Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 8
Антисмысловые олигонуклеотиды и их производные -потенциальные средства борьбы с патогенными микроорганизмами 8
1.1. Введение 8
1.2. Структура, химический состав и функции клеточной стенки прокариот.. 9
1.3. Барьерные функции клеточных стенок бактерий 15
1.3.1. Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий 15
1.3.2. Мшобактериаяьная клеточная стенка 19
1.4. Методы доставки антисмысловых олигонуклеотидов и их производных в клетки бактерий 21
1.4.1. Использование липосом в качестве средства доставки олигонуклеотидов 22
1.4.2. Использование пик и пептид-пнк конъюгатов для подавления роста бактериальных клеток 25
1.4.3. Доставка олигонуклеотидов и их производных в клетки микобактерий. 33
1.5. Выбор рнк-мишеней для подавления роста и жизнедеятельности бактерий с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и их производных 37
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Материалы 43
2.2. Олигонуклеотиды 44
2.3. Методы 45
2.3.1. Введение 32р метки по 5'-концевому положению олигонуклеотидов 45
2.3.2. Модификация днк диэтилпирокарбонатом 45
2.3.3. Модификация днк кмпо4 46
2.3.4. Гидролиз днк эндонуклеазой s1 47
2.3.5. Гидролиз днкрестриктазой ватш 47
2.3.6. Фотомодификация днк-мишени 48
2.3.7. Получение рнк с помощью реакции транскрипции in vitro 48
2.3.8. Выделение рибосом ирибосомных субчастиц из м. Smegmalis и е. Col:... 50
2.3.9. Гибридизация опигонуклеотидов с рнк-транскриптом 51
2.3.10. Гибридизация опигонуклеотидов с 23sррнкв составе рибосом и рибосомных субчастиц 51
2.3.11. Синтез дипептида phe-phe на рибосомах 52
Глава 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Структурная подвижность шпилечного днк-элемента, расположенною в u3 области длинных концевых повторов 1731 ретротранспозона drosophila melanogaster 53
3.1.1. Исследование вторичной структуры фрагментов вс и комплементарного ему впс 54
3.1.2. Анализ структуры вс с помощью макроциклов, созданных на основе акридина 62
3.2. Исследование влияния образования комплексов олигонуклеотидов со шпилечной днк-мишенью на структурную организацию и функционирование близлежащих областей днк 68
3.2.1. Антисмысловые олигонуклеотиды модулируют расщепление комплекса 69t-ol7рестриктазой ватш 71
3.2.2. 3 '-область 69т-мишени взаимодействует с ее 5 '-областью 75
3.2.3. Комплекс ol1-69t-ol 7 образуется с участием несовершенных триплексов 77
3.2.4. 5 '-область ol5 взаимодействует с мишенью 69т 83
3.3. Повышение специфичности связывания антисмысловых олигонуклеотидов при использовании в качестве мишени рнк-шпилек 88
3.3.1. Олигонуклеотиды способны специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23spphkm. Tuberculosis 88
3.3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с 70s рибосомами м. Smegmatis и е. Coli, и влияние их на функциональную активность рибосом 95
Выводы 99
Список литературы 101
- Методы доставки антисмысловых олигонуклеотидов и их производных в клетки бактерий
- Модификация днк диэтилпирокарбонатом
- Исследование вторичной структуры фрагментов вс и комплементарного ему впс
- Олигонуклеотиды способны специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23spphkm. Tuberculosis
Введение к работе
Важной задачей современной молекулярной биологии является создание методов регуляции биологических процессов в исследовательских и терапевтических целях. Одним из наиболее перспективных подходов к решению этой задачи является направленное воздействие на выбранные участки нуклеиновых кислот с помощью олигоиуклеотидов и их производных [1-4], а также низкомолекулярных лигандов, способных распознавать определенные структуры молекул ДНК или РНК [5-7]. Синтез различных аналогов олигоиуклеотидов, устойчивых к действию нуклеаз [8,9], создание коныогатов олигоиуклеотидов с поликатионными или гидрофобными лигандами, облегчающими их проникновение в клетку [10,11], значительно расширили возможности применения Щі олигонуклеотидов в качестве ген-направленных агентов и инструмента для молекулярно- биологических исследований. В то же время, выбор в составе молекул ДНК и РНК оптимальных мишеней для воздействия олигонуклеотидов остается актуальной задачей и на сегодняшний день.
Так как, в составе природных нуклеиновых кислот практически отсутствуют открытые участки [12], фактическими мишенями для связывания олигонуклеотидов служат некоторые элементы вторичной структуры ДНК- и РНК-молекул. Наиболее ^ перспективными мишенями для регуляции функциональной активности нуклеиновых кислот с помощью олигонуклеотидов представляются шпилечные структуры, петлевые участки которых доступны для образования комплексов с олигонуклеотидами. Кроме того, некоторые шпильки являются функционально значимыми элементами нуклеиновых кислот, поскольку служат местами связывания регуляторных белков [13-15], а конформационные перестройки шпилечных участков часто лежат в основе природной регуляции биологических процессов [16].
При выборе области природной нуклеиновой кислоты, доступной для связывания с олигонуклеотидами, необходимо иметь полную информацию о строении и функциональной значимости конформационных состояний потенциальной мишени, а также о факторах, которые могут вызывать ее структурную реорганизацию. Следует учитывать и то, что взаимодействие с олигонуклеотидами вызовет изменение структуры мишени не только в области комплексообразования, но и с большой вероятностью будет инициировать перестройки в близлежащих областях нуклеиновой кислоты, что в свою очередь может привести к изменению их функциональной активности.
При конструировании олигонуклеотидов для экспериментов in vivo необходимо, кроме других факторов, оптимизировать соотношение эффективности и специфичности их взаимодействия с мишенью. Следует учитывать, что стандартные методы, используемые для повышения специфичности связывания олигонуклеотидов на модельных ДНК или РНК, не всегда оказываются применимы для природных молекул, имеющих сложную пространственную структуру.
Наряду с олигонуклеотидами, способными с высокой степенью специфичности взаимодействовать с мишенью, существует большое количество химических лигандов, распознающих и стабилизирующих определенные элементы вторичной структуры нуклеиновых кислот. Такие химические соединения могут быть использованы как в качестве реагентов для исследования структуры нуклеиновых кислот, так и для биотехнологических целей.
Целью настоящей работы являлось изучение функционально значимых шпилечных структур нуклеиновых кислот как потенциальных мишеней для связывания олигонуклеотидов и анализ изменений в структуре и биологической активности ДНК- и РНК-шпилек, происходящих при связывании с ними олигонуклеотидов.
Входе исследования решались следующие задачи: изучение возможных конформаций фрагмента ДНК, являющегося сайтом связывания регуляторного белка NssBF и входящего в состав U3 области длинных концевых повторов ретротраиспазона 1731 Drosonhila melanogaster, а также факторов, влияющих на структурные перестройки этого фрагмента; исследованние влияния комплексообразования олигонуклеотидов с ДНК на структурную организацию и биологическую активность близлежащих областей ДНК, не вовлеченных непосредственно в образование комплексов; вьывление олигонуклеотидов, способных специфически связываться с областью а-сарциновой петли 23S рРНК М. tuberculosis.
Методы доставки антисмысловых олигонуклеотидов и их производных в клетки бактерий
Олигонуклеотиды являются полианионами, что затрудняет их прохождение через клеточные стенки бактерий. Существуют различные методы доставки олигонуклеотидов в бактериальные клетки: электропорация, использование липосом, а также введение в структуру олигонуклеотидов различных модификаций и использование их совместно с соединениями, изменяющими проницаемость клеточной стенки.
Электропорация является эффективным методом трансформации бактерий плазмидами и ДНК [50,51], но применима в основном только в лабораторных исследованиях. В основе электропорации лежит воздействие электрическим током на клеточные мембраны для увеличения их проницаемости. О механизмах проникновения в клетку ДНК в процессе электропорации известно очень мало. По-видимому, в результате электрошока в клеточной стенке образуются временные поры, через которые ДНК и проходит в клетку.
Рассмотрим более подробно методы доставки олигонуклеотидов в бактериальные клетки, которые могут быть применимы как для молекулярно-биологических исследований, так, возможно, в дальнейшем могут быть использованы и для создания ген-направленных терапевтических препаратов.
Липосомы - полые частицы, содержимое которых ограничено липидной мембраной. Они относятся к обширному семейству везикулярных (пузырьковых) структур, образуемых амфифильными молекулами (рис. 7) [52].
Неполярные цепи
В середине 60-х годов английский ученый Алек Бэнгхем показал, что неорганические ионы, присутствующие в растворе в момент набухания фосфолипидов, включаются внутрь этих частиц и удерживаются там длительное время, обмениваясь с ионами наружного раствора с очень малой скоростью [53]. Так впервые было установлено, что фосфолипиды, являющиеся основными компонентами клеточных мембран, способны самопроизвольно образовывать в воде замкнутые мембранные оболочки. Эти оболочки захватывают в себя часть окружающего водного раствора, а образующая их фосфолипидная мембрана обладает свойствами полупроницаемого барьера, легко пропускающего воду, но препятствующего диффузии растворенных в ней веществ. Вещества, обладающие зарядом, например, олигонуклеотиды, также способны захватываться во внутреннее пространство липосом. При смешивании олигонуклеотидов с липидами формируется конденсированная структура (олигонуклеотиды, заключенные в липосомы), способная легко проникать внутрь клетки [54]. Все липосомы можно разделить на три вида - положительно заряженные, отрицательно заряженные и незаряженные. В ряде работ был проведен сравнительный анализ эффективности доставки в бактериальную клетку лекарственных веществ липосомами с различным зарядом [55-57]. В работе Ох с соавторами [55] на примере Mycobacterium avium было показано, что отрицательно заряженные липосомы, содержащие ципрофлоксацин, имеют повышенные показатели проникновения в клетку и эффективности воздействия антибиотиков по сравнению с аналогичными показателями для незаряженных липосом. Это соответствует результатам, полученным в работах [58,59], где было показано, что скорость проникновения в клетку отрицательно заряженных липосом на несколько порядков выше, чем незаряженных липосом, Напротив, в работах [56,57] установлено, что Щ, концентрация незаряженных липосом, содержащих антибиотик, необходимая для подавления Chlamydia trachomatis, ниже, чем концентрация анионных и катионных липосом. Такое отличие в эффективности проникновения липосом с различным зарядом в бактериальные клетки может быть объяснено различиями в строение клеточных стенок бактерий, используемых в экспериментах. Проникновение с помощью липосом ДНК и олигонуклеотидов в клетки Е. colt было изучено в работе [60]. В качестве средства доставки были использованы отрицательно заряженные липосомы (анионные), поскольку они имеют ряд преимуществ перед положительно заряженными липосомами (катионными). Во-первых, катионные липосомы обладают значительной токсичностью [61-64], что может быть обусловлено их влиянием на заряд клеточной мембраны и, как следствие, на активность ионных каналов, мембранных рецепторов и ферментов [65]. Во-вторых, возможно, из-за недостаточного количества освобожденной из комплекса плазмидной ДНК [66],[67] комплекс катионных липосом с ДНК характеризуется низким уровенем экспрессии трансгенной-ДНК [68,69]. Анионные липосомы, использованные в работе [60], были приготовлены из синтетических фосфолипидов дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) и димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG) в молярном соотношение 10:1. Было показано, что процент захвата ДНК и свободных олигонуклеотидов липосомами составляет 49% и 43%, соответственно. Методом проточной цитометрии было определено количество проникнувших в клетки олигонуклеотидов, меченных FITC (флуоресцеин-изотиоцианатом). Для олигонуклеотидов, заключенных в липосомы, этот показатель составлял 57% от начального количества (где 100% - общее количество олигонуклеотидов, заключенных в липосомы, используемых в эксперименте), а для свободных олигонуклеотидов только 9%. Для демонстрации активности анти-ZtfcZ олигонуклеотидов после их попадания в бактериальные клетки были проведены эксперименты по подавлению экспрессии (І-галактозидазы, для чего был использован штамм E.coli CSH36, отличающийся большим количеством производимой р-галактозидазы [60]. Во избежание деградации олигонуклеотидов эндонуклеазами были использованы фосфоротиоатные аналоги олигонуклеотидов. Полученные результаты подтверждают более высокую эффективность фосфоротиоатных олигонуклеотидов, заключенных в липосомы: использование контрольных немодифицированных олигонуклеотидов не приводило к изменению уровня экспрессии гена, в то время, как использование заключенных в липосомы фосфоротиоатных жш-lacZ олигонуклеотидов приводило к концентрационно-зависимому подавлению синтеза р-галактозидазы, где максимальный уровень подавления достигал 45%. В тоже время, подавление синтеза неполностью комплементарными олигонуклеотидами, заключенными в липосомы, составляло лишь 8%. Таким образом, было доказано, что анти-lacZ антисмысловые олигонуклеотиды не только проникают внутрь бактериальной клетки, но и взаимодействуют со своей мРНК-мишенью.
Модификация днк диэтилпирокарбонатом
Введение Р метки по 5 -концу олигонуклеотидов проводили по стандартному протоколу [159]. Реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 100 пмоль олигонуклеотида, 2 мкл буфера (х10) для киназной реакции, 100 пмоль [у-32Р]АТР (уд. акт. 4000 Ки/ммоль) инкубировали 30 мин с 10-20 ед. акт. Т4-полинуклеотидкиназы при 37С. После электрофоретической очистки в денатурирующих условиях в 20% ПААГ меченые олигонуклеотиды выделяли электроэлюцией в ячейках ("Isko", США) в течение 20 мин при напряженности электрического поля 20 В/см в буфере (0.005 М Трис-борат, рН 7.4) на ДЕАЕ бумагу. С ДЕАЕ бумаги [5 - Р]-меченые олигонуклеотиды смывали 2 М раствором ЫСЮ4, после чего осаждали ацетоном, Осадок сушили в вакуумном эксикаторе и растворяли в 50 мкл деионизованной воды.
Модификация 69Т. Реакционную смесь объемом 10 мкл, содержащую [5 - Р]-меченый 69Т (5 10"g М) в 50 мМ Na-ацетатном буфере, рН 6.0, ЮмМ MgCh предынкубировали в присутствии или в отсутствие антисмысловых олигонуклеотидов в течение 30 мин при 15С, добавляли DEPC (10% от общего объема) и инкубировали 90 мин при 25С. По окончании инкубации смесь дважды экстрагировали эфиром, к водной фаче добавляли 2 мкл ДНК-носителя (бмг/мл), осаждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в 18 мкл воды, добавляли 2 мкл пиперидина и инкубировали в течение 10 мин при 100С. Продукты расщепления после обработки пиперидином переосаждали этанолом в присутствии ДНК-носителя и анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 20% ПААГ.
Модификация Вс. В случае [5 - Р]-меченого Вс (1x10М)объем реакционной смеси составлял 10 мкл, предынкубацию проводили в 30 мМ какодилатном буфере, рН 6.0, содержащем 100 мМ КС1 или 10 мМ MgCb (или 0.5 мМ EDTA в контрольных экспериментах) в течение 30 мин при 20С. Инкубацию с DEPC (10% от общего объема) проводили в течение 40 мин при 20С. В дальнейшем осаждение и анализ проводили, как описано для 69Т,
Модификация OL5. Реакционную смесь объемом 10 мкл, содержащую [5 -32Р]-меченый OL5 в 50 мМ Na-ацетатном буфере, рН 6.0, содержащем 10 мМ MgCh предынкубировали в присутствии или в отсутствие 69Т и антисмысловых олигонуклеотидов в течение 30 мин при 15 С, добавляли КМп04 (конечная концентрация 15 мг/л) и инкубировали 15 мин при 20С. По окончании инкубации к реакционной смеси добавляли 2 мкл ДНК-носителя (6 мг/мл), осаждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в 18 мкл воды, добавляли 2 мкл пиперидина и инкубировали в течение 10 мин при 100С. Продукты расщепления после обработки пиперидином переосаждали этанолом в присутствии ДНК-носителя и анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 20% ПААГ,
Модификация Вс и Впс. В случае [5 - Р]-меченого Вс (1x10 М) или Впс(1х10-М) объем реакционной смеси составлял 10 мкл, предынкубацию проводили в 30 мМ какодилатном буфере, рН 6.0, содержащем 100 мМ КС1 или 10 мМ MgCb (или 0.5 мМ EDTA в контрольных экспериментах) в течение 30 мин при 20С. Инкубацию с КМпОд (конечная концентрация 15 мг/л) проводили в течение 10 мин при 20С, В дальнейшем осаждение и анализ проводили, как описано для OL5.
Гидролиз [5 - Р]-меченого Вс-фрагмента эндонуклеазой S1 проводили в 10 мкл 30 мМ какодилатного буфера, рН 6.0, содержащего 100 мМ КС1, 1х 10" М Вс-фрагмент и S1 нуклеазу в концентрации 1 е.а./мкл. Реакционную смесь инкубировали 10-30 мин при 37С. Продукты расщепления анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 20% ПААГ.
Пробу объемом 10 мкл, содержащую [5 - Р]-меченого 69Т (5 10 М) в 50 мМ Na-ацетатном буфере, рН 6.0, содержащем 10 мМ MgCk предынкубировали в течение 30 мин при 20С в присутствии 3 10"5 М OL7 и в присутствии или в отсутствие антисмысловых олигонуклеотидов. Расщепление комплекса 69T-OL7 рестриктазой BamHI (0.3 е.а./мл) проводили в течение 20 мин, 60 мин и 120 мин при 20С. Продукты расщепления анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 20% ПААГ. %
Пробу объемом 10 мкл, содержащую [5 -32Р]-меченый Вс-фрагмента (5 10 6М) в 30 мМ какодилатном буфере, рН 6.0, содержащем 100 мМ КС1 предынкубировали в присутствии Мс (5 10" М) в течение 16 ч при 20С. Облучение Вс в присутствии и в отсутствие бис-акридинового (Mel) и трис-акридинового (Мс2) макроциклов проводили конденсированным светом ртутной лампы ДРК-120 осветителя ОИ-18А (ЛОМО, Санкт-Петербург) через стеклянный светофильтр БС7 (ктах - 365 нм, W- 11.5 мВт/см2) в течение 20 мин при 20С. После облучения ДНК осаждали этанолом в присутствии ДНК-носителя (1 мг/мл). Осадок ДНК растворяли в 18 мкл воды, добавляли 2 мкл пиперидина и инкубировали в течение 10 мин при 100С. Продукты расщепления ДНК после обработки пиперидином переосаждали этанолом в присутствии ДНК-носителя и анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 20% ПААГ.
Исследование вторичной структуры фрагментов вс и комплементарного ему впс
В состав фрагмента Вс входит последовательность TGTATG и три комплементарных ей, частично перекрывающихся последовательности САТАСА, что делает возможньгм формирование нескольких альтернативных шпилечных структур. Эти предполагаемые шпильки могут содержать 4, 8 или 12 нуклеотидов в петле, соответственно.
Для определения структуры Вс-фрагмента была проведена его химическая модификация диэтилпирокарбонатом (маркирующая одноцепочечные пурины) и перманганатом калия (маркирующая одноцепочечные тимидины), а также ферментативный гидролиз Sl-нуклеазой (расщеплению подвергаются одноцепочечные участки). Реакции проводили в какодилатном буфере (рН 6.0), содержащем 100 мМ КС1 (в контрольных экспериментах 0.5 мМ EDTA). Картина электрофоретического разделения продуктов модификации DEPC и КМп04 [5 -32Р] -меченого Вс после расщепления пиперидином представлена на рисунке 10. Из рисунка 10.А видно, что основания G9, Ац, Gn и Агз полностью защищены от модификации DEPC и, следовательно, находятся в двуцепочечном состоянии. Модификация оснований - Ан, Gis, Аіб и Ап усиливается по сравнению с контролем (модификация Вс-фрагмента DEPC в присутствии EDTA), что свидетельствует о наиболее вероятном нахождении их в петле шпильки. Основания Ащ, А21, А25, и А27 частично защищены от модификации, что, по-видимому, является следствием того, что в одной из существующих конформаций они находятся в одноцепочечном участке. От модификации КМ11О4 полностью защищены основания Т] Т]2 и частично защищены основания Tg,T2o (рис. 10.Б).
Таким образом, можно говорить о том, что область G9-G13 Be количественно защищена от модификации, область А19-А27 защищена частично, за исключением Агз, который защищен от модификации количественно, а область Ан-Ап подвержена гипермодификации. Эти данные свидетельствуют о существовании в растворе двух равновесных структур. Схематическая картина модификации DEPC, КМПО4 и гидролиза Sl-нуклеазой Вс-фрагмента, а также предположительные структуры Вс представлены на рисунке 11.
Из данного рисунка видно, что среди нуклеотидов 3 -области Вс только А2з (защищенный от модификации DEPC количественно) входит в состав стебля шпильки обеих структур.
Частичная защита от модификации оснований А19, Т20, А21, Т24. А25 и А27 свидетельствует о том, что в условиях данного эксперимента Вс существует в виде двух равновесных структур, содержащих 6 пар оснований в стебле и 8 или 4 нуклеотида в петле шпильки, и основания А19, Т20, А21, Т24, А25 и А27 находятся в связанном виде только в составе одной из этих структур.
Несмотря на явно выраженную комплементарность 5 -области Вс ее З -концу, дуплекса между ними не образуется, что видно из картины модификации Вс-фрагмента DEPC и КМпС 4 : нуклеотиды А.2, Т_ь Тг, Аз и Т5-Т7 маркируются как одноцепочечные, а Те как частично одноцепочечный, по-видимому, как последнее основание стебля шпильки (рис. 10.А, Б). Существование 5 -области Вс в одноцепочечном виде подтверждается также анализом продуктов гидролиза Вс нуклеазой SI: наблюдается сильное расщепление по Gi. К сожалению, эта точка расщепления расположена близко к 5 -концу, и расщепление остальной части молекулы Вс практически не детектируется. Можно только сказать, что в этой "невидимой" области предпочтительно идет расщепление по Аіб, An, находящимся в петле шпильки (данные представлены схематически на рис. 11).
Такая подвижность структуры Вс может быть объяснена тем, что TGTATG-участок связывается с двумя перекрывающимися повторами САТАСА, формируя две альтернативные шпильки с 4-мя и 8-ю основаниями в петле. Нельзя исключить, что существуют и дополнительные структуры, которые, однако, не выявляются с помощью методов химического и ферментативного пробинга.
Были проведены эксперименты по химической модификации Вс в присутствии ионов К+ при различных рН. Оказалось, что при рН 4.0 модификация Вс КМпОч, выявленная с помощью пипередин-зависимого расщепления, протекает достаточно равномерно по всем остаткам тимидина. Из полученных результатов можно сделать вывод, что при кислых рН шпилечная структура Вс менее стабильна, чем при рН 6.0. Результаты экспериментов, проведенных при рН 8.0 (данные не приведены) свидетельствуют о том, что в этих условиях равновесие между двумя Вс-шпильками сдвинуто в сторону шпильки вида II, содержащей в петле 4 нуклеотида (рис. 11).
Олигонуклеотиды способны специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23spphkm. Tuberculosis
Известно, что взаимодействие олигонуклеотидов с областью а-сарциновой петли рРНК может ингибировать трансляцию и подавлять рост клеток Е. coli [72,199]. Однако, последовательность а-сарциновой петли относится к высококонсервативным последовательностям РНК, что затрудняет выбор олигонуклеотидов, специфично связывающихся с данной областью рРНК конкретного микроорганизма. Для повышения специфичности связывания антисмысловых олигонуклеотидов могут быть использованы особенности пространственной структуры РНК-мишени. На основании этого, для связывания олигонуклеотидов был выбран участок, входящий в состав стебля шпильки в области а-сарциновой петли 23 S рРНК М. tuberculosis.
Взаимодействие антисмысловых олигонуклеотидов с областью а-сарциновой петли 23S рРНК изучали, используя в качестве модели 171-звенный фрагмент 23S рРНК Ы. tuberculosis (участок 2625-2795) (нумерация нуклеотидных остатков приведена no 23S рРНК Е. соїї] [200], полученный реакцией транскрипции in vitro (рис. 26). В качестве контроля во всех экспериментах был использован аналогичный фрагмент 23 S рРНК Е. coli, поскольку последовательности этих рРНК в области а-сарциновой петли различаются только в 3 положениях из 27.
Ранее было показано, что олигонуклеотид, комплементарный участку 2659-2672 23S рРНК Е. coli, эффективно связывается с этой рРНК в физиологических условиях [201]. Мы предположили, что олигонуклеотид, комплементарный гомологичному участку в 23S рРПК М. tuberculosis (ONI), также будет проявлять высокую эффективность взаимодействия со своей РНК-мишенью.
Существует ряд подходов для конструирования олигонуклеотидов, обладающих повышенной избирательностью связывания: использование коротких олигонуклеотидов, способных образовывать тандемный дуплекс, который характеризуется повышенной селективностью связывания по сравнению с полноразмерным дуплексом [202-204]; использование олигонуклеотидов, способных образовывать внутримолекулярные шпильки [205,206], а также использование олигонуклеотидов, направленных на участки, частично занятые в образовании вторичной структуры нуклеиновых кислот [207,208]. В данной работе была осуществлена попытка использовать все эти подходы для выбора олигонуклеотидов, способных специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23S рРНК М. tuberculosis.
Участки связывания олигонуклеотидов ON3 (2657-2666) и ON4 (2667-2674) прилегают друг к другу. При гибридизации ON3 и ON4 с 23 S рРНК ожидалось образование тандємного дуплекса, который, предположительно, должен ON 2 повышенной селективностью связывания по сравнению с полноразмерным дуплексом (ON1). Область связывания (2661-2674) ON2 сдвинута на 2 нуклеотида в сторону стебля шпильки, что должно способствовать повышению избирательности связывания этого олигонуклеотида по сравнению с ON1. При этом, нуклеотиды в ON2 и ON4, некомплементарные гомологичному участку 23S рРНК Е. coli, располагаются дальше от 5 -конца олигонуклеотидов (по сравнению с контрольным ON1), что также может способствовать повышению селективности их связывания. ON5 сконструирован таким образом, что его З -конец способен формировать внутримолекулярную шпильку с образованием двух G-C и одной А-Т пары в стебле шпильки и тстра-Т петлей. Предполагалось, что наличие такой структуры внесет дополнительный вклад в повышение специфичности связывания к имеющимся на 5 -конце OL5 некомплементарным 23S рРНК Е. coli основаниям.
Взаимодействие олигонуклеотидов с равномерно меченными фрагментами рРНК М. tuberculosis и Е. coli исследовали в физиологических условиях с помощью метода задержки в геле (рис. 27). Из данного рисунка видно, что олигонуклеотиды образуют с рРНК М. tuberculosis и Е. coli только один комплекс. На основании этих данных, а также результатов, представленных в работе [201], где с помощью РНКазы Н были проанализированы сайты гибридизации олигонуклеотидов с 171-звенным фрагментом 23S рРНК Е. coli, и показано, что олигонуклеотид, комплементарный участку 2659-2672 23 S рРНК Е. coli, связывается только непосредственно с областью а-сарциновой петли, можно сделать вывод о селективности связывания используемых нами олигонуклеотидов ONIONS с комплементарными им сайтами рРНК. рРНК (1 xlOs М) инкубировали с олигонуклеотидами, варьируя их концентрацию от 0.01 мкМ до 10 мкМ. Из зависимостей предельной степени связывания от концентрации олигонуклеотидов были определены значения термодинамических констант ассоциации Кд(Табл. 1).
Похожие диссертации на Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов
![Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена](/i/i/4712/570538.png "Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена Чанышев Михаил Дамирович")
