Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В ДИССЕРТАЦИИ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава первая. (Обзор литературы) .7
1. СУБСТРАТ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 9
2. КЛАССИФИКАЦИЯ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЖТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 19
3. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЖТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 38
4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ПРИМЕНЕНИЕ ЖТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 43
5. ЖТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, РАЗРУШАЮЩЕ КЛЕТОЧНУЮ СТЕНКУ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ А 50
Глава вторая. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ :ИССЛЕДОВАНИЯ
1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1. Методы культивирования актиномицетов 58
1.2. Выращивание тест культур 59
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ
2.1. Электрофокусирование
2.2. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле 61
2.3. Иммуноэлектрофорез 61
2.4. Получение ферментных литичеоких препаратов из культуральной жидкости стрептомицетов 61
2.5. Получение клеточных отенок стрептококка 62
2.6. Получение пептидогликана из клеточных стенок стрептококка группы А 62
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
3.1. Определение белка и Сахаров 64
3.2. Определение свободных аминогрупп 66
3.3. Определение аминокислотного состава литического фермента
3 3.4. Определение молекулярной массы литического фермента
3.5. Определение активности ферментов 68
4. РЕАКТИВЫ 71
Глава третья. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. ИЗЫСКАНИЕ АКТИНОШЦЕТОВ - ПРОДУЦЕНТОВ ФЕШЕНТОВ.ЛИЗИ-РУЮЩИХ КЛЕТОЧНЫЕ СТЕНКИ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ А 72
2. ЖТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, ПРОДУВДРУЕМЫЕ Streptomyces le voris 96 Q6
3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЛИТИЧЕСКОГО
ФЕШЕНТА (рЕ 10,8) ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Streptomyces levoris 96 102
3.1. Получение очищенного препарата литического фермента Ю2
3.2. Определение специфичности полученного фермента (pi 10,8) 111
4. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДО-Л-N -АЦЕТИЖУРАМИДАЗЫ, СИНТЕЗИРУЕМОЙ Streptomyces levoris 96 116
4.1. Молекулярная масса фермента 116
4.2. Аминокислотный состав фермента 117
4.3. Влияние температуры на лизис клеточных стенок стрептококка группы А 119
5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ ЛИЗИСА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ А ЭНДО- А - N -АЦЕТИЛМУРАМИДАЗОЙ Strep tomyces levoris 96 130
Глава четвертая. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 134
ВЫВОДЫ 141
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Поиск и получение новых литических ферментов, разрушающих клеточные стенки микроорганизмов и использующихся для изучения структуры стенок, получил большое развитие в последние годы. Исследованию строения и функций клеточных стенок микроорганизмов уделяют внимание многие ученые. Клеточная стенка принимает активное участие в обменных процессах клетки. Она регулирует проникновение питательных веществ из окружающей среды в клетку и выделение наружу продуктов метаболизма, ферментов, антибиотиков, токсинов.
Исследования клеточной стенки имеют как теоретическое, так и практическое значение. С компонентами стенки связаны вирулентные и антигенные свойства патогенных микроорганизмов. До последнего Бремени изучение строения клеточных стенок микроорганизмов в большинстве случаев проводилось с использованием жестких методов выделения отдельных компонентов, таких как экстракция белков соляной кислотой ( Lancefield a. Perl-mann , 1952), горячим формамидом ( Krause a. McCarty , 1961), уксусной кислотой ( Slade a. Slamp , 1972) и др.
Естественно, что использование этих методов, хотя и дает возможность изучать отдельные компоненты, не может дать представления о молекулярной организации клеточной стенки и часто приводит к потере биологической активности выделенных структур.
Изучение структуры клеточной стенки микроорганизмов с помощью бактериолитических ферментов имеет ряд преимуществ перед химическими методами, так как дает возможность выделять нативные компоненты путем разрыва определенных связей в структуре клеточных стенок. Выделенные этим способом структурные компоненты, как правило, не теряют своей биологической активности и могут быть в дальнейшем использованы для изучения их строения и биологической функции, а также для практического использования в качестве антигенов при получении лечебных сывороток.
Целью настоящей работы было получение и изучение фермента, лизирующего клеточные стенки стрептококков группы А и не обладающего протеолитической активностью. Задачами данного исследования являлись:
- проведение поиска продуцентов литических ферментов, разрушающих клеточные стенки стрептококков группы А, среди представителей стрептомицетов;
- изучение состава ферментного комплекса одного из наиболее активных продуцентов;
- выделение и очистка фермента, обладающего высокой литичес-кой активностью, отличной от протеаз;
- определение специфичности полученного литического фермента;
- изучение свойств фермента.
Новизна данной работы заключается в получении новых ферментов, лизирующих стрептококки группы А. Эти ферменты могут быть использованы для изучения структуры клеточной стенки стрептококка, получения антигенов, а после проведения соответствующих лабораторных опытов на животных и клинических испытаний могут найти применение в клинической практике для лечения стрептококковых инфекций.