Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика аэробных метилотрофных бактерий 8
1.1. Особенности метаболизма метилотрофных бактерий 9
1.2. Центральный метаболизм 15
Глава 2. Галофильные микроорганизмы 17
2.1. Осмоадаптация 18
2.2. Гиперосмотический шок 21
2.3. Спектр совместимых растворимых веществ 23
2.3.1. Органические анионные осмолиты 24
2.3.2. Незаряженные осмолиты 28
2.3.3. Цвиттерионные осмолиты 32
2.4. Системы транспорта осмолитов 38
2.5. Пути биосинтеза осмолитов 40
2.5.1. Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина 41
2.5.2. Гены биосинтеза эктоина 44
2.6. Галофильные метанотрофы и метилобактерии 46
Глава 3. Материалы и методы исследования 48
3.1. Культивирование бактерий 48
3.2. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка 50
3.3. Определение активности ферментов 50
3.4. Выделение и анализ осмопротекторов 52
3.5. Молекулярно-биологические методы 52
3.5.1. Выделение геномной ДНК 52
3.5.2. Выделение РНК и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 53
3.5.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 54
3.5.4. Очистка фрагментов ДНК 55
3.5.5. Лигирование фрагментов ДНК 55
3.5.6. Получение компетентных клеток и их трансформация 56
3.5.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов 56
3.5.8. Создание праймеров и полимеразные цепные реакции 57
3.5.9. Конъюгация 58
3.6. Определение и анализ нуклеотидов 59
3.7. Клонирование и экспрессия генов 59
3.8. Выделение и очистка белков 60
3.9. Определение физико-химических свойств ферментов 61
Глава 4. Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофных бактерий 66
4.1. Накопление эктоина гало- и галоалкалофильными метанотрофами 66
4.2. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z 68
4.3. Экспрессия ectABC генов из Mm. alcaliphilum 20Z в Е. coli 75
4.4. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylomicrobium keniense AMOl 77
4.5. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylophaga alcalica М8 80
4.6. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у
Methylophaga thalassica МТ 83
4.7. Сравнительный анализ генов биосинтеза эктоина у метилотрофных бактерий 85
Глава 5. Клонирование и экспрессия генов биосинтеза эктоина из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z 99
5.1. Клонирование и очистка рекомбинантной ДАБ-аминотрансферазы 99
5.2. Клонирование и очистка рекомбинантной эктоинсинтазы 100
5.3. Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы 101
5.4. Клонирование и очистка рекомбинантной аспартаткиназы 106
Заключение 108
Выводы 110
Список литературы 111
- Особенности метаболизма метилотрофных бактерий
- Органические анионные осмолиты
- Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z
- Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylophaga alcalica М8
Введение к работе
Актуальность проблемы. Микроорганизмы, существующие в условиях высокой солености, для поддержания осмотического равновесия между клеткой и внешней средой * накапливают в клетках неорганические ионы или низкомолекулярные органические соединения - осмолиты или осмопротекторы. Стратегию осмоадаптации, связанную с аккумуляцией органических осмопротекторов - веществ, совместимых с основными метаболическими процессами в клетках, реализуют многие умеренно галофильные прокариоты. Среди них недавно обнаружены аэробные метилотрофные бактерии, выделенные из (гипер)соленых и щелочных водоемов (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; Doronina et al., 2003), использующие в качестве источников углерода и энергии метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные 4 (метилобактерии). Установлено, что аэробные галофильные метилотрофы накапливают циклическую иминокислоту эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат), глутамат и сахарозу (Khmelenina et al., 1999).
Биосинтез эктоина, широко распространенного в микробном мире осмопротектора, у гетеротрофных галофильных бактерий начинается реакцией трансаминирования *- L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L-2,4- [ диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией М-ацетил-Ь-2,4-ДАБ в эктоин (Galinski, 1995). В последние годы предпринимаются попытки детального изучения свойств ферментов и генов этого биохимического пути, что обусловлено практическими задачами получения эктоина, перспективного биопротектора, используемого в медицине и косметике, а также в научной практике в качестве водоудерживающего средства и стабилизатора биомолекул и целых клеток.
Специфические ферменты, катализирующие реакции биосинтеза эктоина - ДАБ-ацетилтрансфераза (EctA), ДАБ-аминотрансфераза (EctB) и эктоинсинтаза (EctC), . частично охарактеризованы только у Halomonas elongata (Ono 'et al., 1998). Гены, кодирующие эти ферменты, идентифицированы у ряда гетеротрофных и автотрофных галофильных прокариот, установлено расположение данных генов в одном опероне ectABC. Однако соответствующие сведения о свойствах ферментов и организации генов биосинтеза эктоина у галофильных метилотрофных бактерий отсутствуют. В связи с ; вышеизложенным представлялось актуальным провести исследование ферментов и генов биосинтеза эктоина у гало(алкало)фильных метилотрофов для выявления степени ^ сходства и/или возможных отличий от других бактерий.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - изучение ферментов и генов биосинтеза эктоина у аэробных гало(алкало)фильных метилотрофов. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Проанализировать содержание эктоина у известных и новых гало(алкало)фильных метанотрофов и метилобактерий.
Исследовать путь биосинтеза эктоина у галоалкалофильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.
Идентифицировать и секвенировать гены, ответственные за биосинтез эктоина у метанотрофов Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylomicrobium keniense AMOl и метилобактерий Methylophaga alcalica M8 и Methylophaga thalassica MT.
Клонировать ectA, ectB, ectC и ask гены, выделить и охарактеризовать рекомбинантные ДАБ-ацетилтрансферазу, ДАБ-аминотрансферазу, эктоинсинтазу и аспартаткиназу из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.
Научная новизна. Установлено, что в ответ на увеличение солености среды изучаемые умеренно галофильные метилотрофные бактерии накапливают в клетках . эктоин. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина у метанотрофов Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylomicrobium keniense AMOl и метилобактерий Methylophaga alcalica M8, Methylophaga thalassica MT. Выявлена различная организация генов биосинтеза эктоина у гало(алкало)фильных метанотрофов и метилобактерий. Показано, что у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylophaga alcalica M8 и Methylophaga thalassica MT гены, кодирующие ДАБ-ацетилтрансферазу (ectA), ДАБ-аминотрансферазу (ectB), эктоинсинтазу (ectC) и аспартаткиназу (ask), сцеплены и составляют оперон ectABCask. Напротив, у Methylomicrobium keniense AMOl гены синтеза эктоина образуют трехгенный оперон ectABC.
Клонированием и экспрессией в Escherichia coli генов ectA, ectB, ectC и ask из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z впервые получены гомогенные препараты ^екомбинантных ДАБ-аминотрансферазы, ДАБ-ацетилтрансферазы, эктоинсинтазы и аспартаткиназы, которые частично охарактеризованы. Обнаружено, что эти белки у метилотрофов формируют единые кластеры на соответствующих филогенетических деревьях. Аминокислотные последовательности EctA, EctB и EctC у метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z имеют более высокое сходство с таковыми у не использующих метан метилобактерий - галоалкалофильной Methylophaga alcalica М8 и галофильной нейтрофилыюй Methylophaga thalassica МТ, по сравнению с аналогичными последовательностями у галоалкалофильного метанотрофа Methylomicrobium keniense AMOl. Полученные результаты создают основу для изучения регуляции биосинтеза эктоина на биохимическом и генетическом уровнях у гало(алкало)фильных метанотрофов и метилобактерий.
Практическое значение работы. Проведенное исследование дает возможность более эффективно реализовать биотехнологический потенциал гало(алкало)фильных метанотрофов и метилобактерий как возможных продуцентов эктоина. Расшифровка нуклеотидных последовательностей и организации ес/-генов позволяет рационально манипулировать данным генетическим материалом, например, путем увеличения дозы этих генов в хромосоме с целью создания более эффективных штаммов-продуцентов эктоина на основе метана или метанола.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2002-2006гг), Всероссийской школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на международной конференции VAAM (Геттинген, Германия, 2002), на 1-ом FEMS Congress of European Microbiologists (Любляна, Словения, 2003), на 6-, 8-, 9- и 10-ой международных школах-* конференциях молодых ученых (Пущино, 2002-2006 гг), на Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2005).
По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 9 тезисов.
Благодарности. Автор благодарен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.х.н. Сахаровскому В.Г. за помощь в анализе и интерпретации Н-ЯМР спектров осмопротекторов, к.х.н. Шляпникову М.Г. за помощь в синтезе олигонуклеотидов, к.б.н. Ивашиной Т.В. за любезно предоставленные штаммы E.coli, а также д.б.н. Дорониной Н.В., Ешинимаеву Б.Ц., Мустахимову И.И. и всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов. Искренне признателен моим родителям и друзьям за всестороннюю поддержку на всем протяжении работы.
Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям к.б.н. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.
Особенности метаболизма метилотрофных бактерий
Окисление метана до метанола катализирует метанмонооксигеназа (ММО), фермент, характерный только для метанотрофных бактерий. Данная мультикопийная ферментная система может быть локализована во фракции растворимых белков клетки (растворимая, рММО) или ассоциирована с мембранами (мембрансвязанная, мММО), что зависит от концентрации ионов меди в ростовой среде.
Гены, кодирующие мММО, организованы в оперон ртоСАВ. У Methylococcus capsulatus Bath и Methylosinus trichosporium ОВЗЬ в хромосоме обнаружены две практически идентичные копии этого оперона (Semrau et al., 1995), а у Methylococcus - еще третья копия гетртоС (Stolyar et al., 1999).
Для проявления активности мММО необходима медь (Prior and Dalton, 1985) и, как недавно было показано, ионы железа. Донорами электронов для очищенной ферментной системы служат аскорбат, дурохинол и метанол, но не НАД(Ф)Н. мММО имеет высокое сродство к метану (Км = 1 - 2 мкМ) и кислороду (К„ = 0.1 мкМ), но обладает узкой субстратной специфичностью, окисляя лишь алканы, алкены и метанол (Lieberman and Rosenzweig, 2004).
Растворимая ММО обнаружена у Мс. capsulatus Bath, представителя X типа, у большинства культур II типа и трех метанотрофов I типа: Methylomonas methanica 68-1 (Koh et al., 1993), Methylomicrobium sp. N1 (Fuse et al., 1998), Methylomicrobium buryatense 5G (Kalyuzhnaya et al., 2001). рММО соокисляет широкий спектр ароматических, гетероциклических, ациклических и галогенированных углеводородов (Grosse et al., 1999). Однако рММО имеет более низкое сродство к метану (Км= 3 мкМ) и кислороду (Км= 16.8 мкМ). Кроме того, рММО функционирует только при низких концентрациях меди в среде ( 0.8 мкМ) (Lieberman and Rosenzweig, 2004). рММО - цитоплазматический ферментный комплекс, состоящий из трех компонентов: гидроксилазы (А), редуктазы (С) и регуляторного белка (В). Гидроксилазный компонент представляет собой комплекс OC2P2Y2 (250 кДа) с молекулярной массой субъединиц 60 кДа (а), 45 (Р) и 20 (у) кДа, причем а субъединица имеет двуядерный негемовый железный центр (Lieberman and Rosenzweig, 2004). Редуктазный компонент (38.4 кДа) содержит ФАД и [ТегЗгІ-кластер. Редуктаза акцептирует электроны от НАДН, перенося их на двухжелезный сайт гидроксилазы. Регуляторный компонент -15.8 кДа белок В, не содержит простетической группы и кофакторов, но связывается с гидроксилазным компонентом и необходим для эффективной работы рММО (Smith et al., 2002). Экспрессия растворимой формы ММО определяется содержанием меди в среде культивирования и регулируется на уровне транскрипции (Morton et al., 2000).
Окисление метанола до формальдегида катализируют метанолдегидрогеназы (МДГ), различные у грамотрицательных и грамположительных метилобактерий. НАД(Ф)+ - независимая МДГ впервые найдена у Methylobacterim sp. М27 (Anthony, Zatman, 1964), состоит из двух а (60-67 кДа) и двух Р (8.5 кДа) субьединиц, двух молекул пирролохинолинхинона (PQQ) и одного атома кальция (Anthony, 1992), характерна для большинства грамотрицательных метилотрофных бактерий. Фермент окисляет первичные спирты и формальдегид, требует ионы аммония или метиламин в качестве активатора, имеет высокий оптимум рН (9.0) и использует in vitro в качестве акцептора электронов феназинметосульфат (ФМС) или другие искусственные акцепторы, но не пиридиннуклеотиды; in vivo электроны передаются на цитохром с (Duine et al., 1979).
Генетические исследования Methylobacterium extorquens AMI показали участие 25 генов в окислении метанола (Zhang, Lidstrom, 2003). Три из этих генов кодируют структурные белки: mxaF кодирует большую (a), a mxal - малую (Р) субъединицы МДГ, mxaG, кодирует цитохром CL - первичный акцептор электронов, поступающих от МДГ (McDonald and Murrell, 1997). В свою очередь, цитохром CL окисляется цитохромом сц (Anthony, 1986). Показано, что mxaF является одним из наиболее консервативных структурных генов у метилотрофных бактерий (Bastien et al., 1989).
Окисление формальдегида. Формальдегид (ФА) является центральным Сі-метаболитом, поступающим в первичные пути ассимиляции (РМФ и сериновый), а также подвергающимся дальнейшему окислению с целью получения восстановительных эквивалентов энергии. У аэробных метилотрофов выявлено несколько ферментных систем, участвующих в окислении формальдегида до СС : 1) прямое окисление через формиат до СО2. У метилотрофов формальдегид может окисляться до формиата формальдегиддегидрогеназой (ФАДГ). НАД(Ф)+-зависимая ФАДГ присутствует в цитоплазме у Мс. capsulatus Bath. Фермент является гомотетрамером с молекулярной массой субъединицы 63 кДа и способен окислять, кроме ФА, глиоксаль, гликольальдегид и глицеральдегид. Субстратная специфичность и кинетические свойства ФАДГ регулируются белком (8.6 кДа) - модифином (Tate and Dalton, 1999). Кроме того, у Мс. capsulatus Bath обнаружена мембрансвязанная ФАДГ содержащая PQQ. Фермент, возможно, ассоциирован с электронно-транспортной цепью через цитохром 6-типа или хинон (Zahn et al., 2001). У метанотрофа Methylobacter marina А45 обнаружена НАД(Ф)+-зависимая ФАДГ, по структуре гена и энзиматическим свойствам отнесена к III классу алкогольдегидрогеназ (Speer et al, 1994). ФАДГ из Methylosinus trichosporium ОВЗЬ состоит из двух идентичных субъединиц. Акцепторами электронов ФАДГ служили ФМС, феназинэтосульфат и 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ). Предполагается, что фермент является гемопротеином, содержащим гем с-типа (Patel et al., 1980). НА/Г/ -зависимая ФАДГ обнаружена у метилобактерий Arthrobacter PI и Amycolatopsis methanolica (Attwood et al., 1992; van Ophem et al., 1992). Фермент из A. methanolica является тримером и содержит 6 атомов цинка. ФАДГ из Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 является гомотетрамером и в качестве простетической группы, возможно, содержит PQQ (Klein et al., 1994). 2) диссимиляциоппый гексулозофосфатпый цикл. Окисление ФА до СОг, происходящее в диссимиляционной ветви РМФ-цикла, не связано с участием дегидрогеназ формальдегида и формиата, а представляет собой последовательную цепь реакций, катализируемых синтазой и изомеразой З-гексулозо-6-фосфата, изомеразой фруктозо-6 фосфата, дегидрогеназами глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата. Последняя дегидрогеназа является декарбоксилирующей. В результате этого циклического пути происходит образование СОг, 2 моль НАДФН и регенерация рибулозо-5-фосфата, первичного акцептора ФА. Метилобактерий с сериновым или РБФ путями получают энергию посредством прямого окисления ФА до формиата и СОг. Напротив, бактерии с РМФ-путем реализуют оба способа окисления формальдегида в разных соотношениях. Однако у метанотрофов функционирование диссимиляционного гексулозофосфатного цикла in vivo выявить не удалось, что объясняется низкими активностями дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата (Соколов, Троценко, 1977).
Органические анионные осмолиты
Несколько полярных молекул, относящихся к осмолитам и не обладающих общим зарядом, идентифицированы у галофильных бактерий и эукариот (табл. 4).
Полиолоы (глицерин, арабит, инозит) синтезируются de novo галофильными и галотолерантными грибами, дрожжами и водорослями (глицерин накапливают галофильная Dunaliella и галотолерантные дрожжи Hortea wernecru). Глицерин и арабит являются обычными осмопротекторами ксерофильных растений и галофильных эукариот {Dunaliella viridans), но также распространены у галофильных прокариот (Grant, 2004).
Сахароза и трегалоза. Эти дисахариды широко распространены у эукариот и прокариот. Как правило, накопление сахарозы свойствено цианобактериям, обитающим в пресноводных и морских экосистемах, например: Scytonema, Synechococcus, Anabaena, Nostoc (Reed et al., 1986; Hershkovitz et al., 1991). Напротив, накопление трегалозы характерно для многих бактериальных групп, включая цианобактерии, аноксигенные фототрофные виды семейства Thiocapsa, Thiocystis, Chromatium, а также Azotobacter chroococcum, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Rhizobium meliloti и E. coli (Galinski, 1995; da Costa et al., 1998).
Хотя сахароза обнаруживается у цианобактерии при осмотическом стрессе и, вероятно, действует как осмопротектор, ее роль в осмоадаптации неясна. Так, ген сахарозофосфатсинтазы из Synechocystis РСС 6803 был клонирован, однако его экспрессия в ответ на солевой стресс не выявлена (Lunn et al., 1999). Тем не менее, у цианобактерии Scytonema sp. в ответ на солевой стресс увеличивались внутриклеточные уровни сахарозы и трегалозы, но уменьшались при возвращении культуры в нормальные условия роста. При гиперосмотическом шоке у этой цианобактерии возрастали активности трегалозофосфорилазы и сахарозофосфорилазы (Page-Sharp et al., 1999).
Сахароза и трегалоза часто присутствуют у галофильных бактерий как минорные компоненты ( 500 мМ) в сочетании с другими более эффективными осмолитами, такими как бетаин или эктоин (Severin et al., 1992). Существует предположение, что трегалоза не имеет первичной осмотической функции, а феномен её накопления является отражением "узкого места" в метаболизме или следствием лимита по азоту (Galinski and Herzog, 1990). Это, однако, не исключает взаимосвязи нескольких факторов, запускающих биосинтез трегалозы.
Накопление трегалозы приводит к значительной солеустойчивости Е. coli (до 0.5 М NaCl). Биосинтез трегалозы может осуществляться несколькими путями: 1) конденсацией УДФ-глюкозы и глюкозо-6-фосфата (трегалозо-6-фосфат является интермедиатом), 2) образованием из гликогена и 3) превращением мальтозы в трегалозу. Первый путь биосинтеза хорошо охарактеризован у Е. coli (Kaasen et al., 1994). Второй путь биосинтеза трегалозы обнаружен у некоторых бактерий, таких как Arthrobacter sp. (Maruta et al., 1996a) и гипертермофильной архей Sulfolobus acidocaldarius (Maruta et al., 1996b). Третий путь биосинтеза трегалозы идентифицирован у Mycobacterium tuberculosis (De Smet et al., 2000) и Thermus thermophilus RQ-1 (Silva et al., 2003). Бактерии могут использовать один, два или все три пути биосинтеза трегалозы одновременно.
Установлено, что трегалоза и сахароза предохраняют мембраны, белки и целые клетки от общей дегидратации (Louis et al., 1994), часто связанной с увеличением солёности среды. При высушивании Е. coli DH5a и Bacillus thuringiensis HD-1 в присутствии 100 мМ трегалозы выживало 70% и 57% клеток, соответственно, а в присутствии сахарозы - 56% и 44% клеток. При этом только 8% клеток Е. coli и 14% клеток В. thuringiensis выживало при высушивании без Сахаров (Leslie et al., 1995). Трансформанты Е. coli BL21(DEЗ),coдepжащиe ген сахарозофосфатсинтазы из цианобактерии Synechocystis sp. РСС6803.синтезировали сахарозу, в результате чего в 104 раз увеличилась выживаемость клеток, по сравнению с клетками дикого типа, при замораживании-оттаивании и высушивании (Billi et al., 2000).
У Agrobacterium tumefaciens, устойчивого к 2% NaCl, обнаружен необычный дисахарид, манносахароза (Р-фруктофуранозил-сс-маннопиранозид). Вероятно, этот дисахарид участвует в осморегуляции (Smith et al., 1990).
Некоторые негалофильные бактерии способны к галоадаптации (Е. coli, Salmonella typhimuhum, Rhizobium meliloti), накапливая, наряду с глутаматом калия, существенные количества трегалозы («200 мМ). У Е. coli ионы К+, глутамат и трегалоза быстро заменяются на другие органические осмопротекторы (глицинбетаин) при росте в сложной среде с дрожжевым экстрактом, причем Е. coli лучше растёт при более высоких концентрациях соли, чем в минеральной среде. Дрожжевой экстракт содержит осмолиты и их предшественники. Верхняя граница солеустойчивости Е. coli повышается с 0.5 до 0.85 М NaCl при добавлении в ростовую среду органических осмолитов (например, бетаина). Таким образом, осмотолерантность в значительной степени зависит от состава ростовой среды (Galinski, 1995; da Costa et al., 1998).
При росте на среде с высоким уровнем сахарозы Zymomonas mobilis превращает сахарозу в глюкозу и сорбит, которые служат как совместимые растворимые вещества. Накопление полиолов у Z mobilis представляет интересный пример конвергентной эволюции в осмоадаптации, поскольку, подобно многим дрожжам, эта бактерия осуществляет модификацию Сахаров, присутствующих в ростовой среде (Loos et al., 1994). Pseudomonas putida S12 накапливает маннит при осмотическом стрессе (Kets et al., 1996), следовательно, накопление полиолов может быть более общим свойством бактерий, чем считалось прежде.
Гликозилглицерин структурно относится к фторидозидам (O-a-D-галактопиранозил-(1— 2)-глицерин) и изофторидозидам (0-сс-0-галактопиранозил-(1— 1)-глицерин). Это соединение обнаружено у некоторых красных водорослей Chrysophyceae и представлено как осмолит у ряда умеренно галофильных цианобактерий {Synechocystis sp РСС6803) с невысокой толерантностью к NaCl (Reed et al., 1986), умеренно галофилыюй пурпурной бактерии Rhodobacter sulfidophilus и галотолерантных псевдомонад P. mendocina, P. pseudoalcaligenes (Galinski, 1995; da Costa et al., 1998), а также у 26 штаммов, псевдоманад, выделенных из Балтийского моря (Mikkat et al., 2000). Следовательно, это соединение широко распространено у организмов с умеренной устойчивостью к соли. У Rhodothermus marinus и R. obamensis при солевом стрессе обнаружено накопление ос-маннозилглицерамида (Silva et al., 1999).
Незаряженные аминокислоты и пептиды. Производные глутамина, содержащие глутамин-1-амид как характерный структурный элемент, карбамоилированы или ацетилированы по а- аминогруппе. В случае дипептидов эти группы присоединяются к карбоксилу второй аминокислоты. Ка-карбамоил-Ь-глутамин-1-амид описан пока только у фототрофной бактерии Ectothiorhodospira marismortui, где его количество составляло от 30 до 37% общего пула растворённых веществ (Oren et al., 1991).
Нейтральный дипептид Na-ацетилглутаминил-глутамин-І-амид (NAGGN) обнаружен у Rhizobium meliloti, P. fluorescens, P. aeruginosa, P. putida, P. mendocina (Smith and Smith, 1989; D Souza-Ault et al., 1993; Kets et al., 1996). У P. putida, его внутриклеточный уровень зависел от химического состава и осмолярности среды. Так при добавлении бетаина в культуральную среду снижалось накопление NAGGN. Очевидно, бетаин - более эффективный осмопротектор, а его поглощение из среды, вероятно, является менее энергозатратным процессом, чем синтез de novo (Kets et al., 1996).
Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z
Для коньюгации использовали штамм - донор Е. coli S17-1, который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pCMaskN-his или pCMaskC-his (полученные на основе рСМ160). 10 мл ночной культуры Е .coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды "К" (без метанола). Клетки ресуспендировали в 0.5 мл среды "К". В качестве реципиента использовали штамм Methylobacterium extorquens AMI. 50 мл культуры, выращенной до ОПбоо=0.4, центрифугировали и промывали средой "К". Клетки метилобактерий ресуспендировали в 0.5 мл среды "К" и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток Е. coli. Смесь переносили на агаризованную среду "К", содержащую 0.2% Proteose peptone ("USBiological", США) и чашки инкубировали 24 ч при 28 С. После инкубации, клетки смывали с поверхности агара 2 мл стерильной среды "К". Аликвоту суспензии 10-20 мкл растирали на селективной агаризованной среде "К", содержащей 0.5% метанола и 30 мкг/мл канамицина. Чашки инкубировали до образования колоний (обычно 6 дней). Для удаления (присутствующих) клеток Е. coli, трансконьюганты пересевали на агаризованную среду "К", содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицинаСеквенирование ДНК проводилось на фирме "Силекс" (Москва), а также к.б.н. Калиманом А.В. (Институт Белка РАН, Пущино) с помощью "Big Dye Terminator Ready Reaction Kit" ("Applied Biosystems", США) на автоматическом ДНК секвенаторе "DNA Sequencer ABI PRISM 310" ("Applied Biosystems", США), в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Использовали 0.3-0.5 мкг ПЦР фрагмента и соответствующий праймер. Для определения полной последовательности нуклеотидов в ДНК фрагментах, длина которых превышала 1000 п.н., на основе полученных последовательностей конструировали новые праймеры. Эти праймеры использовали затем для реакций секвенирования.
Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотную, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00, пакета программ VectorNTIAdvance v.9.0, DNAStar v.4.04 и Clone Manager 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (vl.62b) (Thompson et al., 1997) и GeneDoc. Филогенетический анализ осуществляли с помощью пакета программ PHYLIP v.3.6, используя программы SEQBOOT, PROTPARS и CONSENSE (Felsenstein, 2004).
Ген ectA, содержащий сайт для рестриктазы Ndel при инициирующем кодоне и сайт на 3 конце фрагмента для Xhol, амплифицировали из геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z с использованием праймеров EAN и ЕАС (табл. 10). Фрагмент после обработки рестриктазами Ndel и Xhol, содержащий ген ectA, лигировали в вектор рЕТ22Ь+, с образованием вектора pETectA.
Гены ectB и ectC амплифицировали с использованием пары праймеров ectBN - ectBC и ectCN - ectCC, соответственно. ПЦР-продукты обрабатывали рестриктазами Ndel и Xhol. Фрагмент, содержащий ген ectB, лигировали в вектор рЕТ22Ь+, а фрагмент, содержащий ectC, лигировали в вектор рЕТ30а+, с образованием векторов pETectB и pETectC, соответственно.
Ген ask амплифицировали с использованием пары праймеров askN - PET19Z и askN-Bgl. Фрагмент, полученный с праймеров askN - PET19Z, обрабатывали рестриктазами Ndel и ВатШ и лигировали в вектор pET19mob с образованием вектора pET19mob/oyA:. Фрагмент ДНК, полученный с праймеров askN - Bgl, обрабатывали Ndel и Z?g/II и лигировали в вектор рЕТ30а+ с образованием вектора рЕТЗО/ask.
Полученные рекомбинантные плазмиды pETectA, pETectB, pETectC, pbT\9mdb/ask и рЕТЗО/ask трансформировали в Е. coli BL21(DE3). Экспрессию генов ectA, ectB, ectC, и ask индуцировали добавлением ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ, клетки инкубировали 2 ч при 25 С. Скрининг колоний на супер-экспрессию белков проводили стандартным электрофорезом по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
Ген ask был амплифицирован с плазмиды TpET\9moh/ask с использованием праймеров askCM и PET19Z. ДНК-фрагмент обрабатывали рестриктазами Xbal и ВатШ, клонировали в вектор рСМ160 (предварительно раскрытый по тем же рестриктазам) с образованием вектора pCMaskN-his.
Кроме того, ген ask амплифицировали с плазмиды рЕТЗО/ask, используя праймеры PCMN и РСМС. ПЦР-фрагмент обрабатывали рестриктазами Sphl и Xbal, лигировали в рСМ160 (предварительно раскрытый по тем же рестриктазам) с образованием вектора pCMaskC-his. Полученные вектора pCMaskN-his и pCMaskC-his использовали для коньюгативного переноса в Methylobacterium extorquens AMI.
Фрагмент ДНК, содержащий гены ectABC, был клонирован в вектор pHSG575, с образованием вектора ptiSGectABC. Для амплификации использовали праймеры Oprl и Орг2, которые располагались на расстоянии в 302 п.н. вверх от гена ectA и 173 п.н. вниз от гена ectC, соответственно.
Клетки E.coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA и pETectB, выращивали в 0.5 л среды LB с Amp (50 мкг/мл для pETectA и pETectB) или с Km (30 мкг/мл для pETectC) при 37 С до оптической плотности Абоо= 0.6-0.7, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 С в течение 3 ч. Белки выделяли из суперпродуцента Е. coli, как описано в протоколах фирмы "Quaigen" (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-HCl рН 8.0, 150 мМ КС1, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3x0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 С, супернатант наносили на колонку, содержащую №2+-нитроацетат агарозу ("Quiagen"), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-HCl рН 8.0, 150 мМ КС1, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом ДСН электрофореза по Лэммли. Фракции, содержащие целевой белок (EctA-His6ag, EctB-His6ag или EctC-His6ag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КС1 для ДАБ-ацетилтрансферазы, 300 мМ КС1 для ДАБ-аминотрансферазы и 500 мМ NaCl для эктоинсинтазы) и концентрировали с помощью Microcon YM-10 ("Millipore", США).
Для дополнительной очистки EctA-His6ag раствор фермента наносили на колонку (1.5 х 7.5 см) с Blue Sepharose 6FF ("Pharmacia", Швеция), уравновешенную 50 мМ Трис-НС1 буфером, рН 8.0. ДАБ-ацетилтрансферазу (ДАБАцТ) элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 0-0.5 М в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 8.0 со скоростью 30 мл/ч. Фракции с ДАБАцТ активностью объединяли и концентрировали с помощью Microcon YM-10. Фермент хранили при 4 С.
Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у Methylophaga alcalica М8
На основании сходства аминокислотной последовательности и аналогичного расположения гена ectD рядом с генами ectABC у S. chrysomallus можно предположить, что обнаруженные гидроксилазы у галофильных бактерий имеют аналогичную функцию.
Обнаруженная гидроксилаза (Phy) из Mm. alcaliphilum 20Z располагается рядом с ect-генами и проявляет сходство (48% идентичности) с эктоингидроксилазой из S. chrysomallus. Поскольку нам не удалось выявить накопление гидроксиэктоина в клетках Mm. alcaliphilum 20Z, нельзя с уверенностью утверждать, что функция Phy связана с гидроксилированием эктоина. Возможно, экспрессия гена гидроксилазы осуществляется в условиях культивирования, отличающихся от оптимальных. Тот факт, что гидроксилаза не входит в состав мРНК ectABCask генов у Mm. alcaliphilum 20Z, косвенно свидетельствует о том, что экспрессия гена phy не находится под контролем промотора ес/-генов. Не исключено также, что в процессе эволюции были нарушены последовательности, необходимые для регуляции экспрессии гидроксилазы, либо произошло нарушение связи ectABCask и гидроксилазы, что стало причиной явления "молчащего гена". Для полного выяснения функции и регуляции экспрессии гидроксилазы у Mm. alcaliphilum 20Z требуются дополнительные Поиск в базе данных GenBank ес/-генов выявил их присутствие в геномах у галоалкалофильной бактерии Bacillus halodurans, почвенной бактерии Streptomyces coelicolor, S. chrysomallus, Virgibacillus pantothenticus, Oceanobacillus iheyensis, Nocardia farcinica, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis и др. Однако участие ес/-генов в биосинтезе эктоина у этих бактерий определено только на уровне сходства аминокислотных последовательностей с таковыми у Bacillus pasteurii, Halomonas elongata, Marinococcus halophilus, Chromohalobacter salexigens и Vibrio cholerae, у которых эта функция доказана (Kuhlmann and Bremer, 2002; Canovas et al., 1997, 1998; Louis and Galinski, 1997; Calderon et al., 2004; Pflughoeft et al., 2003). Анализ показал, что у большинства перечисленных бактерий гены биосинтеза эктоина располагаются близко друг от друга и, возможно, составляют трехгенный оперон ectABC (рис. 32). В некоторых случаях к трем генам примыкает ген эктоингидроксилазы {ectD) (например, у S. chrysomallus и др) или аспартаткиназы (ask) (представители рода Vibrio и др.). У Roseovarius nubinhibens и Acidiphilium cryptum в состав ес/-оперона, возможно, входят пять генов, где непосредственно за ectABC располагаются предполагаемые гены эктоингидроксилазы и аспартаткиназы, соответственно.
Нами впервые показано, что, в отличие от большинства гетеротрофных галофильных бактерий, у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylophaga alcalica M8 и Methylophaga thalassica MT гены синтеза эктоина сцеплены и составляют оперон ectABCask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask). Напротив, у Methylomicrobium keniense AMOl гены синтеза эктоина образуют трехгенный оперон ectABC, что кореллирует с низким уровнем эктоина и меньшей солеустойчивостью этой бактерии, по сравнению с Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica М8 и М. thalassica МТ (рис. 32).
Появление гена ask в кластере ес/-генов косвенно указывает на регуляторную роль аспартаткиназы в распределении потока углерода по двум метаболическим путям и обеспечивает независимость синтеза эктоина и других аминокислот аспартатного семейства (лизина, треонина и метионина), поскольку позволяет предотвратить влияние ретроингибирования первой реакции биосинтеза этими аминокислотами.
Кроме того, у некоторых бактерий могло иметь место исключение отдельных генов из состава оперона ectABC или их дупликации в другие участки хромосомы. Так, например, в опубликованном геноме Marinobacter aquaeolei на разных его участках нами обнаружены три гена эктоинсинтазы, при этом гены ectABask располагаются независимо от генов эктоинсинтаз (GenBank №AALG01000013). Более того, в геноме Nitrosococcus осеат предполагаемые гены ectCask и ectABD располагаются на разных участках хромосомы (GenBank №СР000127).
У умеренно галофильной бактерии Chromohalobacter salexigens DSM 3043, накапливающей гидроксиэктоин, гены биосинтеза эктоина располагаются в последовательности ectABC (Calderon et al., 2004). Анализ генома этой бактерии показал, что предполагаемый ген эктоингидроксилазы, функция которого связана с образованием гидроксиэктоина из эктоина, находится на другом участке хромосомы.
В геномах Pseudomonas syringae (GenBank №AAY35406), Cobetia marina (GenBank №DQ124872), Bradyrhizobium japonicum (GenBank №BAC47371), Burkholderia ambifaria (GenBank № NZ_AAJL01000002) обнаружен только один ген, кодирующий схожий с эктоинсинтазой белок. Поэтому остается неясным, могут ли эти бактерии синтезировать эктоин de novo, или образуют его из предшественников (Л -ацетилдиаминобутират), поглощаемых из среды.
Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей EctA, EctB и EctC метилотрофных бактерий показало, что у галоалкалофильного метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z эти белки имеют большее сходство с соответствующими белками из не использующих метан метилобактерий - галоалкалофильной М. alcalica М8 и галофилыюй нейтрофильной М. thalassica МТ, по сравнению с таковыми у другого вида метанотрофов -Mm. keniense AMOl (табл. 14-16). При этом EctA, EctB и EctC мегилотрофных бактерий формируют единые кластеры на соответствующих филогенетических деревьях, включающих ферменты гетеротрофных галофилов (рис. 33-35).
Выявленная особенность организации ес/-генов в хромосоме Mm. alcaliphilum 20Z - их локализация в опероне ectABCask, коррелирует с особенностями центрального метаболизма облигатных метанотрофов. Аспартаткиназа катализирует первую реакцию пути биосинтеза аминокислот аспартатного семейства (треонина, метионина и лизина), ответвлением которого является последовательность, обеспечивающая синтез эктоина. При этом известно, что аспартаткиназа, инициирующая этот биосинтетический путь, у гетеротрофных бактерий представлена несколькими изоформами, активность которых регулируется аминокислотами - конечными продуктами данного пути (Wampler and Westhead, 1968). Однако, у облигатных метанотрофов, изоформы аспартаткиназы не найдены (Малашенко и др., 1987). Кроме того, проведенный нами анализ аннотированного генома термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus (Bath) выявил только один ген ask в хромосоме этой бактерии (Ward et al., 2004). По-видимому, наличие у гетеротрофов нескольких изоформ Ask обеспечивает достаточно эффективный биосинтез эктоина без участия специфической аспартаткиназы. Поэтому появление дополнительного гена в эктоиновом опероне у метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z вполне закономерно. Экспрессия гена аспартаткиназы под единым для ect-генов промотором обеспечивает относительно независимый от других аминокислот аспартатного семейства синтез эктоина, что становится актуальным при наличии только одной формы аспартаткиназы в анаболическом пути синтеза треонина, метионина и лизина.
