Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Общие сведения о лектинах бактерий 10
1.2. Биологическая активность лектинов 26
2 Экспериментальная часть 43
2.1. Объект исследования 43
2.2. Материалы и методы исследования 44
2.2.1. Выделение и очистка лектина ЛИ Paenibacillus polymyxa 1460 44
2.2.2. Иммунизация животных лектином, воспроизведение экспериментального гипотиреоза и стресса 44
2.2.3. Разделение белков плазмы крови и определение их молекулярной массы 46
2.2.4. Метод электроблотинга 47
2.2.5. Метод лектинодота 47
2.2.6. Метод выделения альвеолярных и перитонеальных макрофагов 48
2.2.7. Моделирование процесса фагоцитоза 48
2.2.8. Определение индекса завершенности фагоцитоза 49
2.2.9. Метод выделения лизосом 50
2.2.10. Метод определения активности кислой фосфатазы 50
2.2.11. Метод определения активности катепсинов 51
2.2.12. Метод определения активности аминотрансфераз 52
2.2.13. Метод определения концентрации глюкозы в крови 54
2.2.14. Метод определения концентрации молочной кислоты в крови 54
2.2.15. Метод определения концентрации общего белка плазмы крови .55
2.2.16. Метод определения концентрации мочевины в сыворотке крови ,..55
2.2.17. Метод определения концентрации малонового диальдегида 56
2.2.18. Метод определения активности пероксидазы 57
2.2.19. Метод определения концентрации церулоплазмина в крови 58
2.2.20. Метод определения активности каталазы 58
2.2.21. Статистическая обработка данных 59
2.3. Результаты исследований и их обсуждение 60
2.3.1. Исследование воздействия лектина ЛИ на белковый спектр плазмы крови белых крыс (интактных и при экспериментальном гипотиреозе) 60
2.3.2. Исследование специфического взаимодействия лектина ЛИ с белками плазмы крови in vitro 74
2.3.3. Изменение активности кислых гидролаз лизосом печени при введении лектина интактным животным и животным с развивающимся гипотиреозом 76
2.3.4. Влияние лектина ЛИ на активность фагоцитоза клеток стафилококка 81
2.3.5. Воздействие лектина ЛГІ на интенсивность перекисного окисления липидов и некоторые звенья антиоксидантной защиты самцов и самок крыс при стрессе 87
2.3.6. Изменения активности аминотрансфераз сыворотки крови при стрессе, введении лектина и комбинированном воздействии 98
2.3.7. Воздействие лектина ЛИ на метаболические параметры углеводного и белкового обмена самцов и самок крыс при стрессе 106
Заключение 116
Выводы 124
Список использованных литературных источников 125
- Биологическая активность лектинов
- Иммунизация животных лектином, воспроизведение экспериментального гипотиреоза и стресса
- Метод определения активности аминотрансфераз
- Исследование специфического взаимодействия лектина ЛИ с белками плазмы крови in vitro
Введение к работе
Актуальность темы
Специфическое связывание лектинов с углеводными детерминантами рецепторов клеточных поверхностей играет важную роль в образовании межклеточных контактов, при формировании многоклеточных организмов и межвидовых сообществ, симбиотических и паразитических (Линевич, 1979). Лектины обладают большой биологической активностью в отношении клеток, что косвенно указывает на их активное участие в процессе экзо- и эндогенной регуляции различных сторон клеточного метаболизма, и изучение воздействий, производимых этими веществами, на клетку и организм в целом может дать новые возможности коррекции нарушенного метаболизма. Поэтому скрининг и изучение свойств и функций метаболически активных лектинов и сегодня актуальны для решения ряда проблем современной биологии и медицины.
За последние годы в лектинологии наметился переход от изучения лектинов растительного и животного происхождения к лектинам микроорганизмов (Лахтин, 1992). Эта тенденция не случайна и связана с тем, что микробные лектины характеризуются высокой удельной активностью и большим разнообразием по углеводной специфичности. Микроорганизмы быстро растут, хорошо подходят для технологии интенсивного культивирования, и на данный момент имеется довольно широкий выбор микроорганизмов, синтезирующих лектины. Особенный интерес представляют малотоксичные лектины непатогенных бактерий. Лектины, выделенные из бактерий, проявляют свою биологическую активность, как было показано в ряде работ (Пономарева, 1997; Мельникова, 2000; Никитина, 2001; Карпунина, 2002), в бактериальных, растительных и животных клетках. Но влияние их на метаболизм животного организма мало изучено, и поэтому исследования влияния лектинов бактериального происхождения на метаболические процессы организма животных, как в норме, так и при некоторых нарушениях являются интересной и актуальной задачей.
Цель и задачи исследования <
Цель работы состояла в исследовании in vivo и in vitro влияния лектина Paeniba-cillus polymyxa 1460 на метаболические процессы животных в норме, а также при ги-
потиреозе и стрессе. В связи с этим были поставлены с ловдшвдвддажяЛЬНАЯ I
'библиотека і
-
Изучить влияние экзогенного лектина ЛИ P. polymyxa 1460 на белковый спектр плазмы крови животных (крыс) с экспериментальным гипотиреозом и определить специфическое взаимодействие лектина бацилл с белковыми компонентами плазмы крови in vitro.
-
Исследовать влияние лектина бацилл на активность кислых гидролаз лизосом печени.
-
Выявить влияние лектина бацилл на активность процесса фагоцитоза патогенных бактерий.
-
Определить воздействие лектина бацилл на интенсивность перекисного окисления липидов и на активность антиоксидантной защиты организма крыс в условиях стресса.
-
Изучить воздействие лектина бацилл на активность аминотрансфераз сыворотки крови и концентрацию некоторьж метаболитов углеводного и белкового обмена животньж (крыс) в условиях стресса.
Научная новизна
Впервые было изучено влияние лектина ЛИ, выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Ppolymyxa 1460, обладающего специфичностью к D-галакгозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозо-1,6-дифосфату и D-глюкозамину, на метаболизм животньж в норме, при раннем гипотиреозе и при стрессе. Вьшвлено воздействие лектина на белковый состав плазмы крови животньж в норме и при гипотиреозе, показано специфическое взаимодействие лектина с отдельными белками плазмы крови (преальбуминами (Мг — 24, 50 и 55 кДа), альбуминами и постгрансферрином с молекулярной массой 140 кДа. Показано влияние лектина in vivo на активность кислых гидролаз (кислой фосфатазы и катепсинов) и аминотрансфераз (аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы). Впервые исследовано in vitro воздействие, оказываемое лектином ЛИ на активность фагоцитоза. Обнаружено влияние бациллярного лектина на интенсивность перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты организма, а также на белковый и углеводный обмен как интактньж, так и стрессированных животньж (крыс).
Практическая значимость
Изучение влияния лектинов непатогенньж бактерий на метаболизм животного организма не только важно для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе метаболической активности данньж веществ, но и раскрывает возможность их
5 перспективного широкого применения в практике медико-биологических исследований.
По материалам диссертационной работы написаны "Методические рекомендации по изучению влияния лектинов бацилл на активность процесса фагоцитоза патогенных бактерий" (в соавторстве с Е. И. Тихомировой, О. В. Кочергиной и Л. В. Кар-пуниной) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области микробиологии и бактериохимии; рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом биологического факультета СГУ (протокол № 2 от4 ноября 2003 г). Материалы диссертационной работы нашли применение при чтении лекций по общему курсу "Иммунология" и факультативному курсу "Современные методы исследований в иммунологии" для студентов биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского. Результаты диссертационной работы использовались при подготовке курсовьж и дипломных работ студентами биологического факультета Саратовского государственного университета им/ Н. Г. Чернышевского.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Лектин бацилл (ЛИ) приводит к нормализации белкового спектра плазмы крови при введении крысам с медикаментозным гипотиреозом и специфически взаимодействует in vitro с белками плазмы крови - преальбуминами (Mr = 24,* 50 и 55 кДа), альбуминами и посггрансферрином (Mr = 140 кДа).
-
Введение бациллярного лектина оказывает влияние на активность кислых гид-ролаз лизосом печени.
-
Лектин ЛИ активирует адгезивный процесс при фагоцитозе патогенньж бактерий.
-
Лектин ЛИ оказывает воздействие на интенсивность перекисного окисления липидов и на активность антиоксидантной защиты организма крыс, интактньж и подвергнутых стрессу.
-
Лектин ЛИ оказывает воздействие на аминотрансферазную активность сыворотки крови и метаболические параметры углеводного и белкового-обмена крыс, интактньж и подвергнутых стрессу .
Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского в соот-
ветствии с плановой темой научно-исследовательской работы "Экотип" раздела "Биохимические и физиологические свойства углеводузнающих белков (лектинов)" (№ гос. регистрации 01.960.007760).
Апробация работы Основные результаты и положения работы представлены на конференциях: втором конгрессе "Научная молодежь на пороге XXI века" (Россия, Томск, 2001), первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», Россия, ИБФРМ РАН, Саратов, 2002), третьем конгрессе «Науки о человеке» (Россия, СГМУ, Томск, 2002), на конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2002 год (СГАУ им. Н.И. Вавилова, Саратов, 2003).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем работы
Биологическая активность лектинов
Природа специфических структур поверхности эукариотических клеток, участвующих в связывании лектинов, изучена недостаточно. Полагают, что присутствие олигосахаридов на поверхности животных клеток, содержащих от 4 до 20 моносахаридных остатков, чаще всего глюкозу, галактозу, манно-зу, фукозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, N-ацетил-нейра-миновую кислоту, и обеспечивает существование множества различных рецепторов (Езепчук, 1985). Лектины проявляют выраженное сродство к мак-ром олекулярным соединениям чисто углеводной природы - гликозамино-гликанам и гомогликанам.
Специфическое связывание лектинов с углеводными рецепторами клеточных поверхностей является одним из видов углевод - белкового узнавания, которое играет большую роль в межклеточных контактах, в формировании многоклеточных организмов и межвидовых сообществ как сим биотических, так и паразитических. В тканях человека и животных различают следующие основные типы гликоконъюгатов, которые могут выполнять функцию рецепторов лектинов: гликопротеины, гликолипиды, протеогликаны. Лектинзависимая регуляторная система делает возможным достаточно гибкое управление внутриклеточными процессами in vivo за счет прямых и конкурентных углеводспецифических взаимодействий модификаторов с мембранными рецепторами, а также образования активных и неактивных лектин-гликолигандных комплексов (Тимошенко, 1998).
В своих регуляторных функциях лектины выступают, в основном, как мембранные или мембранносвязанные компоненты ткани; регуляторные функции почти всегда сводятся к мембранно-активным ответам на образование (или диссоциацию) комплекса лектин-рецептор.
Можно выделить 2 основных типа ответа: Первый — определяется образованием комплекса и является результатом конформационных изменений или стерического экранирования части ком-плексообразующих макромолекул от среды. При данном типе ответа лекти 27 нами осуществляется модуляция ферментативной активности мембранных рецепторов. Так, лектин канавалии мечевидной, Canavalia ensiformis - конканавалин А (Кон А) ингибирует активность ДНК-полимеразы клеток нейроб-ластомы. Кон А и фитогемагглютинин фасоли обыкновенной, Phaseolus vulgaris (ФГА), активируют пируватдегидрогеназу лимфоцитов, некоторые растительные лектины действуют синергично с различными соединениями, стимулируя аденилатциклазу макрофагов,
Второй — может быть обозначен как мембранно-опосредованный. При этом влияние лектинов осуществляется как через центры связывания (рецепторы), так и в результате гидрофобного взаимодействия. При мембранно-активном ответе лектин и (или) его рецептор являются мембранно-связанными структурами. При образовании комплекса создаются условия для внутримембранного кластерирования трансмембранного компонента системы, что функционально на мембранном уровне может проявляться как изменение электрических свойств мембраны (Луцик, Кусень, 1989). Лектины, связываясь с рецепторами, влияют на функционирование в мембране ионных каналов, повышая проницаемость мембраны для ионов К и Са , высвобождая ряд ферментов (например, протеинкиназ — конканавалин А), повышая уровень циклических нуклеотидов (цГМФ) в клетке, стимулируя синтез фос-фолипидов (фосфатидилинозит и фосфатидилхолин), повышая флюидность мембран (Франц, 1996). Взаимодействие лектинов с углеводными остатками клеточной мембраны влияет на транспортную функцию мембраны. Этот эффект лектинов может быть обусловлен изменением флюидности мембраны и микроокружения ферментов (Караганов, 1986).
Лектинзависимые пути в активации клеток ассоциированы с такими сигнальными реакциями как мобилизация внутриклеточного Са2+, изменение внутриклеточного рН, генерация активных форм кислорода и азота, метаболизм арахидоновой кислоты, дегрануляция. В дополнение к этим ранним реакциям можно выделить более отдаленные лектинзависимые клеточные ответы, включающие процессы формирования адгезионных контактов и на 28 правленной миграции клеток в тканях, образование метастазов, лектинофа-гоцитоз, апоптоз. Все перечисленные сигнальные и функциональные клеточные ответы обусловлены комплексом следующих основных молекулярно-м ем бранных событий, происходящих на уровне лектинзависимых реце игорных взаимодействий: 1. Связывание эндогенного лектина с углеводным компонентом рецептор-ной структуры в составе плазматической мембраны клеток. Формирование последующего внутриклеточного сигнала зависит от того, является ли соответствующий мембранный рецептор функционально активным компонентом, поскольку не все мембранные гликолиганды (гликопротеины и гликолипиды) являются элементами сигнальных систем клеток. 2. Конкурентное связывание родственных по углеводной специфичности иммуноглобулиновых субфракций с рецептором эндогенного лектина. В этом случае возможно как блокирование сигнального ответа клеток, так и активация, в зависимости от свойств антител.
Иммунизация животных лектином, воспроизведение экспериментального гипотиреоза и стресса
Работа выполнена на самцах и самках беспородных белых крыс со средней массой 210 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Раствор лектина ЛИ в физиологическом растворе (0,85% раствор NaCI) животным вводили интраперитонеально. Для разных животных использовали разные концентрации лектина, которые являлись предгемагглютинирующи-ми, и подбирались для мышей и крыс методом агглютинации с трипсинизи-рованными эритроцитами соответствующих животных. У мышей предге-магглютинирующая концентрация лектина составила 0,2 мкг, у крыс - 2 мкг. Мыши обладали большей чувствительностью к данному препарату по сравнению с крысами, что, возможно связано с разной интенсивностью метаболизма, которая у мышей больше, чем у крыс, в силу их разной массы.
В первой серии экспериментов для создания в организме животных (самцов крыс) дефицита йода вводили мерказолил перорально, в объеме 0,5 мл, по 5 мг на животное. Препарат вызывал уменьшение синтеза тироксина в щитовидной железе, ускорял выделение из нее йодидов, угнетал активность ферментативных систем, участвующих в окислении йодидов в йод, что приводило к торможению йодирования тиреоглобулина и задержке превращения дийодтирозина в тироксин (Машковский, 1993). Введение мерказолила осуществлялось в течение трех дней, так как за это время мерказолил нарушает синтез нового гормона, а имеющийся в организме тироксин расходуется за этот период.
По характеру воздействия животных разделили на 6 групп, каждая из которых включала по 10 крыс-самок. 1 группа являлась контрольной, животным вводили интраперитонеально в объеме 0,5 мл физиологический раствор; животные 2 группы получали мерказолил по вышеописанному методу; крысы 3 группы подвергались однократной инъекции лектина интраперитонеально, 4 группы - трем инъекциям препарата лектина периодически, в течение трех суток. Животные 5 и 6 групп соответственно подвергались однократной и пролонгированным инъекциям лектина на фоне параллельного введения мерказолила перорально.
Во второй серии экспериментов у самцов и самок крыс моделировали им мобилизационный стресс путем фиксации животных (с использованием мягкой лигатуры) на спине, в течение 10 минут однократно и периодически -в течение трех суток. По характеру воздействия животные каждого пола были разделены на 7 групп (7 групп самцов, 7 групп самок, по 10 животных в каждой группе): 1 группа - контрольные животные; 2 группа - животные, подвергавшиеся однократному стрессированию; 3 группа - животные, подвергавшиеся периодическому стрессу (в течение трех дней); 4 группа - животные, получившие однократную инъекцию раствора лектина; 5 группа - периодические инъекции раствора лектина (3 суток); 6 группа - однократный стресс через 1 сутки после инъекции лектина; 7 группа - однократный стресс через I сутки после трех инъекций лектина (в течение 3 суток). Отбор крови проводили через 24 часа после последнего введения препарата лектина ЛИ и сразу после стресса. В качестве доноров макрофагов использовали беспородных белых мышей-самцов, весом 18-20г, в возрасте 2-3 месяца. Для изучения влияния лектина на активность процесса фагоцитоза in vitro его добавляли непосредственно в среду культивирования макрофагов и бактерий в дозе 10 мкл в концентрации 0,04 мкг/мл. молекулярной массы
Разделение плазменных белков и определение их молекулярной массы проводили с помощью метода вертикального диск-электрофореза в полиак-риламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом Na (SDS) (Маурер, 1971). Для работы использовали системы из верхнего концентрирующего геля (3%) и нижнего разделяющего градиентного геля с линейным градиентом концентрации акрил амида 6%-»20%. Электрофорез проводили в аппарате «MIGHTY SMALL» SE 250 фирмы «Hoefer Scientific Instruments». По окончании процесса гель фиксировали в 10% растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ), окрашивали 0,2% раствором Coomassie R-250 и заливали отмывающим раствором на 1 сутки. Для определения молекулярных масс использовали белки-маркеры (Serva): бычий сывороточный альбумин (БСА) - 67 кДа, пероксидазу - 40 кДа, химотрипсиноген - 25 кДа, миоглобин - 17,8 кДа.
Проявленные электрофореграммы сканировали, изображения обрабатывали с помощью программы ONE-Dscan, версия 1-3. 2.2,4. Метод электроблотинга Для переноса белков с гелевой пластинки на нитроцеллюлозный фильтр использовали метод электроблотинга (Burnett, 1981). Сущность метода заключается в переносе молекулы исследуемого соединения с одного твердого носителя, используемого для фракционирования биополимеров, на другой, обеспечивающий эффективность их выявления с помощью иммунохимиче-ской реакции. На фильтровальную бумагу (3-5 слоев), смоченную в буфере следующего состава: трис - 3,03г; глицин - 14,4 г; этанол - 200 мл; Н20 - 800 мл; рН=8,3, помещали гелевую пластинку с белковыми полосами, сверху которой накладывали нитроцеллюлозу и несколько слоев фильтровальной бумаги. Такой «сэндвич» зажимали между двумя сетками с поролоном и помещали в прибор для электропереноса, который помещали между электродами (60V, 120 тА; 3 часа). Под действием электрического поля белки мигрировали к аноду и, встречая на своем пути нитроцеллюлозу, адсорбировались на ее поверхности.
Изучение взаимодействия лектина бацилл, конъюгированного с маркером - коллоидным золотом (ИБФРМ РАН), с белками плазмы крови in vitro проводили методом лектинодота на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах "Synpor", 0 пор 1,5цм (ЧССР) (Bogatyrev, 1992). Белки переносили на мембранный фильтр методом электроблотинга (Burnett, 1981). Для предотвращения неспецифической сорбции мембрану инкубировали в растворе следующего состава: PBS (рН 7,2); 0,2% бычий сывороточный альбумин; 1% Твин-20 в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем наносили лектин ЛИ, конъюгированный с маркером - коллоидным золотом (ИБФРМ РАН). Через 12 часов наблюдали окрашивание комплекса антиген-антитело. Идентификацию окрашенных белковых фракций проводили, сравнивая картину с другой половиной исходного геля, зафиксированной и окрашенной Coomassie R-250 по описанному выше методу сразу после электрофореза.
Метод определения активности аминотрансфераз
Для определения активности аспартатаминотрансферазы (ACT) и ала-нинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови применяли кинетический метод ФС «ДДС» ЗАО «Диахим», Принцип метода заключался в том, что ACT катализировала в присутствии а-кетоглутарата переаминирование L-аспартата с образованием оксалоацетата. В присутствии малатдегидрогеназы и оксалоацетата происходило окисление NADH. АЛТ катализировала в присутствии а-кетоглутарата переаминирование L-аланина с образованием пирувата. В этом случае окисление NADH происходило в присутствии лактатдегидрогеназы. Скорость окисления NADH была прямо пропорциональна активности ACT и АЛТ. Реактивы: Реагент 1: буферно-ферментный раствор, содержащий трис — 80 ммоль/л, L-аспартат - 240 ммоль/л, малатдегидрогеназу - 600 Е/л, лактатде-гидрогеназу - 600 Е/л, азид натрия - 0,095%. Реагент 2: Раствор кофактора и субстрата, содержащий NADH - 0,18 ммоль/л, а-кетоглутарат - 12 ммоль/л, азид натрия - 0,095%. Реагент 3: буферно-ферментный раствор содержащий трис-ЮОммоль/л, L-аланин- 500 ммоль/л, лактатдегидрогеназа - 1200 Е/л, азид натрия -0,095%. Реагент 4: Раствор кофактора и субстрата, содержащий НАДН - 0,18 ммоль/л, а- кетоглутарата -15 ммоль/л, азид натрия - 0,095%. Набор обеспечивал линейную область определения активности АЛТ и ACT в диапазоне - от 20 Е/л до 260 Е/л, отклонение от линейности не превышало 5%. Использовали только сыворотку крови без следов гемолиза. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре при длине волны 340 нм, в кювете с длиной оптического пути 10 мм. В 100 мкл сыворотки крови вносили 1000 мкл рабочего реагента, пробу перемешивали и инкубировали в кювете с длиной оптического пути 10 мм при температуре +37С в течение 1 минуты. Измеряли оптическую плотность пробы (Е 1) при длине волны 340 нм против воздуха; точно через 1 минуту аналогично измеряли оптическую плотность пробы (Е2). Рассчитывали изменение оптической плотности пробы за 1 минуту по формуле: ДЕ/мин = Е1-Е2. Активность аминотрансфераз в сыворотке крови определяли по формуле: А =ДЕ/мин -1745, где А - активность AT, Е/л; ДЕ/мин - изменение оптической плотности пробы за 1 мин, единица оптической плотности; 1745 - фактор пересчета для выражения активности AT в Е/л. (1Е/л = 16,67 нмоль/л -с.) Коэффициент Де Ритиса рассчитывали по формуле: КДР = ААСТ/ААЛЬ где КДР - коэффициент Де Ритиса; Адст активность ACT; Адлт - активность АЛТ. 2.2.13. Метод определения концентрации глюкозы в крови Определение содержания глюкозы в крови проводили по методу Е. Hultman (1959). Принцип метода заключался в том, что в присутствии глюкозы пикриновая кислота в щелочном растворе восстанавливалась при высокой температуре в пикраминовую кислоту. Количество образующейся пикрами-новой кислоты измеряли на КФК-3 при длине волны 570 нм в кювете с длиной оптического пути 5,05 мм. Ход определения: В пробирку наливали 1,8 мл дистиллированной воды, добавляли в нее 0,2 мл крови. Затем в пробирку наливали 1 мл 1,2% пикриновой кислоты, тщательно перемешивали и фильтровали в мерную пробирку. К фильтрату добавляли десятикратно меньший объем 20% раствора едкого натрия, нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 минут и после охлаждения измеряли оптическую плотность. Концентрацию глюкозы рассчитывали с помощью построения калибровочной прямой. Метод определения концентрации молочной кислоты в крови В основе метода лежала способность молочной кислоты в присутствии серной, фосфорной кислот и солей меди образовывать уксусный альдегид, который, реагируя с параоксидифенилом, давал окрашенные в фиолетовый цвет продукты реакции. Реакция очень чувствительная, поэтому нужно строго выдерживать все условия выполнения метода. Ход определения: 0,02 мл крови вносили в 1 мл 5% ТХУ, перемешивали и фильтровали. К 0,2 мл безбелкового фильтрата прибавляли 0,1 мл 30% раствора сульфата меди в концентрированной серной кислоте, энергично встряхивали и через 3 минуты помещали в кипящую водяную баню на 3 минуты, затем 3 минуты охлаждали в ледяной воде. Добавляли 50 мкл 1,5% раствора параоксидифе-нила в диметилсульфоксиде, встряхивали и оставляли на 10 минут при ком 55 натной температуре. После этого нагревали на кипящей водяной бане в течение 90 секунд, охлаждали и проводили измерение оптической плотности на КФК-3, при длине волны 565 нм в кюветах с длиной оптического пути 5,075 мм относительно контрольной пробы, в которую вместо безбелкового фильтрата вносили 5% раствор ТХУ. Концентрацию молочной кислоты находили по калибровочной прямой (Barber, Summerson, 1951). Метод определения концентрации общего белка плазмы крови Определение количества белков плазмы крови проводилось с помощью набора реактивов фирмы "Синтакон" для определения общего белка по методу Лоури. В каждую пробирку, содержащую разведения белка для калибровочного графика, добавляли по 2 мл рабочего раствора В. Потом содержимое перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 10 минут для образования биуретовых комплексов. Затем добавляли по 0,2 мл Ш реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивали и оставляли для развития окраски на 30-40 минут. Измерение оптической плотности проводили на КФК-3 при длине волны 750 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно контрольной пробы, не содержащей белка. Концентрацию белка рассчитывали с помощью построения калибровочной прямой.
Исследование специфического взаимодействия лектина ЛИ с белками плазмы крови in vitro
Изучение взаимодействия лектина бацилл, конъюгированного с маркером - коллоидным золотом (ИБФРМ РАН), с белками плазмы крови in vitro проводили методом лектинодота на нитроцеллголозных мембранных фильтрах, куда белки плазмы крови переносили методом электроблотинга. Для предотвращения неспецифической сорбции мембрану инкубировали в растворе следующего состава: PBS (рН 7,2); 0,2% бычий сывороточный альбумин; 1% Твин-20 в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем наносили лектин ЛИ, конъюгированный с маркером - коллоидным золотом (ИБФРМ РАН). Через 12 часов наблюдали окрашивание комплекса антиген-антитело.
При исследовании in vitro специфического взаимодействия лектина ЛИ с белками плазмы крови крыс блот-дот анализ выявил несколько фракций плазменных белков, специфически связывавшихся с лектином. Четкое розовое окрашивание наблюдали в зоне преальбуминов у IV, V, VI белковых фракций с молекулярными массами (м. м.) 24, 50 и 55 кДа соответственно, в зоне альбумина и в XII фракции посттрансферриновой зоны (м. м. = 120 кДа) (рис. 8). Б - белки плазмы крови интактного животного (гель); В - белки плазмы крови, специфически взаимодействующие с лекти-ном (на нитроцеллюлозе) 2.3.3. Изменения активности кислых гидролаз лизосом печени при введении лектина интактным животным и животным с развивающимся гипотиреозом
Функционирование ферментов является основой метаболических процессов организма, складывающихся из совокупности процессов анаболизма и катаболизма, поэтому весьма важно исследовать влияние лектина на ферментативную активность. Баланс процессов анаболизма и катаболизма зависит от гормонального статуса организма животного, в частности, немалую роль в поддержании этого баланса играют гормоны щитовидной железы, тироксин и трийодтиронин. Рядом авторов показано, что гормоны щитовидной железы повышали активность Na+, К+-АТФазы (Калиман, 1985), а-глицеро-фосфатдегидрогиназы (Oppenheimer, 1973), холинэстеразы, щелочной фосфа-тазы, амилазы, аргиназы, а также лизосомальных ферментов - кислой фосфа-тазы и катепсинов (Таракулов, 1963). Повышение активности ферментов под действием тиреоидных гормонов было более заметно в печени (Ganglofif, Orten, 1960). Активность кислых гидролаз лизосом, в частности, кислой фос-фатазы и катепсинов, характеризовала скорость протекания реакций катаболизма в клетках. В случае низких доз гормонов преобладали реакции анаболизма, при введении же на фоне гипотиреоза доз гормонов щитовидной железы наблюдался эффект увеличения активности кислых гидролаз (Рачев, Ещенко, 1975). Увеличение активности этих ферментов свидетельствовало об интенсификации катаболизма. В связи с этим немаловажно выяснить, какой эффект оказывает на их активность у животных с недостатком тиреоидных гормонов лектин ЛИ.
Изучение активности ферментов печени крыс показало, что введение мерказолила в течение трех дней не приводило к изменению активности кислых гидролаз, что в некоторой степени противоречит литературным данным. Это, вероятно, объясняется кратковременным дефицитом тиреоидного гормона в организме, не вызывавшим изменений ферментной активности кис 77 лых гидролаз.
Однократное введение лектина вызывало достоверное увеличение активности кислой фосфатазы по сравнению с контрольной группой (19,15+1,89 мкгР/г ткани - после введения лектина; 12,9+0,83 мкгР/г ткани -после введении физиологического раствора); после пролонгированного введения препарата активность этого фермента возросла в 2,5 раза и составила 32,3±3,03 мкгР/г ткани (рис. 9).
Изучение активности катепсинов печени крыс показало, что ни однократное, ни пролонгированное введение лектина не вызывало достоверного изменения ферментной активности (рис. 10). При однократном введении лектина на фоне экспериментального гипотиреоза было зафиксировано достоверное увеличение активности катепсинов (0,009±0,00011 ДЕгзс/г-мин) по сравнению с контрольной (0,00173±0,00016 ДЕгвс/г-мин). При пролонгированном воздействии лектина активность катепсинов соответствовала контрольной (см. рис. 10).
Как видно из рисунка 9, активность фосфатазы после однократного введения лектина животным с развивающимся гипотиреозом немного увеличивалась; при введении крысам лектина в течение трех суток активность кислой фосфатазы резко возрастала (41,85±4,02 мкгР/г ткани) по сравнению с контрольной (12,9 ±0,83 мкгР/г ткани).
Таким образом, при однократной инъекции лектина на фоне гипотиреоза активность катепсинов по сравнению с контрольной увеличивалась в 5 раз, а активность кислой фосфатазы почти не изменялась. При более продолжительном воздействии лектина на животных с экспериментальным гипотиреозом активность кислой фосфатазы возрастала в три раза по сравнению с контрольной, активность же катепсинов соответствовала контрольной. Можно предположить, что мы наблюдали эффект увеличения активности кислых гидролаз под действием бактериального лектина на фоне гипотиреоза. Такой же эффект оказывают высокие дозы гормонов щитовидной железы (Рачев, Ещенко, 1975).
