структуры гумусовых кислот различного происхождения получил применение метод ревдтен-дифрак-тометрии, который даёт определённую информацию о степени упорядоченности строения данного класса органических соединений, о соотношении периферических алифатических и ароматических частей в построении макромолекул гумусовых кислот.
Для сравнительной характеристики ГК различных типов лечебных грязей в наших исследованиях был применён данный метод, Рентген-дифрактограммы ГК пелойдов представлены на рисунке 4.10. На рентген-дифрактограммах ГК пелойдов присутствуют максимумы-гало с вершинами 4,2 А (для ГК Тамбуканской грязи), 4,2-4,4 А Гдля ГК Чокракской грязи) и 4,4 А (для ГК вулкана Бабазанан), а также максимумы с вершинами 3,4 А, характерные для упорядоченно расположенных ароматических структур.
Максимумы на рентген-дифрактограммах ГК пелойдов имеют вид широких расплывчатых гало, которые сложены частными максимумами. Характер дифузного гало может свидетельствовать либо о сложности молекулы ГК, в состав которой входит большое число различных составляющих, относительно упорядоченно расположенных и дающих серию максимумов в области центрального гало, либо о том, что препараты представлены сложной смесью веществ.
При сравнении рентген-дифрактограмм ГК пелоидов видно, что рентген-дифрактограммы ГК вулкана Бабазанан и ГК Чокракской грязи сходны, в то время как рентген-дифрактограмма ГК Тамбуканской грязи отличается меньшей интенсивностью максимума-гал о. Максимум-гало ГК вулкана Бабазанан более интенсивный (высокий) и узкий, что указывает на большую упорядоченность фрагментов молекул в строении макромолекул ГК сопочной грязи. Высокие и узкие максимумы говорят о более однородном характере их цепочечных алифатических структур, о возможности вследствие этого большей упорядоченности во взаимном расположении цепей.
Характер максимума с вершиной 3,4А и малая интенсивность этого сигнала указывают на то, что ароматические структуры присутствуют и составляют меньшую долю в составе макромолекул ГК по сравнению с алифатическими структурами, а многочисленные алифатические структуры мешают им упорядоченно располагаться. Таким образом, результаты изучения рентген-дифрактограмм ГК пелоидов указывают на отсутствие кристаллического строения, на сходство в строении ГК различных пелоидов, на присутствие в их структуре как ароматических, так и алифатических компонентов, а также на относительно большую упорядоченность алифатических структур в макромолекулах ГК вулкана Бабазанан. Наибольшая разветвлённость и разнородность алифатической части характерна ГК Тамбуканской грязи по сравнению с ГК Чокракской и вулканической грязей, что подтверждается данными элементного анализа, гель-хроматографии, результатами кислотного гидролиза и определения степени ароматичности ГК пелоидов. Электронная микроскопия - практически единственный метод с помощью которого можно непосредственно наблюдать размеры и конфигурацию частиц гумусовых кислот. Дня сравнительного изучения гумусовых кислот различного происхождения применяется преимущественно электронная растровая микроскопия, которая даёт определённую информацию в дополнение к знаниям о структуре и свойствах гумусовых кислот, полученных различными физико-химическими методами. Электронно-микроскопическая картина ГК пелоидов существенно зависит от увеличения (рис. 4.II., 4.12. и 4.13.). При изучении ГК Тамбуканской грязи с увеличением в 100 раз (см. рис. 4.II., а) видны отдельные частицы ГК с острыми поверхностями сколов, гладкой однородной поверхностью сверху. При увеличении изображения угла скола частицы ГК в 1000 раз (см. рис 4.П., б) видна слоистая упаковка агрегатов молекул ГК. Увеличение в 3000 и 10000 раз (см. рис. 4.II., в, г) ещё более чётко показывает характерную для ассоциатов молекул ГК Тамбуканской грязи слоистость. На другом участке частицы при увеличении в 100 раз и выше (см. рис. 4.II., д, е, ж, з) хорошо видна неравномерность стяжения ассоциатов при высыхании (волнистая ребристость}. При увеличении в 1000 раз (см. рис. 4Л1.9е) для ГК Тамбуканской грязи начинает просматриваться так называемая "чешуйчатость" упаковки ассоциатов макромолекул ГК, которая хорошо видна при увеличении в 10000 раз (см. рис. 4.II.» з}.
Влияние гуминовых кислот на гематологические показатели у животных при экспериментальной лейкопении
До введения дийодбензотэфа содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула крови у всех кроликов были в норме (табл. 5.2.) . После окончания введения дийодбензотэфа содержание лейкоцитов в крови у кроликов снизилось на 55% по отношению к исходному (от 8890 + 60 до 4070 + 70, Р 0,0001, см. табл. 5.2.), т.е. развилась лейкопения. Отмечены следующие изменения лейкоцитарной формулы крови: содержание сегментоядерных нейтрофилов повысилось с 24 до 48% (Р 0,0001), моноцитов - с 2 до 4% (P 0,000lj , количество лимфоцитов и эозинофилов снизилось на 38% (Р 0,0001).
Исследованиями установлено, что уже через 7 дней после начала перорального введения ГК в дозе 20 мг/кг отмечалось повышение содержания в нрови лейкоцитов на 72% (Р 0,01), через 14 дней -на 48% (Р 0,0001), через 21 день -- на 79% (Р - 0,0001) по сравнению с контролем (см. табл. 5.2.) . Через 21 день содержание в крови лейкоцитов нормализовалось.
При пероральном введении ГК в дозе 50 мг/кг через семь дней наблюдалось повышение содержания в крови лейкоцитов на 24% (Р- 0,05), через 14 дней - на 46% (Р 0,0001), через 21 день - на 76% (Р 0,0001) по отношению к контролю (см. табл. 5.2.). Через 21 день содержание в крови лейкоцитов нормализовалось.
Изучение лейкоцитарной фораулн крови показало, что под влиянием введения ГК в основном изменялось содержание сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов. Через 7 дней перорального введения ГК в дозе 20 мг/кг отмечалось снижение содержания сегментоядерных нейтрофилов на 29% (Р 0,0001), через 14 дней - на 24% (? 0,05), через 21 день - на 40% (Р -0,0001) и повышение количества лимфоцитов, соответственно на 31%, 33% и 49% (P 0,000l) по сравнению с контролем (см. табл. 5.2.). При пероральном введении ГК в дозе 50 мг/кр установлено снижение содержания сегаентоядер-ных нейтрофилов через семь дней на 31# (Р 0,0001), через 14 дней - на 35# (Р 0,0001), через 21 день - на 33?« (? 0,01). Повышение содержания лимфоцитов через 7 дней на 36# (Р 0,0001), через 14 дней - на 47# (? 0,0001), через 21 день - на 4С# (Р 0,0001) . В целом, лейкоцитарная формула крови к концу опыта ("через 21 день) приблизилась к исходной (к норме). Содержание гемоглобина, эритроцитов, СОЭ, изменялось в основном в пределах нормы в процессе данных исследований.
Таким образом, полученные результаты эксперимента свидетельствуют о выраженной способности ГК Тамбуканской грязи нормализовать содержание лейкоцитов в крови (устранять лейкопению) и лейкоцитарную формулу крови. Эффективные дозы - 20-50 мг/кг. 1. Установлено сходство и различие структуры и свойств гумусовых кислот различных типов лечебных грязей и их классификационное положение в системе гумусовых кислот почв, современных и ископаемых осадков. При общем подобии показана специфичность состава и свойств гумусовых кислот в зависимости от конкретной биогеохимической ситуации условий их формирования (грязеобразующие породы, геоботанический фактор, микробиологический фактор, сезонность, глубина залегания и др.) . 2. Впервые получены комплексные физико-химические структурные параметры выделенного класса соединений - гумусовых кислот пе-лоидов (степень полидисперсности, молекулярные массы, парамагнитные свойства, характер рентген-дифрактограмм и термограмм, спектры поглощения в УФ-, видимой и ИК-областях, значения коэффициентов экстинкции, порога агрегации, функциональные группы, выход бензол-поликарбоновых кислот, определённый аминокислотный и углеводный состав легкогидролизуемых частей гумусовых кислот). 3. Гумусовые кислоты пелоидов являются высокомолекулярными и полидисперсными соединениями. Диапазон средних молекулярных масс ГК составляет 40-65 тысяч. ІК пелоидов более полидисперсны (2-8 фракций чем ШІ (2 фракции). 4. Молекулярная структура ГК пелоидов характеризуется присутствием ароматических и алифатических компонентов. Высокие атомные отношения Н:С, низкие коэффициенты экстинкции, слабовыражен-ные полосы С=С связей ароматических колец в Щ-спектрах, характер рентген-дифрактограмм и термограмм, содержание функциональных групп, результаты кислотного гидролиза и щелочного окисления позволяют считать, что в структуре ГК пелоидов, особенно, в ГК Там-буканской грязи, преобладают алифатические цепочечные фрагменты, несущие углевод-белковые комплексы, а ароматические фрагменты выражены слабо.
![Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения [Электронный ресурс]](/i/i/4460/187655.png "Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения [Электронный ресурс] Зверева Елена Юрьевна")
