Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение липидов является актуальным направлением современной биохимии. Липиды обеспечивают жизнедеятельность клеток любой организации живого: от прокариот до многоклеточных эукариотических организмов. Липиды играют жизненно важную роль как источник энергии и как структурные компоненты клеточных мембран (Bishop, 1976). Важной структурной и функциональной составляющей молекулы любого класса липидов являются ЖК .
Особый интерес представляют ЖК морских организмов, многие из которых богаты ПНЖК, которые необходимы для поддержания жидкостности клеточных мембран, они участвуют в адаптации организма к окружающей среде, являются эссенциальными факторами пищи животных и человека, обладают разнообразной биологической активностью. Большинство беспозвоночных не способны синтезировать длинноцепочечные ПНЖК и получают их через диетарные источники, обеспечивая свои потребности в этих эссенциальных компонентах для поддержания нормальной биохимической и физиологической функции (Watanabe et al, 1983). С такими представителями ПНЖК n-З, как эйкозапентаеновая и докозогексаеновая кислоты, связывают высокую биологическую активность морских липидов и их благотворное влияние на здоровье человека (Dyerberg, 1986; Tapiero et al., 2002).
В результате многолетних исследований накоплен обширный материал по липидам и жирным кислотам морских беспозвоночных (Joseph, 1982; Ackman, 1983; Thiel et al., 2002). Однако некоторые таксоны до сих пор слабо изучены, другие остаются без внимания. Работы по исследованию биосинтеза жирных кислот и путей их метаболизма в морских беспозвоночных единичны (Moreno et al., 1979; Morales Litchfield, 1977). Кроме этого, согласно современному методу идентификации бактерий, основанному на полифазной таксономии, оценка ФЛ и ЖК, отражающих филогенетические связи, как хемотаксономических характеристик является важной задачей. Поэтому изучение ЖК различных групп морских организмов до сих пор остается актуальной и важной проблемой. Это обусловлено тем, что достаточно полно понять закономерности распределения ЖК можно лишь, располагая обширной информацией и заполнив пробелы в знаниях по липидной биохимии отдельных групп, уделив особое внимание установлению структур молекул, путей биосинтеза и происхождения ЖК в морских организмах.
Сокращения, используемые в работе: ЖК - жирные кислоты, ФЛ - фосфолипиды, ГЛ -гликолипиды, СД - симбиотические динофлагелляты, ФАР - фотосинтетически-активная радиация, ТАГ - триацилглицерины, ПНЖК - полиненасыщенные ЖК, СДЖК - сверхдлин-ноцепочечные ЖК, НМР - неметиленразделенные ЖК, СЖК - свободные жирные кислоты, ФЛЖК - жирные кислоты фосфолипидов, МЭЖК - метиловые эфиры ЖК.
Развитие современных методов анализа ЖК, таких как капиллярная ГЖХ и ГЖХ в сочетании с масс-спектрометрией, дает широкие перспективы получения достоверной информации, что поможет выявить ряд особенностей распределения и структур этих компонентов, а также сравнить с известными в литературе данными.
Современное направление в биохимии липидов - использование ЖК как биохимических маркеров для решения важнейших вопросов трофической экологии, связанных с анализом источников и путей трансформации органического вещества в морских экосистемах (Sargent et al., 1987; Dalsgaard et al., 2003). Сложность трофических связей в морских экосистемах привела к поиску новых эффективных методов исследования. Для детального изучения пищевых взаимоотношений между организмами может служить метод биохимических маркеров, в качестве которых используются ЖК. Этот подход основан на специфичности состава ЖК микроорганизмов и водорослей, которые служат пищей для животных, и на ограниченной способности животных синтезировать ЖК, значительную часть которых животные получают из потребляемой пищи. Это позволяет рассматривать ЖК в качестве биохимических маркеров как весьма эффективный и перспективный инструмент для определения пищевого спектра и разнообразия источников пищи для морских организмов и для исследования пищевых цепей в морских экосистемах.
Для изучения трофических связей в морских экосистемах большое значение имеет знание особенностей состава ЖК микроводорослей и бактерий, которые являются первичными источниками пищи для морских беспозвоночных, а также выявление специфических компонентов, которые могут служить биомаркерами в таких исследованиях. Поскольку сведения о ЖК микроорганизмов доступны для ограниченного числа видов, информация для большего числа видов весьма желательна и полезна для установления характерных особенностей этих организмов.
Цель и задачи исследования. Цель работы - определение закономерностей распределения, химической структуры и путей биосинтеза жирных кислот в морских организмах, а также оценка роли жирных кислот как биомаркеров в трофических исследованиях. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Исследовать состав липидов и жирных кислот морских организмов из различных таксонов, включая бактерии, простейшие, водоросли и беспозвоночные, используя современные методы анализа.
Определить влияние эндогенных и внешних факторов (среды) на состав и распределение липидов и жирных кислот в морских микроводорослях.
Установить химическое строение ряда неидентифицированных и новых жирных кислот.
Совершенствовать технику анализа меченных жирных кислот, которая позволит изучать пути их биосинтеза.
Определить способности ряда морских организмов синтезировать ЖК из меченых предшественников.
Охарактеризовать состав жирных кислот морских беспозвоночных, имеющих симбио-тические микроорганизмы.
Исследовать состав жирных кислот ряда брюхоногих и двустворчатых моллюсков, усо-ногих раков (баланусов) и полихет для определения их пищевых спектров и трофических взаимоотношений в отдельных сообществах.
Определить пищевые источники в экосистеме мелководной гидротемы б. Кратерной (о. Янкич, Курильские острова), используя потенциал жирных кислот как биомаркеров.
Положения, выносимые на защиту:
-
Распределение жирных кислот в морских микроорганизмах - бактериях и микроводорослях, отражает их систематическое положение. Жирные кислоты микроорганизмов имеют хемотаксономическое значение.
-
Гетеротрофные простейшие, составляющие первые звенья детритной пищевой цепи, способны продуцировать эссенциальные полиненасыщенные жирные кислоты и могут их источником в морских экосистемах.
-
Специфичность состава жирных кислот микроорганизмов позволяет оценить их вклад в симбиотические сообщества с морскими беспозвоночными.
-
Морские моллюски способны синтезировать неметил енр аз деленные жирные кислоты.
-
Состав жирных кислот морских беспозвоночных хотя и зависит от собственных биосинтетических способностей, но в значительной степени определяется характером потребленной пищи. Жирные кислоты беспозвоночных служат трофическими маркерами.
Научная новизна работы. Получены данные о распределение ЖК в липидах около 200 видов морских организмов, включая бактерии, простейшие, водоросли, а также представителей губок, кишечнополостных, моллюсков, иглокожих, ракообразных, полихет. Выявлены закономерности распределения ЖК в морских организмах.
Установлена связь состава жирных кислот с систематическим положением бактерий и микроводорослей. Получены новые данные по составу ФЛ и ЖК для ряда таксонов бактерий, которые были использованы для идентификации 4 новых родов и 39 новых видов морских протеобактерий. Эти хемотаксономические характеристики позволяют идентифицировать бактерии на уровне рода, а в некоторых случаях до вида. Найдено, что состав ФЛ и ЖК бактерий является отражением филогенетического положения исследованных организмов, а в ряде случаев и экофизиологического разнообразия штаммов. Выявлены таксономические
различия в составе ЖК микроводорослей на уровне отделов. Редкие кислоты, группы обычных кислот или соотношение кислот могут служить полезными биохимическими индикаторами микроводорослей в экологических исследования.
Изучено влияние ряда факторов (жизненный цикл и интенсивность освещения) на ли-пиды и ЖК микроводорослей. Установлено, что, несмотря на вариабельность состава липид-ных компонентов, черты, характерные для отдельных отделов, сохраняются.
На основе экспериментальных данных впервые показана способность простейших, составляющих первые звенья детритной пищевой цепи, продуцировать разнообразные эс-сенциальных ПНЖК, включая арахидоновую, ЭПК и ДГК. Таким образом, доказано, что Protozoa наряду с микроводорослями являются источником ПНЖК в морских экосистемах.
Установлена структура ряда ЖК из водорослей, губок и моллюсков. Впервые описана нечетная кислота 21:2А7,15 в голожаберных моллюсках. Впервые доказана способность моллюсков синтезировать НМР ЖК de novo, установлены пути биосинтеза этих компонентов.
Установлено, что по составу ЖК беспозвоночных можно определить присутствие симбиотических микроорганизмов в тканях животных. Определены специфические ЖК маркеры, позволяющие идентифицировать различные группы симбиотических микроорганизмов (хемоавтотрофные бактерии, симбиотические динофлагелляты - зооксантеллы, зеленые микроводоросли, цианобактерии) в клетках хозяина (моллюсков, кораллов и губок).
Экспериментально подтверждена способность ЖК передаваться по пищевым цепям и служить биомаркерами в трофических исследованиях. Определены пищевые источники для ряда морских бентосных беспозвоночных и трофические связи в сообществах и мелководной гидротермальной экосистеме.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные по распределению липидов и ЖК в различных видах бактерий, водорослей и беспозвоночных. Эти данные полезны для решения вопросов филогении, эволюции и экологии морских организмов. В виду сильного фенотипического сходства морских аэробных гетеротрофов, разработка перспективных хемотаксономических маркеров, полезна для быстрой и точной идентификации, по крайней мере, на уровне рода для изолятов из окружающей среды, особенно, в экологических исследованиях. Получены данные об эффективной продукции эссенциальных ЖК, таких как ЭПК и АК, микроводорослями, простейшими и некоторыми видами бактерий, что открывает перспективы использования этих микроорганизмов как источника биологически активных веществ.
Разработка метода биохимических маркеров - жирных кислот может внести вклад в решение ряда проблем трофической экологии и понимание трофических структур морских экосистем. Получена важная характеристика пищевого спектра промыслового и культиви-
руемого моллюска приморского гребешка, обитающего на разных типах донных осадках. Показано негативное влияние симбиотической полихеты на развитие моллюска. Эти данные могут быть полезны для марикультуры этого вида.
Разработанный метод анализа метиловых эфиров жирных кислот обеспечивает эффективное разделение, высокую чувствительность и недеструктивное обнаружение, что позволяет использовать метод для анализа меченых радиоактивными изотопами ЖК.
Апробация работы. Результаты работы были представлены автором на Всероссийском симпозиуме «Полиненасыщенные жирные кислоты п-6 и п-3 семейств: медико-биологические, биохимические и биотехнологические аспекты» (Владивосток, 1995), международных конференциях PICES (Владивосток, 1995, 1999, 2005гг.), международном совещании International Workshop on the Global Change Studies in the Far East (Владивосток, 2002), международной конференции «Мосты науки между Северной Америкой и ДВ России. Прошлое, настоящее и будущее» (Владивосток, 2004), международной конференции Mollusks of the Northeastern Asia and Northern Pacific: biodiversity, ecology, biogeography and faunal history (Владивосток, 2004), третьей международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008), международной конференции Marine biodiversity and bioresources of the North-Eastern Asia. (Чеджу, Ю. Корея, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 статьи в отечественных и международных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав с изложением результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 358 источников. Диссертация изложена на 274 стр. машинописного текста, содержит 42 рисунка и 44 таблицы.
