Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. ДИКАРБОНОВЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ И ГАММА-АМИНОМАСЛЯНАЯ КИС
ЛОТА В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ....... 16
Содержание дикарбоновых аминокислот и ГАЖ в мозге 16
Ферментные системы обмена дикарбоновых аминокислот
и ГАЖ . . . . 20
1.3. Дикарбоновые аминокислоты и ГАЖ как энергетические
субстраты мозга 25
1Л. ГК и ЦТК мозга 27
1.5. Закономерности поступления,хранения и выделения ди
карбоновых аминокислот как нейромедиаторов в суб
клеточных структурах мозга . 30
I.&w. ГАЖ как тормозной нейромедиатор 33
2. ДИКАРБОНОВЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ И ГАЖ В РАЗНЫХ ОТДЕЛАХ
M03JTA "В ОНТОГЕНЕЗЕ 40
2.1. Возрастные изменения активности ферментных систем
Обмена дикарбоновых аминокислот и ГАЖ 50
2.; Нейромедиаторная функция дикарбоновых аминокислот
У и ГАЖ в развивающемся мозге. 60
3. РОЛЬ СВЕТОВОЙ ИМПУЛЬСАЦИИ В ОБМЕНЕ СВОБОДНЫХ АМИНО
КИСЛОТ И БЕЛКОВ В РАЗНЫХ ОТДЕЛАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА
В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ 63
Морфо-функциональные перестройки в структурах мозга животных при зрительной депривации 64-.
Энергетические процессы в мозге животных при зрительной депривации 67
3.S. Белки и их обмен в зрительной системе мозга живот
ных при зрительной депривации 70
3.4. Компоненты нейромедиаторных и модуляторных циклов
обменных процессов в мозге животных в условиях ран
него выключения световой импульсации 75
3.5. Компоненты системы ГК в зрительном анализаторе моз
га при ранней световой депривации 79
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 85
Подопытные животные и исследуемые структуры мозга 85
Биохимические методы 93
Субклеточное фракционирование ткани мозга .... 93
Определение содержания дикарбоновых аминокислот и ГАМК в ткани мозга методом высоковольтного электрофореза на бумаге ..... 97
Определение активности ГДК-азы и ГАЖ-Т-азы ... 100
Статистическая обработка результатов исследований 107
5. ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СОДЕРЖАНИИ БЕЛКА, ДИКАРБОНОВЫХ
АМИНОКИСЛОТ И ГАМК, А ТАКЖЕ АКТИВНОСТИ ГДК-АЗЫ И ГАМК-Т-
АЗЫ В СТРУКТУРАХ ЗРИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗАТОРА МОЗГА СОБАК
В ПЕРИОД ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА 108
Возрастная динамика содержания белка в структурах зрительного анализатора мозга собак в постнатальном онтогенезе 108
Возрастная динамика содержания свободных дикарбоновых аминокислот и ГАМК в структурах зрительного анализатора мозга собак в постнатальном онтогенезе . . 114
Гпутаминовая кислота 114
Аспарагиновая кислота 123
Гамма-аминомасляная кислота 134
5.3. Возрастные изменения активности ГДК-азы в структу
рах зрительного анализатора мозга собак в период
постнатального онтогенеза 149
Общая и удельная активность 149
Активность ГДК-азы в исходной митохондриальной фракции и ее субфракциях 156
5.3.2.1. Активность ГДК-азы в субфракциях исходной мито
хондриальной фракции 160
Соотношения между активностью ГДК-азы и содержанием ГК, АсК и ГАМК . 162
Характеристика ГДК-азы по интенсивности образования продуктов ее реакции 166
Влияние П-5-Ф на активность ГДК-азы 177
Влияние П-5-Ф на интенсивность ГДК-азной реакции, определяемой по содержанию ее продуктов 181
5.4. Возрастные изменения активности ГАМК-Т-азы в структу
рах зрительного анализатора мозга собак в постнаталь-
ном онтогенезе 189
Общая и удельная активность 189
Соотношения между активностью ГАЖ-Т-азы и содержанием ГК, АсК и ГАМК 196
Характеристика ГАЖ-Т-азной реакции по интенсивности образования ее продуктов 199
Активность ГАМК-Т-азы в исходной митохондриальной фракции и интенсивность образования продуктов
ее реакции 206
5.5. Соотношения между компонентами системы ГК в структурах
зрительного анализатора мозга собак в постнатальном
онтогенезе 215
Метаболический фонд компонентов системы ПС . . . 215
Соотношение активностей ГАЖ-Т-а8ы и ГДК-азы . . 223
Характеристика ГАМК-Т-азы и ГДК-азы по продуктам
их реакций 226
6. ВЛИЯНИЕ РАННЕЙ ЗРИТЕЛЬНОЙ ДЕПРИВАЦЙИ НА ВОЗРАСТНОЕ
ФОРМИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ ГК В ЗРИТЕЛЬНОМ АНАЛИЗАТОРЕ И
РАЗНЫХ ОБЛАСТЯХ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА СОБАК В ПОСТНА
ТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ 235
6.1. Влияние ранней зрительной депривации на содержание
белка, дикарбоновых аминшкислот и ГАМК в зритель
ном анализаторе и разных областях коры головного
мозга собак в постнатальном онтогенезе ...... 235
6.2. Влияние ранней зрительной депривации на активность
ГДК-азы в зрительном анализаторе и разных областях
коры головного мозга собак в постнатальном онтогенезе 245
Влияние ранней зрительной депривации на активность ГДК-азы 245
Влияние П-5-Ф на активность ГДК-азы в условиях зрительной депривации собак 253
ГДК-аза и продукты ее реакции /ГАМК и АсК/ в условиях зрительной депривации 257
Влияние П-5-Ф на интенсивность образования ГАМК и АсК в ГДК-азной реакции в условиях зрительной депривации , 266
Влияние ранней зрительной депривации на активность ГДК-азы в субфракциях исходной митохондриальной фракции структур зрительного анализатора мозга собак 279
Влияние ранней зрительной депривации на активность
ГАМК-Т-азы в структурах зрительного анализатора моз
га собак 283
6.4.1. Взаимоотношение ГАМК-Т-азы и продуктов ее реакции
в условиях зрительной депривации 292
Влияние ранней зрительной депривации на активность ГАЖ-Т-азы в исходной митохондриальной фракции структур зрительного анализатора мозга собак 305
Характеристика системы ГК в зрительном анализаторе и разных областях коры головного мозга собак при зрительной депривации 308
Соотношение между содержанием дикарбоновых аминокислот и ГАМК в исследовавшихся образованиях мозга контрольных и зрительно-депривированных собак 308
Соотношения между активностью ГДК-азы и ГАЖ-Т-азы при зрительной депривации 311
Соотношения между содержанием ГК, АсК и ГАМК и активностью ГДК-азы у контрольных и подопытных
собак 313
6.6.4. Соотношения между содержанием ГК, АсК и ГАМК и
активностью ГАМК-Т-азы у собак при зрительной
депривации 315
6.6.5. Особенности активности ГДК-азы и ГАЖ-Т-азы у
собак при зрительной депривации 318
6.6.6. Особенности активности ГДК-азы и ГАЖ-Т-азы в
исходной митохондриальной фракции при зрительной
депривации 321
6.6.7. Характеристика ГДК-азы и ГАЖ-Т-азы по продуктам
их реакций при ранней зрительной депривации . . . 325
ОБСУЖДЕНИЕ 337
ВЫВОДЫ 385
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 392
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на большие успехи в изучении деятельности мозга человека и животных, до настоящего времени тонкие механизмы этой деятельности остаются непознанными. Прогрессивной в решении этой важнейшей проблемы является общая теория, построенная на материалах исследования функции, структуры и биохимизма мозга, полученных с применением эволюционных принципов великих отечественных физиологов - й.П.Павпова, И.М.Сеченова, Л.А.Орбели, их учеников и последователей.
Познание закономерностей обменных процессов в нервной ткани - необходимый шаг для установления биохимических основ формирования и проявления функций мозга, что и представляет одну из актуальных проблем функциональной нейрохимии.
В исследованиях коллективов отечественных нейрохимиков, созданных А.В.Палладиным, Е.М.Крепоом, Г.Х.Бунятяном, П.А.Кометиани и др., а также ряда зарубежных нейрохимиков в последние десятилетия получена довольно обширная информация об основных закономерностях течения различных обменных процессов в мозге в норме и в условиях патологии.
В сложном комплексе биохимических процессов, составляющих единый обмен веществ в мозге, особое внимание нейрохимиков в настоящее время привлекают процессы, связанные с нейромедиаторны-ми функциями биологически активных веществ. Исследования такого рода необходимы, поскольку передача и восприятие информации из внешней и внутренней среды в процессе нервной деятельности происходят в подавляющей массе синапсов ЦНС при участии передатчиков - нейромедиаторов. Эта проблема тесно связана и с проблемой модуляторной функции биологически активных веществ, обеспечиваю-
щей протекание мембранных и других процессов, необходимых для проведения и восприятия нервных импульсов.
В настоящее время с большим или меньшим основанием к нейро-медиаторам относят кроме ацетилхолина, катехоламинов, индолами-нов и других веществ ряд аминокислот - ГК, АсК, глицин, таурин, продукт декарбоксипирования ГК - ГАМК и др., оказывающие возбуждающее или тормозящее действие на нервную проводимость.
В изучении обмена, локализации, физиологического действия таких нейромедиаторов, как ацетилхолин, катехоламины, серотонин и др., достигнуты значительные успехи. Установлены основные закономерности их синтеза, хранения, реализации, восстановления фондов, некоторые свойства рецепторов, содержание в целом мозге и его крупных отделах, субклеточная локализация и т.д. Показано наличие центров нейромедиаторов и их связей с другими образованиями мозга. В значительно меньшей степени в таком плане изучены аминокислоты и их производные.
Вместе с тем до настоящего времени по проблеме нейромедиаторов ЦНС млекопитающих /человека и животных/ крайне мало биохимических исследований системного плана, вскрывающих закономерности их действия в определенных функциональных системах мозга /Анохин, 1975/, с учетом биохимической гетерогенности нейронов и синаптических структур /Пигарева и соавт., 1979, 1980/. Кроме того, недостаточно отражена системность самого биохимического изучения /обычно исследуются один-два компонента в отрыве от других метаболитов/ данной системы нейромедиатора.
В этом отношении настоящая работа, посвященная выявлению роли системы ГК по ряду показателей /общему и удельному содержанию ГК, АсК, ГАМК, активности и свойствам ГдК-азы и ГАМК-Т-азы)в отдельных структурах зрительного анализатора мозга собак, отличаю- / щихся строением и ролью в функции зрения, - зрительной коре /
поле 17, НКТ, ПД и в сетчатке., является качественно новым исследованием.
Следует отметить, что возбуждающее действие дикарбоновых аминокислот, в частности ГК и АсК, а также тормозящее действие ГАЖ в отношении нервной проводимости и электрических параметров нейронов ряда образований мозга показаны Bradford /1970/, Однако такая роль их в системе зрительного анализатора остается неизученной /CM. "Chemical transmission in Mammalian CNS" O.H. Hockman, D.Bilges - 1976/.
В данной работе применены онтогенетический, сравнительный и экспериментальный методы эволюционной биохимии и физиологии /Крепе, I95I; Орбели, I96I/.
Онтогенетический метод позволил проследить закономерности динамики содержания и обмена изучавшихся веществ и их соотношений на отдельных этапах морфо-функционального созревания зрительного анализатора /появление нейронов и отростков разных типов, синап-тических структур, нейроглиальных элементов, связей разных образований в пределах и вне анализатора, смену отдельных этапов развития функции зрения и т.д./, а также на последующих этапах деятельности анализатора в зрелом мозге.
Сравнительный метод нашел отражение в одновременном /на тех же объектах и в те же сроки/ определении соответствующих биохимических параметров в теменной и двигательной областях коры мозга как структур, выполняющих соответственно ассоциативную и ин-тегративно-пусковую функцию /Адрианов, I959, I974/ в осуществлении зрения.
Экспериментальный метод выразился в использовании модели ранней световой депривации /содержание животных с момента рождения до трех месяцев постнатального онтогенеза в темновых камерах/. Он применен с целью обеспечить возможность более точного
- 10 -установления взаимосвязи световой импульсации с изучавшимися биохимическими компонентами и процессами.
Цель и задачи. Целью нашего исследования была разработка малоизученной проблемы биохимических основ специфических нервных функций. Конкретно это осуществлялось путем выявления участия системы ГК в биохимических процессах, связанных со зрительной функцией. В этом плане следовало установить закономерности соче-танного возрастного развития компонентов системы ГК /содержания ГК, АсК, ГАМК, активности ГДК-азы и ГАМК-Т-азы/ в зрительном анализаторе мозга собак в соответствии с морфо-функциональной диф-ференцировкой этого анализатора и становлениемфункции зрения.
В задачи работы входило:
I/ изучить сдвиги в содержании ГК, АсК, ГАМК и активности ГДК-азы и ГАМК-Т-азы в различных образованиях зрительной системы /зрительной коре - поле 17, НКТ, ПД и по некоторым показателям -в сетчатке/ на определенных этапах постнаталъного развития и во взрослом состоянии /1-,12-16-, 2I-, 45-, 90- и 180-е сутки, один год, 3-5 пет и по некоторым показателям - 15 лет и старше/;
2/ получить данные, характеризующие возрастную динамику общей и удельной активности ГДК-азы и ГАЖ-Т-азы, интенсивность образования продуктов их реакции, влияние на активность ГДК-азы и продукты ее реакции кофермента П-5-Ф. Это давало информацию о качественной характеристике ферментных систем на отдельных этапах постнаталъного онтогенеза в отдельных морфо-функциональных образованиях зрительного анализатора, связанных в единое целое при осуществлении функции зрения;
3/ по такой же программе определить исследуемые биохимические показатели в зрительной системе мозга собак, постнатальный онтогенез которых соответственно до 45- и 90-суточного возраста протекал в условиях световой депривации /содержание с момента
- .її -
рождения в темновых камерах/, а также в двигательной и теменной областях коры мозга, находящихся в своеобразных морфо-функцио-нальных отношениях со структурами зрительного анализатора, в том числе со зрительной корой;
4/ на основе полученных результатов и имеющихся литературных данных относительно морфо-функциональных перестроек зрительного анализатора мозга животных в постнатальном онтогенезе, а также результатов, характеризующих сдвиги в параметрах системы ГК в зрелом мозге /в основном функционально обусловленные/, предполагалось высказать суждение о роли компонентов системы ГК в осуществлении процессов, лежащих в основе функционирования зрительного анализатора, в том числе и их нейромедиаторной роли.
Исследования, предпринятые нами, органически связаны с изучением роли различных процессов обмена - белкового, энергетического, медиаторного /серотонин и ацетилхолин и др./ - в зрительном анализаторе и других образованиях и системах мозга млекопитающих, осуществляемым в лаборатории биогистохимии Института мозга АМН СССР под руководством проф. З.Д.Пигаревой.
Научная новизна данных. Научная новизна настоящего исследования состоит в том, что впервые с применением основных методов эволюционной биохимии и системного подхода в отношении как объекта /зрительная анализаторная система/, так и биохимических параметров /значительная часть компонентов системы ГК/ описана возрастная динамика перечисленных выше показателей в процессе постната льного онтогенеза в условиях обычного светового режима, а также ранней световой депривации. Выполненные исследования позволили с определенной долей обоснованности высказать предположение о нейромедиаторной роли компонентов системы ГК в процессах осуществления функции зрения в зрительном анализаторе.
Новыми являются также результаты систематического определе-
- 12 -ния содержания ГАМК и активности ГАЖ-Т-азы по продуктам реакции на отдельных возрастных этапах развития зрительной системы, а также данные, отражающие сдвиги в характере и выраженности влияния П-5-Ф на активность ГДК-азы и продукты ее реакции в зрительном анализаторе и других структурах мозга животных, содержавшихся в нормальных условиях и при световой депривации. Новой является и информация о возрастных закономерностях содержания АсК и интенсивности ее образования при формировании ГАЖ и ГК в ГДК-азной и ГАЖ-Т-азной реакциях, имеющих различия в каждой изучавшейся структуре мозга собак, развивающихся в условиях нормального светового режима, а также сведения об изменении этих закономерностей в указанных структурах при зрительной депривации,
В целом совокупность полученных результатов, осоознно данных, свидетельствующих о функционально обусловленных перестройках в содержании и обмене ГК, АсК и ГАЖ, должна быть оценена как докази-/ вающая нейромедиаторную /или модуляторную/ роль этих веществ в / процессах осуществления зрительной функции. Особенности возраст-; ной динамики содержания ГК и АсК, с одной стороны, и ГАЖ - с другой подтверждают данные литературы относительно различного характера /соответственно возбуждающего и тормозящего/ этих нейро-медиаторов.
Экспериментальный материал настоящего исследования на примере системы ГК дает дальнейшее обоснование представлений о зависимости закономерностей возрастного формирования обменных процессов в мозге от факторов внешней среды. Это связано с общебиологической проблемой взаимоотношения врожденных /генетических/ и приобретенных /средовых/ факторов и ролью последних в адаптивных модификациях обменных процессов и деятельности мозга в его взаимоотношениях с внешней средой /компенсаторные и адаптационные процессы/.
- 1.3 -
Полученные данные дают дополнительную информацию о биохимических основах пластичности структурных компонентов ЦНС, что лежит в основе пластических свойств мозга и организма в целом. Эта проблема - одна из важнейших в молекулярной биологии и еще далеко не решена. Информация о перестройках в системе ПС, не препятствующих, а, возможно, обеспечивающих рост и развитие животных, лишенных световой импульсации, является существенным вкладом в решение этой проблемы.
Практическая ценность работы. В клинической практике довольно часто встречаются случаи полной /слепота/ или частичной зрительной депривации у детей и подростков. Правильная диагностика, лечение и предупреждение этих нарушений требуют глубокого знания механизмов биохимической адаптации зрительных и других структур мозга к изменению условий освещения. В связи с этим результаты настоящего исследования имеют не только теоретическую, но и практическую ценность и могут быть использованы для разработки рациональных мер профилактики недостаточности детского зрения и терапии его нарушений.
Установленное влияние исключения функции зрения на состояние системы ГК должно учитываться в практике здравоохранения в отношении детей и взрослых, лишенных зрения с момента рождения. Практическая ценность данной работы состоит и в том, что установленные закономерности влияния факторов внешней среды /световая импульсация/ на состояние и возрастную динамику системы ГК в зрительной и других функциональных системах ЦНС могут быть использованы в дальнейшем для составления программы направленного воздействия на ЦНС с целью изменения в благоприятную сторону различных жизненноважных процессов /адаптация к измененным условиям, компенсация нарушенных функций и т.д./.
Основные положения, вынесенные на защиту:
І/ В процессе становления функции зрения в постнатальном онтогенезе в структурах зрительного анализатора формируется система глутаминовой кислоты, оцениваемая по содержанию и соотношениям ГК, АсК, ГАМК и активности ГДК-азы и ГАМК-Т-азы.
2/ Постнатальные изменения компонентов системы ГК в каждом из изучавшихся образований зрительного анализатора/зрительной коры, НКТ, ПД и сетчатки/ собак имеют существенные региональные различия, соответствующие морфо-функциональным особенностям и динамике возрастной дифференцировки этих структур.
3/ Возрастная динамика активности ГДК-азы и ГАМК-Т-азы сопровождается изменениями интенсивности образования продуктов реакций этих ферментов /соответственно ГАМК и ГК и сопутствующего формирования АсК/. При этом изменяется интенсивность влияния П-5-Ф на течение реакций ГДК-азы. Указанные изменения имеют некоторые отличия в каждой из структур анализатора на тканевом и субклеточном уровнях /исходная митохондриальная фракция, мембранная фракция, "легкие" и "тяжелые" синаптосомы, очищенные митохондрии/.
4/ У зрительно-депривированных собак /с момента рождения до 45- и 90-суточного возраста/ в образованиях зрительного анализатора и функционально-сопряженных с ним теменной и двигательной областях коры мозга система ГК отличается от таковой у контрольных животных как по уровню содержания, так и по соотношениям ее компонентов /меньший фонд ГК и АсК, больший фонд ГАМК, сниженная активность ГДК-азы и ГАМК-Т-азы и меньшая интенсивность образования ГАМК, ГК /и АсК/ в реакциях этих ферментов/. Проявляется зависимость выявленных изменений от структуры и длительности световой депривации.
5/ Высокое содержание ГАМК на ранних этапах дифференцировки нейронов, а также при зрительной депривации позволяет рассматривать ГАМК не только как тормозной нейромедиатор в сформированных синапсах, но и как нейромедиатор, обеспечивающий /наряду с другими факторами/ проявление генетически обусловленной специфичности нейронов в отношении импульсов определенной модальности, а также соответствующие перестройки в "деафферентировэнных" клетках.
6/ Выявленная функциональная обусловленность динамики содержания ГК в изучавшихся зрительных структурах мозга и постоянство ее "дефицита" при световой депривации могут расцениваться как показатели нейромедиаторной роли этой аминокислоты в осуществлении функции зрения.
7/ Особенности возрастной динамики содержания АсК в зрительных структурах, а также в теменной и двигательной областях коры, и более выраженные сдвиги ее содержания при 90-суточной депривации, по сравнению с 45-суточной, позволяют предположить нейромедиаторную роль АсК также в не зрительных синаптических структурах и возможность участия ее в адаптационно-компенсаторных процессах, протекающих в условиях зрительной депривации.
8/ Совокупность полученных данных позволяет рассматривать систему ГК в структурах зрительного анализатора как обеспечивающую возрастную дифференцировку и функциональную специализацию нейронов, а также их пластические перестройки в измененных условиях среды /в частности, при световой депривации/. В этом проявляется биологическая закономерность взаимовлияния генетических /врожденных/ и средовых /приобретенных/ факторов.
