Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Формы сбалансированности рационов по незаменимым аминокислотам
1.2. Головной мозг — регулятор пищевого поведения животных ... 13
1.2.1. Действие разных форм баланса аминокислот на экс- прессию генов в нейронах головного мозга...15
1.3. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов у животных 20
1.3.1. Факторы стабильности структуры молекулы мРНК 23
1.4. Аминокислоты как сигнальные вещества экспрессии генов... 28
1.4.1. Экспрессия генов при безбелковом, низкобелковом и несбалансированном по аминокислотам питании 31
1.4.2. Действие избытка белка и аминокислот на экспрессию генов 36
1.4.2.1. Транспортные системы аминокислот 40
1.5. Методы определения стабильности мРНК 42
1.6. Заключение по литературному обзору 45
2. Собственные исследования 46
2.1. Цель и задачи исследований 46
2.2. Материалы и методы исследований 46
2.2.1. Изучение действия имбаланса лизина и триптофана на аппетит, рост белых крыс, концентрацию и стабильность мРНК. 1 -й, 2-й и 3-й опыты 47
2.2.2. Изучение действие имбаланса лизина и триптофана и баланса аминокислот на уровне «идеального» белка на аппетит, рост, стабильность мРНК у свиней 53
2.2.3. Методы определения количества и стабильности мРНК 58
2.2.3.1. Выделение суммарной РНК 58
2.2.3.2. Выделение суммарной мРНК и определение индекса стабильности методом аффинной хроматографии на поли (У)-сефарозе 59
2.2.3.3. Определение молекул мРНК с длинными и 60 короткими поли(А) последовательностями .
2.2.3.4. Определение концентрации и индекса ста- бильности eEF-la мРНК с-тус мРНК методом гибридизации радиоактивно меченых олигодезоксирибонуклеотидных зондов на колонке с поли (У) сефарозой 61
3.Результаты 63
3.1. Действие разных форм баланса незаменимых аминокислот на физиолого-биохимические показатели белых крыс 63
3.1.1. Потребление корма и рост животных, 1-й и 2-й опыты 63
3.1.2. Содержание белка в тушке, печени и сыворотке крови, переваримость и отложение азота 65
3.1.3. Концентрация и стабильность суммарной мРНК, eEF- la мРНК в печени крыс 68
3.2. Действие баланса и имбаланса лизина и триптофана на аппе- тит, рост и стабильность eEF-1 а мРНК и с-тус мРНК в печени и мозге белых крыс. 3-й опыт 72
3.3. Действие баланса аминокислот на уровне «идеального» белка и имбаланса лизина и триптофана на аппетит, рост и количество мРНК с длинными и короткими поли (А) последовательностями у свиней 77
3.3.1. Потребление корма, рост свиней 77
3.3.2. Переваримость кормов и отложение азота 79
3.3.3. Полиаденилирование суммарной мРНК печени сви- ней 80
3.3.4 Морфологические и биохимические показатели крови 81
4. Обсуждение результатов 83
5. Выводы 93
6. Предложения 94
Список литературы 95
- Головной мозг — регулятор пищевого поведения животных
- Действие избытка белка и аминокислот на экспрессию генов
- Цель и задачи исследований
- Действие разных форм баланса незаменимых аминокислот на физиолого-биохимические показатели белых крыс
Введение к работе
Сбалансированное по незаменимым аминокислотам питание, является одним из наиболее значимых условий хорошего роста и здоровья животных. Различают несколько форм сбалансированности рационов по незаменимым аминокислотам: недостаток одной или нескольких аминокислот (дефицит), баланс (все незаменимые аминокислоты обеспечены на уровне норм потребности), имбаланс (острый недостаток одной на фоне избытка остальных; избыток 2-ой или 3-ей лимитирующих аминокислот на фоне недостатка первой лимитирующей аминокислоты); антагонизм (лизин — аргинин), и токсичность [18,77].
Имбаланс - наиболее сложная форма, так как его трудно бывает предвидеть по содержанию аминокислот в рационе. Основными признаками им-баланса являются плохой аппетит. Животные отказываются поедать корм, и как следствие этого, у них снижается продуктивность, возрастают затраты корма на единицу продукции [21].
В практике животноводства часто приходится сталкиваться со случаями дефицита и имбаланса незаменимых аминокислот в рационах животных. Так при кормлении поросят, цыплят по монозерновым рационам из злаковых культур - кукурузы, пшеницы, ячменя, сорго - наблюдаются признаки, характерные для дефицита и имбаланса аминокислот, а именно, плохой аппетит, низкую продуктивность, высокий отход молодняка. Признаки имбаланса проявляются при неправильном применении препаратов синтетических аминокислот, когда их добавляют в рацион без учета степени их лимитированно-сти [4, 19]. Поэтому изучение природы имбаланса и разработка способов его преодоления имеет как научное, так и практическое значение. В этом плане определенный интерес представляет раскрытие молекулярных механизмов регуляции биосинтеза белка и пищевого поведения животных при балансе и имбалансе аминокислот.
Исследованиями отечественных и зарубежных ученых установлено, что при имбалансе резко снижается концентрация лимитирующей аминокислоты в плазме крови и определенных структурах мозга и, что этот фактор является сигналом отказа животных от имбаланснои диеты [87, 88, 102]. Когда животным на диете с имбалансом вводили раствор лимитирующей аминокислоты в кровь или мозг, то потребление корма восстанавливалось до уровня контроля [67, 68]. При этом было выявлено, что при имбалансе подавляется экспрессия гена фактора инициализации трансляции eEF-2a в мозге, что в свою очередь, приводило к снижению синтеза регуляторных белков и некоторых нейропептидов, ответственных за пищевое поведение животных [70].
Интенсивность биосинтеза белков в органах и тканях животных связывают с количеством мРНК. Однако в ряде исследований было установлено, что, несмотря на плохой рост крыс на рационах с имбалансом незаменимых аминокислот, уровни суммарной РНК, в расчете на единицу сырой массы печени и мускулов, не отличались от таковых у хорошо растущих животных на скорректированных по всем аминокислотам до норм потребности рационах. Уровни суммарной матричной РНК в ряде случаев также были близкими, а при имбалансе триптофана даже выше, чем на скорректированном рационе [19]. В опытах на цыплятах также отмечено отсутствие прямой зависимости между ростом и уровнем суммарной РНК и мРНК печени [28, 86].
Скорость транскрипции РНК, определяемая отношением РНК/ДНК, в печени животных при имбалансе и скорректированном по аминокислотам рационах оказывались на одинаковом уровне. Вместе с тем, вероятная трансляционная активность, измеряемая количеством отложенного азота (белка) в расчете на мг РНК, как правило, была существенно выше у крыс на скорректированных рационах. Обнаруженные противоречия вызвали необходимость изучения действия разных форм баланса аминокислот, не только на количественные показатели общей РНК, но и на экспрессию специфических генов, определяющих биосинтез белка в клетках.
Цитоплазматическая матричная РНК (мРНК) является центральным звеном как переноса генетической информации из ядра в цитоплазму, так и белоксинтезирующей системы, осуществляющей реализацию этой информации путем экспрессии гена [Спирин А.С., 2003] [11]. Скорость синтеза белка зависит от уровня мРНК. В свою очередь уровни цитоплазматических мРНК представляют собой баланс между скоростями синтеза ядерной РЕК, процес-синга, экспорта в цитоплазму и скоростью деградации. Исследования последних десятилетий показали, что наиболее лабильным фактором регуляции экспрессии генов является стабильность мРНК, или время ее полужизни в цитоплазме. Оказалось, что в клетках млекопитающих количество разных РНК может изменяться многократно в результате изменения полужизни мРНК без каких-либо изменений в скорости транскрипции [5, 9, 10].
Получены убедительные доказательства в том, что стабильность мРНК зависит как от гена, копией которого она является, так и от условий окружающей среды. Применительно для животных к этим условиям относится, прежде всего, питание. Имеется ряд сообщений о действии белкового голодания, отсутствия в диете отдельных незаменимых аминокислот, или, наоборот, избыточного уровня белка в диете, в целом пищевого голодания на стабильность РНК и экспрессию генов. Однако этих исследований пока еще недостаточно, чтобы в полной мере понять молекулярные механизмы пищевого поведения и биосинтеза белка при разных формах баланса незаменимых аминокислот.
В связи с этим представляет определенный интерес изучить действие разных форм баланса незаменимых аминокислот в питании животных на концентрацию и стабильность суммарной мРНК и мРНК ряда специфических генов: (фактора элонгации трасляции eEF-la, протоонкогена с-тус) в раскрытии механизмов биосинтеза белка и пищевого поведения животных.
Научная новизна
Основным фактором снижения аппетита при имбалансе является избыток аминокислот относительно первых лимитирующих - лизина или триптофана. Снижение потребления корма проявляется значительно сильнее при имбалансе триптофана, чем лизина.
Установлено, что стабильность суммарной мРНК печени и мРНК фактора элонгации трансляции eEF-la зависит от формы сбалансированности рациона. При имбалансе лизина и триптофана, их концентрация и стабильность снижаются в сравнении с показателями у животных на сбалансированных по аминокислотам рационах. Стабильность мРНК протоонкогена с-тус в печени, наоборот повышается в ответ на низкобелковое несбалансированное по аминокислотам питание. Это свидетельствует о разной экспрессии специфических генов на ту или другую форму аминокислотного баланса.
Балансирование рационов по принципу «идеального белка» способствует существенной его экономии. Рационы свиней, сбалансированные по аминокислотам комбинированием кормов, не отвечают требованиям «идеального белка» из-за значительного избытка таких аминокислот как аргинин, лейцин, валин, тирозин. Можно полагать, что практические рационы, в том числе и кукурузо-соевые, обладают свойствами, характерными для имбаланса.
Практическая значимость работы
Разработанная рецептура рациона для поросят на основе принципа «идеального» белка, позволяет существенно сократить затраты белка без ущерба для продуктивности. Наши исследования показали, что аппетит, играющий наиболее значимую роль в регуляции продуктивности животных, зависит от сбалансированности рационов по незаменимым аминокислотам.
Поэтому в практике свиноводства вопросу сбалансированности рационов, как фактору аппетита, рекомендуем уделять больше внимания, при этом не только в плане устранения недостатка, но и избытка аминокислот. Монозерновые, обогащенные всеми недостающими аминокислотами, рационы в перспективе могут стать наиболее рациональным способом кормления монога-стричных животных в условиях России, не имеющей ресурсов биологически полноценных белковых кормов.
Апробация работы
Основные результаты научных исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных научных конференциях. Основные из них: Второй съезд биохимического общества РАН (май 1997г., Москва, Пущино), Вторая краевая школа-семинар молодых учёных «Научное обеспечение сельскохозяйственного производства» (1997г., НИИ Риса, Краснодар).
Положения, выносимы на защиту:
имбаланс лизина и триптофана вызывает ухудшение аппетита и, как следствие этого, резкое снижение роста и отложения белка, высокие затраты белка и корма на единицу продукции, при этом реакция животных на имбаланс триптофана проявляется более остро, чем на имбаланс лизина;
причиной имбаланса является избыток аминокислот относительно содержания лизина и триптофана. Понижение аппетита является физиологически обоснованной защитной реакцией, направленной на поддержание гомео-стаза путём ограничения потребления излишнего количества аминокислот и образующихся вредных продуктов распада;
при имбалансе не снижается количество суммарной РНК, суммарной мРНК и мРНК фактора элонгации трансляции eEF-la в печени, однако суще-
ственно снижается стабильность мРНК . Это особенно заметно при имбалан-се триптофана в результате увеличения количества аминокислот до 150% норм потребности. В то же время уровень и стабильность протоонкогена с-тус повышается в печени крыс. Это свидетельствует о том, что разные гены экспрессируются неодинаково в ответ на одну и ту же форму сбалансированности аминокислотного питания;
снижение экспрессии гена фактора элонгации трансляции eEF-la в печени и мозге при имбалансе может быть ключевым звеном в цепи регуля-торных механизмов пищевого поведения животных (аппетита);
более низкий рост свиней на высокобелковом рационе кукуруза+соя в сравнении с ростом на монозерновом рационе, обогащенном кристаллическими аминокислотами точно до норм потребности («идеальный белок»), обусловлен избытком нелимитирующих аминокислот, создающим естественный имбаланс за счёт самих кормов. Этот вывод подтверждается показателями снижения стабильности суммарной мРНК, аналогично снижению стабильности в печени крыс на рационах с имбалансом лизина;
способность регулировать уровень и стабильность мРНК в зависимости от условий аминокислотного питания является приспособительным механизмом организма животных. При снабжении аминокислотами на уровне современных норм наблюдается высокая стабильность мРНК, хороший рост животных и биосинтез белка. Индекс стабильности суммарной мРНК печени может быть более объективным тестом для оценки сбалансированности рационов по аминокислотам и обмену белка чем концентрация суммарной РНК.
Головной мозг — регулятор пищевого поведения животных
Система рецепции незаменимых аминокислот находится в головном мозге. Здесь происходит обнаружение их дефицитов или избытков и формирование сигналов последующего пищевого поведения, которое включает следующие реакции: - признание метаболических последствий в результате действия диеты в зависимости от формы сбалансированности по незаменимым аминокислотам (дефицит, избыток, баланс) [18, 57]; - признание неприемлемым потребление рациона с дефицитом или им-балансом, или положительное отношение к сбалансированному рациону; - развитие продолжительного отвращения к рациону с дефицитом или имбалансом, предпочтение к сбалансированному рациону; - постепенная адаптация и повышение потребления корма, или же невозможность адаптации, в зависимости от остроты имбаланса незаменимых аминокислот. Имеются убедительные доказательства, что в этих реакциях главную роль играет головной мозг. Какой же отдел мозга действует как сенсор в признании формы сбалансированности рациона по незаменимым аминокислотам и узнает отсутствие или недостаток одной из них? Обнаружено, что у крыс и цыплят на рационах с имбалансом, концентрация лимитирующей аминокислоты устойчиво была низкой в передней коре грушевидной доли (КГД) (anterior periform cortex-АРС) крыс [102] и цыплят [60]. В других 14 изученных структурах мозга, несмотря на отсутствие в рационе крыс изолейцина или треонина, их концентрация была такой же, как у крыс на рационе с нормой этих аминокислот [67].
Снижение концентрации лимитирующей незаменимой аминокислоты в КГД является сигналом трансдукционной и нейрохемической активности генной экспрессии и синтеза белков, которые включаются в реакцию на им-баланс. Поражения электрическим током этих областей выявили, что только КГД является начальным сенсором лимитирующих аминокислот, так как крысы с пораженной КГД не реагировали на имбаланс, поедали дефицитный корм почти в таком же количестве, как сбалансированный рационы [66]. Инъекция микроколичеств дефицитной аминокислоты в КГД восстанавливала поедаемость имбалансной диеты до 80-85% от такового на скорректированной диете. Крысы, которым инъецировали в КГД физраствор, поедали только 50-60% корма [79]. Инъекции в КГД имбалансным крысам - треонина изолейцин и, наоборот, изолейцина - треонин - имбалансным, не имели никакого действия на улучшение аппетита. Инъекции на 2 мм сзади КГД или в мозговую миндалину также не имели действия. Это доказывает, что КГД является строго специфическим отделом рецепции лимитирующих аминокислот [69].
Животные быстро перестраивают аппетит с имбалансной на сбалансированный рацион, или в результате восполнения недостающей аминокислоты путем инъекции его раствора в кровь или КГД, или же путем предоставления выбора между питьевой водой и раствором недостающей аминокислоты [21, 23]. Животные, переключенные с имбалансного рациона на скорректированный рацион уже через 15-30 минут признают насыщение лимитирующей аминокислотой и с большим аппетитом поедают корм. 1.2.1. Действие разных форм баланса аминокислот на экспрессию генов в нейронах головного мозга
Второй вопрос состоит в том, какие нервные механизмы трансдуциру-ют и интегрируют сигналы дефицита незаменимых аминокислот. Известно, что протеин-киназы являются необходимыми передатчиками сигнальных импульсов в нервной системе и образования рефлексов. Поскольку имбаланс рациона приводит к устойчивому отвращению к пище, предполагается, что фосфорилирование протеин-киназ может играть важную роль в возникновении аноректической реакции. Есть сообщения о том, что митоген активированная протеиновая киназа (МАРК) (mitogen activated protein kinase) фосфо-рилируется в КГД крыс, которые поедали имбалансную диету в течение 1 часа [110]. Кроме того, было установлено, что Са увеличивается в слое нервных клеток КГД, который инкубировали в дефицитной по лизину или треонину среде, но не в контроле. Са2+ является медиатором и в нервной системе действует как обучающий память компонент. 3-4-кратное увеличение концентрации ионов Са2+ во внутриклеточной среде, возможно, также связано с начальным сигналом, приводящим к изменениям в нейротрансмиттер-ной активности при дефиците лимитирующей аминокислоты [94].
При имбалансе лизина средней остроты аноректическая реакция наступает через 6 часов, а концентрация лизина в КГД понижается раньше - через 3,5 часа. К этому времени, то есть еще перед отказом от корма, наблюдалось снижение) концентрации норэпинефрина в КГД и повышение в вентромеди-альном гипоталамусе (область, ответственная за чувство голода) серотонино-вой системы [67]. Таким образом, становится очевидным, что несколько трансдукционных и нейротрансмиттерньтх сигнальных систем включаются в реакцию на имбаланс как вторичное действие на пониженный уровень лимитирующей аминокислоты.
Используя микроинъекции в мозг рецепторных агонистов и антагонистов, которые включаются в реакцию на дефицит незаменимых аминокислот в КГД, были обнаружены специфические рецепторы, реагирующие на имба-ланс: рецептор серотонин3 для серотонина, оь норадренэргическии рецептор для норэпинефрина, ГАМКА рецептор для у-аминомаляной кислоты и дофамин D2 рецептор для дофамина. Эти трансмиттерные системы действуют на пирамидальные нейроны коры головного мозга путем их возбуждения через глютаминэргические рецепторы. По-видимому, эти хемосенсоры незаменимых аминокислот вызывают как повышенную, так и пониженную экспрессию генов [122]. Гены, участвующие в этом процессе, по-видимому, кодируют белки убиквитиновой и апоптозной систем.
Анализ генов в КГД через 2 часа после дачи крысам изолейцина имба-лансной и скорректированной диет, показал, что повышенная экспрессия генов, связанных с апоптозом, наблюдается у крыс на диете с имбалансом, и повышенная экспрессия генов убиквитин-протеаз у крыс на скорректированной диете. Результаты дают основание полагать, что после поедания имба-лансной диеты в мозгу активизируется геномная система, направленная на деградацию белка и, наоборот, ингибируются протеин-деградирующие энзимы убиквитиновой группы после потребления скорректированной диеты [66]. Кроме того, наблюдается повышенная экспрессия гена FOS [125] и ней-ропептида Y(NPY) мРНК и снижение небольшого количества кислого белка (small acidic protein) в КГД крыс после поедания имбалансной диеты [79]. Регуляция экспрессии генов в клетках головного мозга в ответ на имбаланс аминокислот Каков же молекулярный механизм образования рефлексов в ответ на дефицит незаменимых аминокислот? Установлена взаимная зависимость между аноректической реакцией, экспрессией рибонуклеиновых кислот и синтезом белков. В результате введения пуромицина или актиномицина D па раллельно с инъекцией лимитирующей аминокислоты крысам в КГД блокируется увеличение потребления имбалансной диеты [44]. Известно, что недостаток или отсутствие одной или нескольких незаменимых аминокислот приводит к накоплению в культуре дрожжей незаряженных тРНК, индуцируя активность протеинкиназы GCN2, которая фосфо-рилирует а-субъединицу эукариотического фактора инициации 2 (eIF2). Последняя, в свою очередь, ухудшает синтез 43 S преинициационного комплекса (Мет-тРНК, ГТФ и eIF2). Главное последствие этого процесса состоит в повышении трансляционной регуляции транскрипционного фактора GCN4. Эта регуляция происходит благодаря особой структуре 5-нетранслируемого участка GCN4 мРНК. В результате GCN4 индуцирует более 30 различных генов в девяти различных биосинтетических путях [55].
Действие избытка белка и аминокислот на экспрессию генов
К сожалению, в литературе не так много данных, освещающих механизмы устранения вредного «избытка» аминокислот относительно первой лимитирующей при имбалансе. Для понимания этих механизмов ценную информацию могут дать исследования по действию избыточного уровня белка в питании животных, когда количество освобождаемых аминокислот в 2-3 раза превышает потребность.
При увеличении уровня в рационе белка свыше 25% и более у животных (крысы, свиньи, птицы) возникает анорексия, снижение веса тела, что указывает на ограниченную адаптационную способность метаболизировать излишние аминокислоты [37]. При этом наблюдается гипертрофия поджелудочной железы, гепатомегалия, нефромегалия, нарушение Са2+ гомеостаза [75,81].
Более высокое потребление белка, к которому животные могут адаптироваться, представляет рубеж между адаптивным приспособлением и вредным действием. Приспособительная реакция к сверхнормальному потреблению белка зависит от способности организма нейтрализовать излишки аминокислот. Большинство незаменимых аминокислот подвергается интенсивной деградации в печени при незначительном действии периферических тканей. Аминокислоты с разветвленными цепями (АКРЦ) — лейцин, изолейцин, валин — разрушаются, главным образом, в периферических тканях, в частно сти, в мускулах [117]. Заменимые аминокислоты деградируют как во внутренних органах, так и периферических тканях. Например, глютаминовая кислота и глютамин трансаминируются в слизистой кишечника с образованием аланина, который затем проникает в печень через портальную вену. Углеродная часть аминокислот служит источником образования глюкозы, а аммиак - мочевины или образования глютамина из глютаминовой кислоты. Таким образом, образование мочевины из аммиака, освобождаемого при деградации аминокислот, является самым важным регуляторным процессом в адаптации к высокому уровню или дисбалансу аминокислот (белка) в рационе. Энзимы цикла орнитин-мочевина, компартаментализованы в печени, частично в слизистой кишечника и почках. Кроме того, карбомилфосфат-синтетаза-1 (КФС-1) имеет регуляторный кофактор Н-ацетил-Ь-глютамат (АГ), который обладает свойствами скоротечного регулирования синтеза мочевины. Высокие уровни белка или свободных аминокислот в диете резко повышают уровень транскрипции генов КФС1, АГ. Наличие кратковременного и долговременного механизмов регуляции мочевинообразования помогает поддерживать концентрацию циркулирующих аминокислот на физиологически предпочтительном уровне, независимо от разных количеств белка в диете и состояния аминокислотного катаболизма в целом теле.
В некоторых случаях, образование мочевины становится максимальным и дальнейшее увеличение в нагрузке аминокислотами может привести к клинически зависимой гипераммониемии и гипераминоацидемии. Потребление избыточного количества белка или аминокислот ведет к повышению активности разных деградативных путей обмена аминокислот. У крыс, потреблявших высокобелковую диету (50% молочного белка), активность аланиновой аминотрасферазы, аргиназы, сериновой дегидротазы печени были в 1,5-2 раза выше по сравнению с их активностью у крыс на диете с 14% белка [81].
Уровень энзима орнитин-декарбоксилазы (ОДК) в печени крыс, повышался в 50-100 раз и ее мРНК в 5 раз за 4-часовой период кормления полно ценной по аминокислотам 50% казеиновой диетой. Активность ОДК и мРНК у крыс на бедной лизином и триптофаном 50% зеиновой диете была в 21 раз ниже [82]. С увеличением уровня белка до 24%, превышающем потребность свиней (живая масса 20-96 кг), активность ферментов цикла мочевинообразова-ния печени аргининсукцинат синтетазы (ЕС 6.3.4.5), аргинисукцинат лиазы (ЕС 4.3.2.1) и аргиназы (ЕС 3.5.3.1) возрастала почти в два раза. В то же время активность глютаминовои оксалат трансаминазы печени понижалась у свиней на высокобелковом рационе [104].
У цыплят на полусинтетическом рационе (белок представлен полной смесью аминокислот) в отсутствии лизина (0%) резко повышалось образование мочевой кислоты в расчете на грамм потребленного N (в 11 раз), активность ферментов печени, участвующих в ее образовании, ксантин дегидроге-назы (ЕС 1.2.3.7) в 19 раз, нуклеозид фосфорилазы (ЕС 2.4.2.1) в 11 раз по сравнению с их уровнем у цыплят на рационе с 100% нормой лизина [129].
Активность многих энзимов катаболизма адаптируется у животных на уровень потребления белка и аминокислот. При низком потреблении их активность снижается, при высоком — повышается, что обусловлено изменением экспрессии кодирующих генов. Перевод цыплят с нормального рациона (22% белка) на низкобелковый рацион очень быстро (через 3 часа) вызывает существенное повышение экспрессии мРНК фермента малатдегидрогеназы печени. Активность этого энзима положительно коррелирует со скоростью синтеза жирных кислот и накоплением абдоминального жира у бройлеров. И, наоборот, перевод цыплят с низкобелкового на высокобелковый рацион вызывает снижение экспрессии мРНК и повышение активности этого энзима в печени, и снижение жирообразования. У цыплят при переводе с низкобелкового (13% ) на нормальный рацион (22% белка) уже через 3 часа повышалась экспрессия мРНК фермента гистидазы. Интересно то, что добавление L-гистидина к этому рациону не приводило к повышению экспрессии гистидазной мРНК. По-видимому, глю кагон, уровень которого в плазме крови коррелирует с концентрацией аминокислот в крови, опосредует изменения в экспрессии мРНК малатдегидро-геназы и гистидазы и, что общее количество потребляемого белка, а не специфических аминокислот, регулирует экспрессию мРНК этих энзимов. Добавление в культуральную среду гепатоцитов цыплят глюкагона существенно подавляет уровень мРНК малатдегдирогеназы [47].
Поскольку аминокислоты не могут запасаться, а незаменимые синтезироваться, то было бы важно, чтобы они лучше сохранялись, когда их мало в рационе, и быстро окислялись, когда их количество превышает потребность. В исследованиях на крысах было показано, что,гистидин окисляется очень слабо до тех пор, пока его уровень не становится достаточным для максимального роста, и после этого оксидация гистидина повышалась быстро [115].
Потери массы у крыс на диетах с отсутствием одной из незаменимых аминокислот заметно различаются в зависимости от аминокислоты, отсутствующей в диете. Наиболее значительная потеря веса была в отсутствии треонина, наименьшая — при отсутствии лизина. Это свидетельствует о разной реакции ферментов на соответствующие аминокислоты.
Цель и задачи исследований
Материалом для исследований послужили белые крысы линии Вистар и поросята-отъемыши породы СМ-1. Опыты по изучению влияния имбаланса лизина и триптофана на организм животных были проведены в условиях физиологического двора Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства с 1996 по 1999 гг.
Молекулярно-биологические исследования проводили в лаборатории молекулярной биологии Краснодарского научно-исследовательского института сельского хозяйства имени П.П.Лукьяненко в 1996, 1997 и 2000 годах (зав. лабораторией, доктор биол. наук В.К.Плотников).
Научно-хозяйственный опыт на поросятах-отъемышах проведен в 2000 году в условиях племенной фермы НПО «Прогресс» Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства. 2.2.1. Действие имбаланса лизина и триптофана на аппетит, рост белых крыс, концентрацию и стабильность мРНК.
Первый опыт. Эксперимент состоял из двух самостоятельных опытов - 1-го и П-го. В каждом опыте было по 4 группы крыс-отъемышей линии «Вистар» в возрасте 18-20 дней, при живой массе 45-47 граммов, по 10 голов в группе, поровну самцов и самок. Группы животных формировали с учетом живой массы, возраста, энергии роста. Содержание животных - в индивидуальных клетках. В течение 5 дней они находились на предварительном периоде, во время которого животных всех групп кормили по одинаковому рациону. По окончании предварительного периода был проведен основной 14-дневный опыт. Кормили сухими кормосмесями, вода из ниппельных автопоилок.
Основной рацион состоял из кукурузной дерти, с уровнем сырого белка (протеина) - 8,8%, обогащенной до нормы потребности витаминами, макро-и микроэлементами (таблицы 2.1., 2.2). Кроме того, для повышения уровня белка добавлены две заменимые аминокислоты — аспарагин и глютамин 4 и 7 г/кг, соответственно. Таблица 2.2
Состав рационов для лабораторных животных 1-го опыта (г/кг корма) Компоненты Основнойрацион(ОР)1 -я группа Имбаланслизина 2-я группа Имбаланстриптофана3-я группа Скорректированный , 4-я группа В этом рационе первой лимитирующей аминокислотой, по степени дефицита (в % от нормы потребности), был лизин, второй — триптофан, третьей - изолейцин, четвертой - треонин и т.д. (таблица 2.3). Таблица 2 .3 Расчет содержания и дефицита незаменимых аминокислот в основном ра ционе относительно норм потребности белых крыс (1-й опыт)
Аминокислоты Содержание, г/кг Норма, г/кг(NRC,1972) Дефицит (-),избыток (+),г/кг Содержится, % от нормы В основном рационе, несмотря на высокий дефицит незаменимых аминокислот, их уровень относительно первой лимитирующей — лизина был избыточным. Если принять в расчет, что количество лизина составило 26,7% от нормы потребности, то эти избытки, для одних аминокислот - лейцина, тирозина, валина, фенилаланина весьма велики, для других - триптофана, треонина, изолейцина - они не так значительны, но, тем не менее, они имеются.
Таким образом, основной рацион характеризуется крайне различным дефицитом одних аминокислот на фоне определенного избытка других, при этом значительного, по отношению к количеству наиболее лимитирующих аминокислот — лизину и триптофану. Поэтому основной рацион можно отнести не просто к низкобелковому рациону, а к низкобелковому с дисбалансом незаменимых аминокислот.
Представляло интерес изучить его действие на ряд физиолого-биохимических показателей животных в сравнении с действием рационов, в которых количество всех аминокислот соответствует 100% норме за исклю чением одной лимитирующей - лизина (2-я группа — имбаланс лизина), или триптофана (3-я группа — имбаланс триптофана).
Такой состав достигался добавлением смеси, состоящей из недостающих незаменимых и заменимых аминокислот в виде кристаллических препаратов, точно до нормы без одной изучаемой аминокислот - лизина (2-я группа) и триптофана (3-я группа).
Рацион, сбалансированный (скорректированный) по всем аминокислотам, достигался путем обогащения всеми недостающими аминокислотами, включая лизин и триптофан. Эти добавки представлены в таблице 2.3 и на рис. 2.1. Поедаемость корма учитывали ежедневно. Взвешивали крыс один раз в семь дней. Сбор кала для определения переваримости проводили в течение второй недели ежедневно.
Определение переваримости протеина, коэффициентов утилизации белка (КУБ) проводили соответственно по методам Томаса [1908] и Бендера [1953] в прописи В.Г.Рядчикова [17]. Витаминную смесь готовили добавлением водного раствора витаминов в кукурузный крахмал с последующей сушкой его при комнатной температуре. Жирорастворимые витамины А, Д, Е добавляли в кормосмесь, растворив их предварительно в масле.
При добавке 2% витаминной смеси обеспечивали следующее содержание витаминов в 1 кг смеси: витамин А — 10 тыс. ИЕ, Bi — 6,5 мг, В2 — 12,5 мг, В3 - 40 мг, Вб - 6 мг, В12 - 50 мкг, биотин - 0,5 мг, К (викасол) - 0,5 мг, РР -75 мг, фолиевая кислота — 2 мг, параамино-бензойная кислота - 50 мг, холин-хлорид — 1 г, С - 120 мг, инозит — 100 мкг, Д2 - 5 тыс. ИЕ, Е - 50 ИЕ (NRC, 1972). Добавление минеральной смеси в количестве 27,7 г в рацион обеспечивало следующие количества веществ (г/кг кормосмеси): кобальт — 0,045; магний - 0,375; железо - 0,038; медь - 0,015; цинк - 0,03; йод - 0,0015; калий -0,375; натрий - 3,75; хлор - 5,7; кальций - 4,5; фосфор - 3,0. Перед убоем животных в течение ночи оставляли без корма. Утром давали корм, через два часа корм убирали и через четыре часа от начала кормления животных убивали декапитацией. Печень и часть крови замораживали в жидком азоте для последующих анализов.
По четыре животных от каждой группы убивали также декапитацией, тушки сушили в сушильном шкафу, готовили из них муку мелкого помола, в которой определяли содержание протеина, жира и воды. Второй опыт на этом этапе исследований был полностью аналогичен первому по методике проведения, с разницей в том, что к основному рациону добавляли незаменимые аминокислоты в большем количестве, чем в 1 опыте, а, именно, до 150% нормы потребности, с целью усиления остроты имбалан-са (таблица 2.4; 2.5; рис. 2.1).
Действие разных форм баланса незаменимых аминокислот на физиолого-биохимические показатели белых крыс
Добавление к основному рациону кристаллических аминокислот до норм потребности, но без лизина и триптофана вызывало снижение потребления корма на 13,4 и 20,6%, роста на 86 и 95% (Р 0,001), соответственно. В то же время добавление той же смеси кристаллических аминокислот, но с лизином и триптофаном, способствовало повышению потребления корма в 2,5 раза (Р 0,01) и среднесуточных приростов в 8,5 раз (Р 0,001) по сравнению с таковыми у крыс на основном рационе (таблица 3.1). У крыс на триптофан-имбалансном рационе наблюдались выпадение шерсти, нервозность.
Никакой адаптации крыс к имбалансу не наблюдалось. При имбалансе триптофана, уже на второй день опыта, животные уменьшили потребление корма на 30% и продолжали его снижать в течение всего опытного периода (Рис.3.1). При имбалансе лизина (2-я группа) потребление корма, снизившись в течение первых суток опыта, удерживалось на одном уровне до пятого дня, после чего следовало резкое и необратимое снижение аппетита, что, вероятно, обусловлено истощением резервов запасных белков, которые на первых порах помогали компенсировать недостаток лизина в рационе. Более высо кую выживаемость крыс и цыплят, при кормлении диетой без лизина, чем без триптофана, наблюдали и другие исследователи [19]. Эти факты свидетельствуют о существенных различиях метаболической реакции животных на имбаланс разных аминокислот, а также о том, что никакой адаптации к им-балансу в виде постепенного увеличения потребления корма не происходит.
Во П-м опыте, в результате добавления смеси аминокислот до 150% норм потребности в группах с имбалансом лизина и триптофана наблюдалась еще более острая реакция животных, чем в первом опыте, в виде снижения потребления корма и роста животных. Более того, животные в группе с трип-тофановым имбалансом снизили живую массу на 1,54 г за 14 дней опыта. На скорректированном рационе животные также хуже поедали корм и медленнее росли (Р 0,05), чем на скорректированном рационе при 100% добавлении аминокислот в 1-м опыте. Посуточное потребление корма имело аналогичную картину, как в 1-м опыте. Адаптации на имбаланс в виде увеличения потребления корма не происходило.
Из опытов, очевидно, что причиной имбаланса является избыток аминокислот относительно уровня лимитирующих - лизина и триптофана, чем выше избыток, тем выше его отрицательное действие на аппетит и рост животных, не только на имбалансных, но и на сбалансированных рационах. При этом он проявляется сильнее при имбалансе триптофана, нежели лизина.. Содержание белка в тушке, печени и сыворотке крови, переваримость и отложение азота
В тушках, печени и сыворотке крови крыс на скорректированных рационах в 1-м и П-м опытах содержание (Р 0,05-0,01) и отложение белка (Р 0,001) было существенно выше по сравнению с показателями у животных, получавших имбалансные рационы (таблица 3.2). Увеличение уровня аминокислот до 150%о не приводило к повышению содержания белка и отложению азота у крыс на скорректированном рационе по сравнению с отложением при 100% обеспеченности аминокислотами. Наоборот, наблюдается достоверное снижение отложения азота: 0,94 против 1,22 г за 14 дней.
Несмотря на низкое абсолютное количество отложенного азота в тушках крыс на рационах с имбалансом, в расчете же на 100 г прироста не было достоверных различий по его отложению при разных условиях аминокислотного питания, что свидетельствует о способности сохранения белкового го-меостаза в условиях имбаланса (таблица 3.3).
Показатели Основойрацион1-я группа Имбаланслизина 2-я группа Имбаланстриптофана3-я группа Скорректированный 4-я группа Коэффициенты кажущейся переваримости азота у животных всех групп 1-го опыта, оказались довольно близкими (таблица 3.4). Хотя в имбалансных группах они были ниже, чем у животных на основном и скорректированном рационах. Во П-м опыте отмечена та же тенденция, при этом коэффициент переваримости азота у животных на скорректированном рационе был достоверно выше показателей в остальных группах (Р 0,01). В значительной мере низкая кажущаяся переваримость происходит за счет значительного выделения эндогенного азота желудочно-кишечного тракта относительно низкого потребления корма у животных на имбалансных рационах [18].
Не выявлено достоверных различий по содержанию воды в тушках (таблица 3.5). В то же время содержание жира у имбалансных животных в 1-м опыте оказалось более низким. Однако отложение жира в г/голову самое высокое получено у триптофан-имбалансных животных. Оно превышает прирост за весь опыт. По-видимому, при имбалансе триптофана происходит пе рестройка состава тела в результате замены белковой части на жировую. В.Г.Рядчиков с сотрудниками (18), в своих исследованиях также, показывает, что при имбалансе триптофана происходит более значительное накопление жира в тушках крыс, чем при имбалансе лизина и на основном рационе
Уровень суммарной РНК в печени крыс на скорректированном рационе был выше, чем у крыс на низкобелковом основном рационе (Р 0,05) однако достоверных различий с уровнем РНК в печени животных, получавших рационы с имбалансом лизина и триптофана, не отмечено (таблица 3.6). Не было различий между группами по количеству ДНК. Транскрипционная активность, выражаемая отношением РНК/ДНК, была более высокой у крыс на скорректированном рационе по сравнению с таковой на основном. Однако не отличалась от активности у имбалансных животных. Как в наших, так и опытах других авторов, тесная прямая зависимость отмечалась между содержанием лизина в рационе и ростом крыс или цыплят. В то же время не было прямой зависимости между ростом и уровнем суммарной РНК в печени [28]. По уровню суммарной поли (А)+ мРНК (за исключением более высокой при трипто фановом балансе) не выявлено достоверной разницы между 2-4 группами, в то время как уровень поли (А) мРНК оказался существенно выше в печени крыс на скорректированной диете (Р 0,01), по сравнению с тем в остальных группах (таблица 3.6).
