Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАГОЫ
1.1. Современная классификация протеолитических ферментов. 10
1.2. Области применения протеолитических ферментов микробного происхождения 12
1.3. Методы выделения протеолитических ферментов 15
1.4. Характеристика внеклеточных протеолитических ферментов стрептомщетов на примере протеиназ "проназы" препарата из культуральной жидкости streptomyces griseus к-і ..23
1.4.1. Общая характеристика "проназы"... 23
1.4.2. Трипсиноподобный фермент "проназы" 26
1.4.3. Хиштрипсиюподобные ферменты "проназы" 29
1.4.4. Субтилизиноподобные ферменты "проназы" 38
1.4.5. Аминопептидазы "проназы" ...43
1.4.6. Карбоксипептидаза "проназы" ...48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ I. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Список сокращении, использованных в работе 59
2.2. Выращивание продуцента 60
2.3. Сорбенты, использованные для выделения и очистки протеолитических ферментов 61
2.3.1. Ионообменные материалы 61
2.3.2. Аффинные сорбенты 62
2.3.3. Сорбенты для гельхроматографии 63
2.4. Субстраты для оцределения цротеолитической активности 63
2.5. Ингибиторы протеиназ 63
2.6. Методы определения концентрации белка 64
2.7. Методы определения протеолитической активности 64
2.7.1. Определение неспецифической протеолитической активности по денатурированным растворимым белкам 64
2.7.2. Определение активности по нерастворимым белковым субстратам .64
2.7.3. Метод оцределения фибринолоззической активности в тонком слое 65
2.7.4. Метод определения тромболитической активности 66
2.7.5. Определение литической активности 66
2.7.6. Определение эстеразной активности протеиназ .66
2.7.7. Определение амидазной активности 67
2.7.8. Определение карбоксипептидазной активности .6S
2.7.9. Изучение субстратной специфичности карбокси-пептидазы .69
2.8. Методы выделения комплексного препарата протеолитических ферментов Str.spheroid.es шт.35 и отдельных его компонентов 70
2.8.1. Выделение комплексного препарата из культуральной жидкости Str.spheroid.es шт.35 .
осаждением сульфатом аммония, ионообменной хроматографией на ДЕ№-целлюлозе, гельхрома-тографией на сефадексе G -75 70
2.8.2. Получение комплексного препарата протеиназ методом аффинной хроматографии 71
2.8.3. Выделение субтилизиноподобной протеиназы SSPB Str.spheroides шт.35 ,71
2.8.4. Выделение химотрипсиноподобной протеиназы
72
SSPG Str.spheroides ШТ.35 .
2.8.5. Выделение лейцинаминопептидазы и второго химотрипсиноподобного фермента SSPI str. spheroides шт.35 73
2.8.6. Выделение карбоксипептидазы str.spheroides шт.35 73
2.9. Методы биохимического и физико-химического
исследования гомогенных ферментов 74
2.9.1. Определение рН-оптимума активности .- 74
2.9.2. Определение температурного оптимума активности,.74
2.9.3. Изучение рН-устойчивости ферментов ...75
2.9.4. Изучение термостабильности ферментов , 75
2.9.5. Диск-электрофорез белков в полиакриламидномгеле 75
2.9.6. Изоэлектрофокусирование .76
2.9.7. Определение молекулярной массы ферментов .77
2.9.8. Определение аминокислотного состава ...77
2.9.9. Определение її-концевой аминокислотной 78 последовательности
2.10. Метод изучения тромболитической активности препарата протеиназ Str.spheroides шт.35 in vivo 78
2.11. Исследование фибринолитической системы крови при внутривенном введении препарата протеиназ str. spheroides шт.35 .79
ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Str.spheroides ШТ.35
3.1. Изучение динамики накопления протеиназ- в процессе роста культуры .80
3.2. Выделение и некоторые свойства комплекса протеиназ str.spheroides шт.35, полученного методом осаждения сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, гельхроматографии на сефадексе G-75..J 84
3.3. Изучение биологической активности препарата протеиназ Str.spheroides шт.35 ..90
3.3.1. Изучение тромболизиса у крыс при внутривенном введении препарата , .90
3.3.2. Изучение биохимических показателей крови крыс при внутривенном введении препарата протеиназ Str.spheroides шт.35 91
3.3.3. Исследование токсичности ферментного препарата протеиназ str.spheroides шт.35 .94
3.4. Выделение комплексного препарата протеолитических ферментов методом аффинной хроматографии и исследование его некоторых свойств ..95
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СУБТИЛИЗИНО-П0Д0БН0Й ПЮТЕИНАЗЫ SSPG Str.spheroides шт.35
4.1. Выделение и очистка SSPB .102
4.2. Изучение физико-химических свойств SSPB 113
4.3. Влияние ингибиторов на активность SSPB , 116
4.4. Поведение SSPB в 6М гуанидингидрохлориде 117
4.5. Субстратная специфичность SSPB JI8
4.6. Аминокислотный состав SSPB J24
ГЛАВА 5. ВЫДЕЯЕШЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ХШОТРИПСИНОПОДОБШХ ПРОТЕИНАЗ SSPG и SSPI.
5.1. Выделение и очистка SSPG И SSPI . 127
5.2. Изучение физико-химических СВОЙСТВ SSPG 135
5.3. Влияние ингибиторов на активность SSPG J35
5.4. Поведение SSPG в 6М гуанидингидрохлориде 138
5.5. Субстратная специфичность SSPG 140
5.6. Аминокислотный состав SSPG 142
ГЛАВА 6. ВЫДЕЯЕНИЕ, ОЧИСТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ
СВОЙСТВ ЛЕШНАМИНОПЕШИДАЗЫ Str.spheroides шт.35
6.1. Выделение и очистка лейцинаминопептидазы 145
6.2. Исследование некоторых энзиматических и физико-химических свойств лейцинаминопептидазн 148
ГЛАВА 7. ВЫДЕЯЕНИЕ И ХАРАКТЕШСТИКА КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Str.spheroides шт.35
7.1. Выделение и очистка карбоксипептидазы 152
7.2. Изучение некоторых физико-химических свойств карбоксипептидазы 152
7.3. Влияние ингибиторов на активность карбоксипептидазы..158
7.4. Субстратная специфичность карбоксипептидазы .160
7.5. Аминокислотный состав карбоксипептидазы 163
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 165
ВЫВОДЫ 171
ЛИТЕРАТУРА Ї73
- Современная классификация протеолитических ферментов.
- Аффинные сорбенты
- Изучение динамики накопления протеиназ- в процессе роста культуры
- Выделение и очистка SSPB
- Выделение и очистка SSPG И SSPI .
Введение к работе
В природе нет живых организмов, в которых не происходили бы процессы с участием протеолитических ферментов.
С кадцым годом появляются все новые исследования, подтверждающие решающую роль цротеолиза в регуляции большинства физиологических процессов, происходящих в живых организмах. Основная функция протеолитических ферментов - быстрое селективное расщепление белков с целью получения аминокислот - "строительных кирпичей", позволяющих обновлять белковый материал.
Протеолитические ферменты играют и огромную регуляторную роль. Наиболее изученная их регуляторная функция - процесс ограниченного протеолиза. Можно назвать примеры: посттрансляционное расщепление предшественников многих биологически активных веществ, образование полипептидных горюнов, процесс свертывания крови, активация фибринолитической системы крови и многие другие процессы. Действие протеолитических ферментов не только вызывает начало таких процессов, но и способствует их ускорению, а также приводит к сопряжению одних физиологических процессов с другими.
Поэтому изучение этих ферментов, их структуры, функции, биохимических, физико-химических свойств, их биологической роли представляет огромный интерес.
Препараты протеолитических ферментов находят важное применение в народном хозяйстве: в промышленности, медицине, науке. Потребность в таких препаратах очень велика, но удовлетворяется далеко не полностью.
Важными и перспективными продуцентами протеолитических ферментов в современной биотехнологии могут служить всевозможные микроорганизмы (Иерусалимский, 1965; Безбородов, 1977; Бекер, 1978; Калунянц, 1979).
В Постановлении ЦК КПСС и СМ СССР "О дальнейшем развитии физико-химической биологии и биотехнологии и использовании их достижений в медицине, сельском хозяйстве и промышленности" от 24 июня 1981 года специально предусмотрена работа по направленному поиску высокопродуктивных штаммов микроорганизмов и решению технологических вопросов получения биохимических препаратов.
Стрептомицеты давно известны как продуценты многих биологически активных веществ и прежде всего антибиотиков и протеолити-ческих ферментов. Известно также, что некоторые микробные про-теиназы весьма перспективны для медико-биологических целей - при лечении гнойных и ожоговых ран, тромбоэмболиях, терапии тромбозов.
Хотя протеиназам стрептомицетов посвящено много исследований, подробно изучен только широко известный препарат внеклеточных протеиназ Str.griseus шт. K-I - "проназа", из которого выделены и изучены сериновые эндопептидазы, родственные по структуре трипсину, химотрипсину, эластазе животных и принадлежащие к семейству химо трипсина, а также так называемые субтилизиноподобные ферменты, во многом сходные с сериновыми протеиназами бацилл. Однако, эти ферменты изучены еще крайне недостаточно и их структурное сходство с субтилизинами требует дополнительного подтверждения. Помимо них str.griseus синтезирует внеклеточные экзопептидазы - карбоксипептидазу и аминопептидазы.
В СССР из фильтрата культуральной жидкости str.griseus шт. ЛС I получен высокоактивный препарат протеиназ, названный протелином (Богданов и др.,1966,1968), а из фильтрата культуры Str.griseus шт.32-12 - препарат протезим, в котором обнаружены химотрипсиноподобная протеиназа и карбоксилептидаза (Лысен-ков, Рева, 1975). Показано наличие множества протеиназ в культуральной жидкости Str.rimosus (Рассулин и др., 1973 ;Morihara.,
1969), Str.fradiae (Долидзе и др.,1974; Петрова, 1976; Лагутина, 1980; Mordhara et al.I967 ), Str.rutgersensis (Калугер и др., 1983; Лавренова и др.,1984).
Однако, имеющихся данных недостаточно, чтобы судить о том, насколько типичен для микроорганизмов этого класса набор изученных ферментов.
Культура Str.spheroides шт.35 из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета НУ, известная как продуцент антибиотика новобиоцина ( Welch,Wright,1955 ), синтезирует внеклеточные протеолитические ферменты, обладающие высокой казеино-литической, фибринолитической и тромболитической активностью (Егоров, Ушакова,1966). Наши предварительные исследования показали, что в культуральной жидкости данной культуры присутствуют самые разнообразные протеолитические ферменты: трипсино-, хиштрипсино-, субтилизиноподобные, а также экзопептидазы с амино- и карбокси-пептидазной активностью.
Целью настоящей работы явилась, во-первых, разработка метода выделения комплексного препарата внеклеточных протеиназ str. spheroides шт.35 и характеристика его свойств с целью возможного использования в качестве фибринолитического средства, во-вторых, разработка методов выделения и очистки гомогенных ферментов и прежде всего протеиназ, проявляющих повышенную специфичность к фибрину, на основе аффинной и ионообменной хроматографии и, в-третьих, получение характеристик гомогенных протеиназ и их сравнение с известными ферментами животных и микроорганизмов.
Современная классификация протеолитических ферментов
Протеолитические ферменты, гидролизутощие пептидные (амид-ные) связи в белках и пептидах, относятся к классу гидролаз (класс 3), подклассу пептидгидролаз (или амидгидролаз), который в свою очередь делится на две группы - протеаз (3.4) и амидаз (3.5). Принятая в настоящее время классификация ферментов этих подклассов основана на двух важных критериях: специфичности и структуре каталитического аппарата ферментов (Enzyme: Nomenclature, 19 81).
Протеазы делятся на группу пептидаз (экзопептидаз; 3.4.II-I7), которые классифицируются по положению расщепляемой связи в пептидной цепи как: аминопептидазы (3.4.II), карбоксипептидазы (3.4.16-17), дипептидазы (3.4.13), дипептидилпептидазы (3.4.14), пептидилдипептидазы (3.4.15) и группу протеиназ (эндопептидаз; 3.4,21-24), которые классифицируются по строению активного центра. Это - сериновые протеиназы (3.4.21), тиоловые (3.4.22), карбоксильные (3.4.23) и металлсодержащие (3.4.24). Некоторые авторы (Антонов, 1983) считают такое положение неудовлетворительным, так как здесь смешиваются два совершенно разных признака, и кроме того появляется все больше данных о существовании ферментов, обладающих как экзо-, так и эндопептидазной активностью. Так, многие пептидазы можно отнести к одному из четырех типов эндопептидаз ( Hartley, I960).
Большинство авторов, работающих с протеолитическими ферментами, относят их к той или иной группе на основании данных по ингибированию активности специфическими ингибиторами. Так, к се-риновым относятся протеиназы, активность которых подавляется ди изопропилфторфосфатом или бензилсульфоншфторидом, взаимодействующими с каталитически активным остатком серина, к тиоловым -протеиназы, которые ингибируются реагентами, специфически взаимодействующими с SH- группой остатка цистеина в активном центре, - п-хлормеркурибензоатом, йодацетатом и другими ингибиторами. Металлсодержащие протеиназы и пептидазы, имеющие в активном цен-тре ионы металла ( Zn , Со , Мп и др.), инактивируются хе-латирующими реагентами, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота, 1,10- фенантролин и др.
Карбоксильные протеиназы, к которым относятся пищеварительные ферменты желудка (пепсины) и многие протеиназы низших грибов, гидролизуют белки и пептиды при кислых значениях рН и ингибируются диазокетонами, некоторыми эпоксисоединениями и микробным ингибитором пепстатином.
Аффинные сорбенты
Для аффинной хроматографии протеолитических ферментов Str. spheroides были использованы аффинные сорбенты: бациллихин-си-лохром и бацитрацин-силохром с содержанием лиганда 12 мкмолей/г сорбента ( stepanov et al., 1981), бацитрацин-сефароза, содержащая 6 мкмолей бацитрацина/ мл сорбента (Степанов и др., 1978; Stepanov, Rudenskaya, 1983),а также п-ЖБ-силохром (п-хлормер-курибензоил-силохром) с содержанием лиганда 30 мкмолей/г сорбента (Аденская и др., 1984).
Выражаем глубокую благодарность Г.Н.руденской за предостав-ление вышеназванных аффинных сорбентов.
class3 ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Str.spheroides ШТ.35 class3
Изучение динамики накопления протеиназ- в процессе роста культуры
Эти эксперименты проводились с целью выяснения фазы роста, когда культура синтезирует максимальное количество активных ферментов.
На рис. I представлены данные, показывающие, что культура Str.spheroides шт.35 при выращивании на жидкой синтетической среде достигает максимума развития примерно к 3-им суткам роста, а содержание белка в культуральной жидкости продолжает возрастать к 6-7-м суткам. Это,по-видимому, является следствием автолиза клеток микроорганизма при переходе его в постстационарную фазу роста, а не увеличения синтезируемого внеклеточного фермента, так как максимум протеолитической активности - казеинолити-ческой и фибринолитической - приходится на 2-3-и сутки роста (приблизительно на середину логарифмической фазы роста), совпадая с максимальным ростом культуры.
Подобный характер биосинтеза протеиназ у стрептомицетов в связи с ростом культуры отмечен в работах других авторов (Ермолина, 1981).
В дальнейшей работе по выделению протеиназ использовалась культуральная жидкость str.spheroides шт.35 3-их суток ростакульту-ш на жидкой синтетической среде.
Выделение и очистка SSPB
Комплексный препарат протеиназ (после аффинной хроматографии на баллллихин-силохроме) фракционировали на карбоксильных катионитах в режиме ступенчатого изменения рй и ионной силы раствора. На рис.9 представлена сорбция и десорбция белковых компонентов на катионите КМТ и на рис.10 - на катионите КМ-2П. Значительная часть белка и около 1$ активности по ZAALEA. не связывались сорбентом (пик I). Десорбцию нейтральных и слабощелочных белков проводили 0,15 М Трисом, 2 мМ Са(СН С00)2 рН 10,4. При этом рН элюата не превышал 9, что тем не менее привело к существенным потерям активности. Полученный пик П содержал 2,5$ активности по ZAALNA И 35$ фибринолитической активности. Последующая элюция катионита 0,5 М ацетатом аммония, 2 мМ Са(СНзС00)2» рН 8,0 или 25$-ным изопропанолом, І М Касі в буфере А (0,05 М Трис»НС1 буфер, 2 мМ Са(СН3С00)2, рН 7,5) -дает практически одну протеиназу SSPB, активную по ZAALNA (ПИК Ш, рис.9 и 10) с выходом по активности около 20$. Прочное связывание с карбоксильными катионитами объясняется четко выраженными основными свойствами фермента, изоэлектрическая точка которого лежит выше рН 10.
Аналогичная картина разделения была получена и на катионите Биокарб-Д.
Окончательная очистка фермента была достигнута аффинной хроматографией на баЦИТраЦИН-сефарозе (Stepanov, Rudenskaja, 1983) (рис. II). Выход его по активности (по ZAALM) равнялся 19$.
Выделение и очистка SSPG И SSPI
В таблице 9 представлены результаты по выделению из куль-туральной жидкости str.spheroides шт.35 химотрипсиноподобной протеиназы - SSPG. Как и при выделении SSPB на первом этапе был получен комплексный препарат протеиназ с помощью аффинной хроматографии на бапилжхин-силохроме. В результате этой стадии очистка удельная активность по Pyr-L-Phe-pHA - субстрату ферментов типа хипотрипсина, возросла в 10 раз, а выход по активности составил 77$.
Диск-электрофорез комплексного препарата протеиназ при рН 6,5 и 8,3іІААГ,как было показано выше (см. рис,8)t обнаружил присутствие в нем трех протеиназ, активных по Pyr-L-Phe-plTA - SSPG, SSPI и SSPO. Наибольшая фибринолитическая активность также наблюдалась в зонах, соответствующих химотрипсиноподобным ферментам, а также в зоне, соответствующей выделенному ранее субтили-зиноподобному ферменту SSPB. Следует сказать, что химотрипсино-подобный фермент SSPG весьма чувствителен к органическим растворителям, поэтому его элюцию с бациллихин-силохрома раствором, содержащим изопропанол, и последующий диализ необходимо проводить при 4 и по возможности быстро.
Разделение протеиназ комплексного препарата проводили на другом аффинном сорбенте - бапдтрапин-сефарозе (рис.18). Элюция 20 мМ ЭДТА-На2 cIM NaCi в буфере А позволила десорбировать фермент, проявляющий лейцинаминопептидазную активность по L-Leu-рїїА, а также фермент (SSPI), активный по субстрату Pyr-L-Phe-рЖА (рис,18, пик П, рис.22аи б - "3").
