Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Современное представление о структуре и функции гистонов .І 9
1.1.1. Особенности первичной структуры гистонов и их возможные конформации 9
1.1.2. Гистоны как важные элементы хроматина 14
1.1.3. Гистон-гистон и гистон-ДНК взаимодействия 17
1.1.4. Система фосфорилирования и некоторые модификации гистонов 21
1.2. Влияние некоторых металлов (Саг+ , №gz +ZM2,+ ) на опухолевый рост 24
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Экспериментальные животные и опухоли 32
2.2. Частичная гепатэктомия 33
2.3. Получение препаратов суммарных гистонов и их отдельных фракций 35
2.4. Методы определения Са2, М2+и Zn2 в гистонах 36
2.5. Исследования методами рентгенографии и КД 38
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Количественное содержание Са2 , Mg"2, Znz+ в гистонах нормальных и опухолевых тканей 42
3.2. Рентгенографические исследования конформаций нормальных и опухолевых гистонов 46
3.3. Спектры КД и конформация гистонов 48
3.4. Электрофорез суммарных гистонов и их отдельных фракций, выделенных из печени здоровых мышей и из клеток асцитной гепатомы 22а 53
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 55
Выводи 68
Приложение 70
Литература 87
- Особенности первичной структуры гистонов и их возможные конформации
- Система фосфорилирования и некоторые модификации гистонов
- Методы определения Са2, М2+и Zn2 в гистонах
- Количественное содержание Са2 , Mg"2, Znz+ в гистонах нормальных и опухолевых тканей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Все разнообразие клеточных функций животных организмов прямо или косвенно связано с закодированной в клеточной ДНК генетической информацией, механизмы передачи которой лежат в основе роста, дифференцировки клеток, а также их злокачественной трансформации.
Хотя непосредственным носителем генетической информации является ДНК, клеточные системы работают в виде хроматиновых или других ДНК-белковых комплексов. В настоящее время считается, что, по крайней мере, на первом уровне организации хроматина ответственными являются ядерные белки основного характера - гистоны.
Гистоны, в основном, являются структурными белками, однако, они принимают участие в процессе регуляции и транскрипции.
Способность гистонов тормозить транскрипцию ДНК в репре-сированном хроматине определяется силами взаимодействия между положительно заряженными концами гистонов и отрицательными фосфатами ДНК.
Следовательно, любое воздействие (такое как ацетилирова-ние, фосфорилирование, АДФ-рибозилирование, появление белка А-24), влияя на соотношение положительно заряженных и нейтральных глобулярных участков в молекулах гистонов, и тем самым, на ДНК-гистоновые и гистон-гистоновые взаимодействия, может привести к изменению структуры и функции отдельных участков хроматина.
Вопрос об участии разных модификаций гистонов в функционировании хроматина все еще остается малоизученным, несмотря
на его первостепенное значение в изменении структур отдельных его участков. Исходя из вышесказанного, можно представить, насколько существенны порой даже незначительные сдвиги в молекулах отдельных фракций гистонов, приводящие к изменению их кон-формаций.
В этой связи особое значение приобретает изучение связывания металлических ионов с гистонами, выделенными как из нормальной ткани, так и из трансформированных клеток, в силу наличия в них фосфатных групп, способных взаимодействовать с катионами.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена сравнительному изучению количественного содержания и выяснению роли двухвалентных ионов (Са2+ , Mga+ и Zr\ + ) в суммарных* ги-стонах и их отдельных фракциях, выделенных из нормальных и опухолевых клеток.
Перед нами стояли следующие задачи:
Установить специфичность связывания Саг+ ,Mg с отдельными фракциями гистонов.
Выявить и охарактеризовать количественные различия содержания Са2+ ,Mg2+ и Znz+ в гистонах, выделенных из нормальных и опухолевых клеток.
Изучить конформационные различия нормальных и опухолевых гистонов, содержащих различные количества Са2+ , Mgz+ и Zh +
Исследовать влияние искусственно добавленных ионов Сд?
и Mtf2+ на конформацию некоторых фракций гистонов.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенной экспериментальной работы впервые был установлен характер изменения количественного содержания катионов в суммарных гистонах и их отдельных фракциях, выделенных из пече-
ни нормальных и гепатэктомированных мышей линии СЗНА, асцитных клеток гепатомы 22а, а также из печени нормальных беспородных крыс и саркомы М-1. Проведено сравнительное исследование содержания Саг+ ,Mg2+ и Zn2+ в нормальных и опухолевых гистонах. Изучены конформации всех фракций гистонов с помощью методов КД-спектроскопии и рентгенографии. Изучено влияние двухвалентных катионов Са2* и Mg2+ на конформациго отдельных фракций гистонов. Предложена модель влияния Саг+ и Mg*+ на конформациго гистонов Н2А и Н2В.
Разрабатываемые в настоящей работе представления о конфор-мационных возможностях отдельных фракций гистонов, выделенных из нормальных и опухолевых клеток, могут быть полезными при изучении двухвалентных катионов, как важных элементов опухолевого роста и изменения структуры хроматина.
Эти вопросы в настоящее время приобретают особое практическое значение в связи с обнаруженным изменением генетического материала при разном содержании в компонентах хроматина (ДНК, гистонах) ионов металлов.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка использованной литературы.
Первая глава носит обзорный характер. В ней рассмотрены особенности первичной структуры гистонов, их роль в структуре хроматина, а также возможные структурные перестройки при разных модификациях гистонов (фосфорилировании, ацетилированиии и др.), которые, в свою очередь, изменяют ДНК-гистон и гистон-гистон взаимодействия. Обсуждается также вопрос относительно влияния некоторых двухвалентных ионов, в частности, Свг*$ Mg2+ и Zn2+ на процесс опухолевой трансформации.
Во второй главе дается описание используемых в настоящей работе экспериментальных животных, штаммов опухолей, методических приемов выделения суммарных гистонов и их отдельных фракций, подготовки к работе реактивов и посуды, методов определения количественного содержания биогенных элементов (Сa**,Mg** и 2ъг+) в гистонах, исследования вторичной структуры фракций гистонов.
В третьей главе изложены результаты собственных исследований количественного содержания Саг+ , Mg*+ и 2пг+ в суммарных гистонах и их отдельных фракциях, выделенных из нормальных и опухолевых тканей; влияния С a** , Mg2+ и Zvr на конформацию молекул отдельных фракций гистонов при разных условиях окружающей среды. Представлены спектры кругового дихроизма всех фракций гистонов. Наиболее тщательно изучены фракции Н2В, Н2А и Н4. Приведены электрофореграммы гистонов, выделенных из печени здоровых мышей и клеток асцитной гепатомы 22а.
Четвертая глава посвящена анализу полученных экспериментальных данных. Учитывая закономерности распределения исследуемых элементов в суммарных гистонах и их отдельных фракциях нормальных и опухолевых тканей, обсуждено значение металлов в конформации гистонов. Предложена модель изменения конформаций гистонов при изменении содержания в них двухвалентных катионов. Кроме того, обсуждена возможная роль Са2+ » Mg и Zy\ в опухолевой трансформации на уровне гистон-ДНК комплексов.
Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста. Содержит 10 таблиц, 6 рисунков и одну схему. Список цитируемой литературы состоит из 63 работ отечественных и 140 работ иностранных авторов.
Материалы диссертации доложены на Ш Советско-шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси, 1981), на Республиканской конференции молодых ученых по физико-химической биологии (Баку, 1981), на Всесоюзном рабочем семинаре молодых ученых "Физико-химические свойства биологических макромолекул и методы их исследования" (Пушино, 1984).
По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Особенности первичной структуры гистонов и их возможные конформации
Гистоны, с момента их открытия в 1884 г. Косселем, являются объектом всестороннего изучения, мы кратко остановимся лишь на некоторых свойствах гистонов, которые связаны с полученными нами данными.
Согласно их первичной структуре, гистоны могут быть разделены на три группы: I) богатые лизином гистоны HI и Н5 (найдены в эритроцитах, содержащих ядра); 2) умеренно бога-тые лизином Н2А и Н2В; 3) богатые аргинином гистоны НЗ и Н4 /12/. Основные характеристики этих фракций гистонов приведены в табл. I. Это разделение коррелирует со степенью консервативности. Гистоны в целом отличаются консервативностью в отношении аминокислотной последовательности. Среди них: HI -самая вариабельная фракция, а НЗ и Н4 - самые консервативные /94,89,113/.
Гистон HI имеет несколько вариантов /175/, которые изменяются от ткани к ткани и от вида к виду /190,194/. В первичной структуре богатого лизином гистона HI можно выделить три основные области: \ - концевую часть которая заряжена положительно и довольно вариабельна; центральную часть, которая содержит много гидрофобных остатков и представляет собой относительно консервативный глобулярный участок молекулы; С -концевую часть, длиной 100 остатков, в которой так же, как ив N -концевой части, сконцентрированы лизиновне аминокислотные остатки /113,136/.
Умеренно богатые лизином гистоны Н2А и Н2В состоят из N-концевой области, в которой сгруппированы остатки основных аминокислот, в результате чего эта область заряжена положительно, и из длинной глобулярной области, в которой много неполярных боковых радикалов. В короткой С-концевой области (15-20 аминокислотных остатка) также содержатся положительно заряженные аминокислоты /94,87,39/. По степени консервативности эти фракции занимают промежуточное место между гистонами HI и парой НЗ/Н4. Например, фракция Н2А, выделенная из асцитной ге-патомы мыши, отличается от соответствующей фракции, выделенной из тимуса теленка, только одним аминокислотным остатком, а именно, 51-ый глицин во фракции Н2А, выделенной из тимуса, заменен метионином в той же фракции асцитных клеток /190/.
Богатые аргинином гистоны НЗ и Н4 относятся к одним из наиболее консервативных в процессе эволюции белков. Н4 состоит в основном из двух структурных доменов: из N -концевой положительно заряженной области и большей по размеру С-концевой области /88,102/, в которой равномерно распределены основные, гидрофобные и кислые аминокислоты.
Конформация гистонов, как и всех белков, определяется их первичной структурой. В работах Fas man. и др. обсуждаются возможные типы вторичной структуры и следствия, связанные с пространственным строением гистонов /96,55,23/.
HI представляет собой микрогетерогенную группу богатых лизином гистонов. Для этой группы характерны вариабельность N -концевой части молекулы, включающей с I по 40 аминокислотный остаток.
Фракция HI характеризуется самым высоким содержанием положительно заряженных аминокислот, низким уровнем oi -спиральных и J2 -структурированных участков /96,56/. Вся структурированная часть гистона HI сосредоточена в глобулярной части молекулы (40-120) (нумерация с N-конца). С-концевая часть гистона HI почти в 3 раза длиннее N-концевой части молекулы. Эта часть характеризуется большим суммарным положительным зарядом и является отвественным участком за связывание HI с ДНК /ИЗ, 136/.
В таблице 2 представлены теоретически предсказанные глобулярные области всех пяти фракций гистонов. Эти участки характеризуются наиболее высоким содержанием d и Ji-структур. Для фракции HI наиболее вероятно создание о -структур на участках, включающих 70-105 и 157-174, J3-структур - 85-89 и 93-97 аминокислотных остатков; положительные заряды собраны в кластеры (15-26), (106-122), (144-165) /55,56,96/.
Согласно статистическому анализу белков и стереохимической теории /138,155/, условием создания вторичной cL -спиральной структуры в глобулярных белках является расположение гидрофобных триплетов в позициях 1-2-5 и 1-4-5. Известно, что спираль дестабилизируется, если каждый четвертый аминокислотный остаток положительно или отрицательно заряжен /147/.
Исследование вторичной структуры гистона HI методом ЯМР-спектроскопии и КД показали, что в воде эта фракция содержит % oL -спирали и 7% J5 -структур, в растворе 1,0 М NaC количество этих структур возрастает до 15$ /96,77/. Известно,что увеличение ионной силы приводит к повышению процентного содержания структурированных областей в гистоновых молекулах.
Теоретические исследования вторичной структуры гистона Н2А позволяют предположить существование двух основных об -спиральных участков (92-101) и (47-66). На участках (23-27), (30-34) и (III-II6) расположены аминокислотные остатки, способствующие созданию -структур /96,55/. Несмотря на то, что Н2А отличается большим количеством oL -спиральных и ft -структурированных областей, их абсолютное количество в воде составляет 8$ и 16% соответственно /87/.
При увеличении ионной силы также происходит увеличение числа и размера 6L -спиральных и Р -структурных участков. Основные аминокислоты собраны в кластеры в N-концевой части гистона Н2А между остатками (1-36) и (II8-I29), и они обеспечивают взаимодействие этих частей молекулы с отрицательно заряженными фосфатами ДНК /101/.
Во фракции Н2В концентрация положительных зарядов наиболее высока в N -концевой части между остатками (1-35); участки (36-49), (93-102) и (I05-II9) проявляют тенденцию к созданию сі -спирали /96,55/. Области 1-30 и 102-125 участвуют в гистон-ДНК взаимодействии, а глобулярный участок 31-102 ответственен за гистон-гистоновые контакты /76/. Для этой фракции согласно данным ЯМР-спектроскопии и КД, oL -спираль представлена 10 -ным содержанием, a j -структура составляет 29$.
Система фосфорилирования и некоторые модификации гистонов
Как известно, все модификации гистонов значительно влияют на гистон-ДЖ взаимодействия и коррелируют со структурной ролью гистонов /72,103,152/. Самой важной модификацией гистонов на сегодняшний день считается фосфорилирование /110,116/.
Фосфорилирование специфически действует на J\j -концевые части молекул сердцевинных гистонов и влияет на их общий заряд /110,67/. Гистоны могут фосфорилироваться по сериновым и реже по треониновым остаткам /116/. Степень фосфорилирования прямо-пропорциональна скорости клеточного деления /117/. Многие факты свидетельствзпот о том, что эта модификация связана с процессами, сопровождающими активацию к делению покоившихся прежде клеток, а также с процессами, участвующими в синтезе ДНК и индукции транскрипции /109,142/.
Обнаружено, что фосфорилирование характерно для всех фракций гистонов /71/. Более других фракций этой модификации подвержен гистон HI /116,117/. В гистоне Н2А и Н4 возможно фосфорилирование ацетилсерина в N -конце /109/. В гистоне Н2В фосфорилируется серии в положении 6, в определенных условиях возможно фосфорилирование серинов 38 и 36 /144/. В гистоне НЗ фосфорилируютея серины в положении 10 и 28 /71,183/.
В гистоне HI найдены 3 фосфорилирующихся сериновых остатка в положениях 38, 106 и 157, хотя в отдельных случаях может произойти фосфорилирование еще некоторых сериновых и треонино-вых остатков /67,146/. Увеличение фосфорилирования во фракциях гистонов, по мнению некоторых авторов, вызывает увеличение содержания отрицательно заряженных групп в N -концевых положительно заряженных частях гистонов, что, тем самым, уменьшает взаимодействие гистонов с отрицательно заряженными фосфатами ДНК на этом участке /144,146/.
Считается, что максимальное фосфорилирование HI, наблюдаемое во время митоза, является пусковым механизмом конденсации хромосом /67/. По мнению же других авторов, таким пусковым механизмом является изменение концентрации двухвалентных катионов, таких как Саг+и Mge+ /97,123,122/. Известно также, что генетически активный хроматин характеризуется высоким уровнем фосфорилирования /180/ и высоким содержанием негистоновых белков /24,183/. Кроме того, рядом авторов показано, что уровень фосфорилирования выше в быстрорастущих асцитных опухолях по сравнению с таковым в нормальной печени /162,180/.
Другой модификацией гистонов, играющей важную роль в активации клеточных процессов является ацетилирование /152/.
В процессе трансляции имеет место N -концевое ацетилирование гистонов, в результате которого происходит необратимое образование о(-ацетилсерина /189,166/. Посттрансляционное аце-тилирование происходит лишь по лизиновым остаткам \1 -концевой области Н2В, Н2А, НЗ и Н4 и является быстрообратимым процессом /149,157/. Присоединение ацетильной группы к лизиново-му остатку нейтрализует его заряд /39,166/. Поскольку ацетили-рованные лизиновые остатки обнаружены лишь в N -концевых частях молекул гистонов, которые, в свою очередь, являются предполагаемыми областями взаимодействия гистон-ДНК, считается, что этот тип модификации специфически влияет на ДБК-гистоновую связь /103/.
Ацетилирование лизинов происходит во фракции Н4 в позициях 5, 8, 12 и 16; во фракции НЗ в позициях 9, 14, 18 и 23; Н2В ацетилируется в позициях 5, 12, 15 и 20, а Н2А - в позиции 5 /160,195/.
Согласно литературным данным ацетилирование гистонов коррелирует с увеличением транскрипционной активности различных систем /12,195/. 0 более высокой степени ацетилирования опухолевых гистонов, в том числе и гистонов, выделенных из гепатом различного рода, по сравнению со степенью ацетилирования нормальных гистонов свидетельствуют результаты ряда работ /152, 166,159/.
Все остальные модификации гистонов (метилирование, АДФ-рибозилирование и убиквитинизация) определенно играют роль в различных процессах, связанных с изменением структуры хроматина на различных этапах клеточного цикла /80,121/. Однако механизмы этих модификаций до конца не изучены, в литературе нет единого мнения о структурной и функциональной роли этих модификаций гистонов.
Как отмечалось выше, гистоновые фракции, входящие в окта-мер нуклеосомной сердцевины, выполняют структурную роль при сворачивании ДНК нуклеосом. С другой стороны, известно, что хроматин активно транскрибируемых генов также содержит полный набор гистоновых фракций. Поскольку гистоновые модификации, в основном, касаются N -концевой области этих молекул и влияют на взаимодействия гистон-ДНК, в свою очередь, изменения этих взаимодействий приведут к изменению гистон-гистоновых контактов внутри нуклеосомной сердцевины.
Исходя из всего вышесказанного, можно представить, насколько существенны всякого рода модификации гистоновых фракций, порой даже незначительные (касающиеся одной аминокислоты), в перестройке каждой субъединицы, которая, в свою очередь, может вызвать изменение всей суперструктуры. Это также подтверждает то наблюдение, что специфические модификации осуществляются в определенный период клеточного цикла.
Методы определения Са2, М2+и Zn2 в гистонах
Результаты количественного исследования двухвалентных катионов Cau , Mgl+ и Zna в нормальных и опухолевых гистонах, выделенных из печени здоровых мышей линии СЗНА, из асцит-ных клеток гепатомы 22а и из печени гепатэктомированных животных той же линии приведены в табл. 4.
При анализе представленных в таблице результатов привлекает внимание тот факт, что все три элемента содержатся в большом количестве в суммарных гистонах, выделенных из опухолевых клеток. Из изученных элементов самым высоким содержанием характеризуется Cai+ » самым низким - ZY\Z+ .
Для того, чтобы решить вопрос, характерно ли наблюдаемое нами явление для клеток, подвергнутых злокачественной трансформации, или это явление характеризует процесс активной пролиферации клеток, был проведен анализ содержания катионов Саг+, Hg , Zn2+ в суммарных гистонах, выделенных из частично гепатэк-томированной печени (модель нормальной активнопролиферирующей ткани). Анализ показал, что содержание Mg+ и Z + в суммарных гистонах, выделенных из гепатэктомированной печени ниже, по сравнению с гистонами из нормальной печени.
Тот факт, что гистоны из опухолевой и нормальной активно пролиферирующих тканей отличаются друг от друга содержанием клеточных двухвалентных элементов (Са , Mg и Zr\+ ) дает нам возможность сделать вывод, что в увеличении содержания этих элементов ответственной является опухолевая трансформация. Исследование содержания Саи , Hg+n Zh2 было проведено также и в отдельных фракциях гистонов. Результаты указанных исследований приведены в табл. 5, 6 и 7. Как видно из приведенных данных, для всех трех элементов характерно следующее: 1) они не обнаружены в гистоне Н4 ни в норме, ни при опухолевом росте; 2) содержание всех трех элементов в большинстве случаев увеличивается во всех фракциях, выделенных из асцитных клеток. В табл. 5 представлены данные по распределению Са +во фракциях HI, Н2А, Н2В и НЗ. Из таблицы следует, что самым низким уровнем содержания этого элемента, как в норме, так и в патологии, характеризуется фракция Н2А. Самым высоким содержанием Саг+ во фракциях, выделенных из нормальной печени, характеризуется HI, далее следуют фракции НЗ и Н2В. Другую картину содержания С?аг+ дают гистоновые фракции, выделенные из асцитных клеток. Самое высокое содержание этого катиона наблюдается во фракции НЗ, немного отстают от него фракции Н2В и HI; и самым низким содержанием daL+ характеризуется фракция Н2А. В целом картина такова: увеличение содержания С а почти в два раза наблюдается во фракциях гистонов НЗ, Н2А и Н2В, выделенных из асцитных клеток, по сравнению с уровнем этого иона в соответствующих фракциях, выделенных из печени здоровых мышей. Анализ количественного содержания Mg в препаратах отдельных гистонов, выделенных из печени здоровых мышей (табл. 7), свидетельствует о том, что фракции Н2В, НЗ и HI почти не отличаются друг от друга по содержанию этого элемента. Обращает на себя внимание тот факт, что опухолевый рост влияниет на уровень содержания [Ag почти так же, как и на Саг+ . А именно, в суммарных гистонах, выделенных из асцит-ных клеток, содержание Hg выше, чем в суммарных гистонах печени здоровых мышей. Результаты анализа отдельных фракций гистонов, выделенных из асцитных клеток гепатомы 22 а, показали увеличение во всех фракциях содержания Mg + . Самым высоким содержанием этого металла характеризуется фракция НЗ. Высокий уровень этого элемента наблюдается также во фракциях HI и Н2В. Самое низкое содержание Mg" обнаружено во фракции Н2А. Сравнительный анализ показывает увеличение в два раза содержания Mg2+ во фракциях НЗ и НІ, по сравнению с содержанием этого катиона в соответствующих фракциях из печени здоровых мышей. Согласно табл. 7 фракции Н2В и Н2А, выделенные из печени здоровых животных, содержат почти одинаковые количества Zh+. Во фракции HI, и особенно в НЗ, количество этого элемента более высокое. Для содержания Zyf+ характерна та особенность, что хотя опухолевый рост приводит к его увеличению во всех фракциях, однако оно существенно только для фракции Н2В. В последней уровень содержания Zni+ в три раза больше по сравнению с нормой.
Таким образом, сравнительным исследованием методом атом-но-абсорбционного анализа содержания двухвалентных металлов С аг+ , Mg и Znz+ в суммарных гистонах и их отдельных фракциях в норме и патологии, выявлен ряд закономерностей распределения этих элементов. А именно, как видно из табл. 4-7, распределение изученных элементов в отдельных фракциях гистонов печени здоровых мышей носит неравномерный характер.
Уровень содержания вышеуказанных элементов наибольший во фракциях НЗ, Н2В и HI, в гистоне Н2А - низкий, во фракции Н4 Саг , Mg7""1" и 2пг+ вообще не обнаружены. Характер распределения вышеуказанных элементов в гистоновых фракциях, изолированных из асцитных клеток, аналогичен характеру их распределения в гистоновых фракциях, выделенных из печени здоровых мышей. Имеет место статистически достоверное увеличение Са2,1" и Mg2t в суммарных гистонах и во всех фракциях при опухолевой патологии по сравнению с нормой и 2п+ во фракции Н2В. Во фракции Н4, выделенной из асцитных клеток, металлы Саг+ , Mg2+ и 2к также не обнаружены.
Для выяснения вопроса относительно того, является ли увеличение содержания двухвалентных элементов, таких как Саг+ , И г+ и ZY\I+, характерным для перевиваемых опухолей вообще, или это увеличение свойственно только для гепатомы 22а, было изучено распределение их в гистонах перевиваемой опухоли саркомы M-I. Опухоль саркомы M-I бралась на 14 день после перевивки. К этому времени отмечается максимальный рост опухоли, центральные некрозы еще не наблюдаются и, следовательно, значительно облегчается получение препаратов гистонов в довольно больших количествах, необходимых для дальнейшего исследования. Данные о количественном содержании двухвалентных металлов Саг+, Mg2+ и Zn в гистонах саркомы M-I представлены в табл. 8.
Количественное содержание Са2 , Mg"2, Znz+ в гистонах нормальных и опухолевых тканей
Изменения вторичной структуры гистоновых фракций особенно должны повлиять на взаимодействия ДНК-гистоны сердцевины нук-леосомы. Множество литературных данных свидетельствует о том, что фракции гистонов, создающие нуклеосомную сердцевину, обнаруживают разное сродство с ДНК /37,38,42,135/.
Фракции НЗ и Н4 считаются центральными участками, определяющими суперспиральнуго конформацию ДНК. Считается, что взаимодействие положительно заряженных N -концевых участков этих фракций с отрицательно заряженными фосфатами ДНК максимально /37,179,191/. Что касается фракций Н2А и Н2В, то существующие данные свидетельствуют о взаимодействии этих фракций с ДНК, лишь после упаковки фракций НЗ и Н4 /75,158/. На основании этого можно предположить, что в аминокислотной последовательности этих фракций существуют кластеры, не способные взаимодействовать с ДНК. В определенных условиях, число участков связывания фракций Н2А и Н2В с ДНК может расти. В особенности это относится к лизинбогатой фракции Н2В, первичная структура которой дает возможность (в определенных условиях) изменить соотношение длины положительно заряженного N1 -конца и глобулярного участка. Таким условием может быть взаимодействие Н2В с катионами. Такого рода изменения могут изменить характер взаимодействия глобулярных участков отдельных фракций между собой. А эти небольшие перестройки в сердцевине нуклеосомы могут затем повлиять на непрерывную белковую структуру хроматина, которая, как известно, является основой, структуры хромосом.
Еще один интересный аспект открывается, на наш взгляд, при сравнении содержания двухвалентных металлов и соответствующих конформационных изменений в отдельных фракциях гистонов. А именно, обнаружены фракции Н2В и НЗ, взаимодействующие своими положительными хвостами с линкерным участком ДНК, и вместе с субфракциями гистона НІ участвующими в изменении длины и конформации ДНК на этом участке /16,31,75/.
В спектрах КД гистона НІ, выделенного из печени здоровых мышей и из клеток асцитной гепатомы 22а, также обнаружена разница (рис. I), однако о роли ее судить очень трудно, поскольку известна не только видоспецифичная, но и тканеспецифичная вариабельность первичной структуры N -концевого участка фракции НІ.
Нужно отметить еще один немаловажный факт, характерный для конформационных переходов в гистоновых фракциях под влиянием двухвалентных катионов.
В растворе. 0.2 М СаС , согласно данным /23,187/, наблюдается противоположный эффект ионов Саг+ . Действительно, спектры КД показывают, что В.Л.С. в таких условиях переходят в ( -структуру. Этот эффект обусловлен лишь повышением ионной силы раствора и, следовательно, отличается от изменений, вызванных специфическими взаимодействиями малых концентраций ионов.
В литературе высказываются предположения /19Д29/о структурной роли металлов, как мостиков между белками и нуклеиновыми кислотами. С этой точки зрения интересны работы, появившиеся в последнее время /122,123,107/, где двухвалентные катионы рассматриваются как дегидратирующие агенты хроматина. Кроме того, как уже отмечалось в обзоре литературы, двухвалентные катионы аг+ и М г+ не только участвуют в компактизации хроматина, но и увеличение их количества в ядре является пусковым механизмом конденсации хромосом /98,123,112/.
Наши данные можно рассматривать как подтверждение этих предположений с той лишь разницей, что в данном случае двухвалентные катионы действуют необособленно, а вместе с поликатионами, такими как гистоны, участвуя в нейтрализации отрица- -тельных фосфатных зарядов, уменьшая тем самым дестабилизацию сложных хроматиновых структур и сокращая размеры хромосом. Тот факт, что гистоны имеют ограниченное число фракций, не дает основание считать эти белки специфическими регуляторами генной активности. Однако, существование различных модификаций и наличие вариаций гистонов дают возможность представить их активными участниками процесса транскрипции. В пользу этой возможности говорят также данные об избирательном взаимодействии гистоновых фракций с различными последовательностями ДНК. Известно, что ДНК, богатые А-Т парами, предпочтительно связываются с HI /42,135/. Фракции НЗ и Н4,с Г-Ц богатыми участками ДНК /179,39/. Хотя известны работы, в которых показано, что гистон-гистон взаимодействия уменьшают преимущественную тенденцию индивидуальных гистонов избирательно связывать участки ДНК /86/.
Как известно, гистоны остаются связанными с ДНК во время транскрипции и репликации /15,47,39/, и именно во время этих процессов происходят все известные до сих пор модификации гистоновых фракций /72,117,118,121/.
Модификации гистонов осуществляются, в основном, в N -концевой области, и как известно, действуют на гистон-ДНК взаимодействия таким образом, что связь между положительно заряженными участками гистонов и отрицательно заряженными фосфатами ДНК ослабевает и репрессированные ранее участки ДНК делаются доступными для транскрипции /57,86/. В то время увеличивается и содержание негистоновых белков хроматина, которые действуя как сильные полианионы, также ослабляют связи между гистонами и ДНК /13,94,24/. Увеличение фосфорилирования, ацетилирования, а также увеличение содержания многих компонентов клетки, связанных с пролиферацией и транскрипцией, дало возможность идентифицировать многие процессы, происходящие в опухолевых клетках, как процессы, обусловленные активной пролиферацией ткани.
