Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 12
1. Молекулярные шапероны 12
Семейство Hsp60 16
Семейство Hsp70 18
Семейство Hsp90 21
Семейство HsplOO 21
Малые белки теплового шока 22
Специализированные шапероны 28
Роль белков теплового шока в функционировании живых
систем в норме и патологии 28
Шапероноподобные белки 31
Кальнексин и кальретикулин 31
Протендисульфидизомераза 31
Пептидил-пролил-цис-транс-изомераза, триггер фактор 31
Антитела как специфические шапероны 34
Ускорение агрегации белков 35
2. Фактор ннгибирования миграции макрофагов ...38
MIFH глюкокортикоиды 39
Структура MIF 42
Механизм таутомеразной активности MIF 45
Таутомеразные ингибиторы 47
Рецептор MIF 47
MIF-связывающие белки 48
MIF-подобные белки 48
Клеточные и тканевые источники MIF 49
Передняя доля гипофиза 49
Моноциты/макрофаги 50
Т-кпетки 51
Участие MIF в патогенезе некоторых заболеваний 52
Материалы и методы исследования 54
Материалы 54
Получение экстракта мозга быка 54
Гель-фильтрация 55
N-концевое микросеквенирование 55
Кето-енол таутомеразная активностьМИ1 55
Электрофорез и иммуноблоттинг 55
Обратно-фазовая HPLC 56
Эксклюзионная хроматография в системе FPLC 56
Выделение гликогеифосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика 57
Определение ферментативной активности Ph Ъ HMDH 57
Анализ шапероноподобной активности 58
Результы и их обсуждение 59
Выделение MIF из мозга быка 59
Свойства MIF 63
Шапероноподобная активность MIF 66
Влияние MIF на агрегацию модельных белковых субстратов . 66
Анализ кинетических кривых агрегации. 72
Предполагаемый механизм действия MIF. 73
Исследование изменения ферментативной активности
субстратов в процессе агрегации 74
Усиление агрегации белков в присутствии MIF 77
Выводы 84
Список цитируемой литературы 86
Благодарности 107
- Семейство Hsp70
- Механизм таутомеразной активности MIF
- Влияние MIF на агрегацию модельных белковых субстратов
- Усиление агрегации белков в присутствии MIF
Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярные шапероны обладают способностью защищать белки, утратившие нативную конформацию при стрессорных воздействиях различного характера. Эта способность проявляется при взаимодействии шаперонов с гидрофобными участками развернутых или неправильно свернутых белков, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации и приводит, в конечном итоге, к сохранению их нативного состояния.
При температурах, превышающих физиологический уровень, в клетках наблюдается активация синтеза молекулярных шаперонов, известных как белки теплового шока (heat shock proteins, HSP). Некоторые из них (HSP70, GroEL) способствуют рефолдингу белков, подвергнутых тепловому повреждению, к нативному состоянию, в то время как другие (а-кристаллин, малые HSP) только тормозят агрегацию белков и стабилизируют их структуру. Белковые агрегаты могут подвергаться солюбилизации и рефолдингу с образованием биологически активной конформации под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза и протеиндисульфидизомераза), различные шапероноподобные белки и пептиды [Puig et al., 1997; Sharma et al., 2000; Manna et al., 2001; Bhattacharyya et al., 2003].
В связи с многообразием и широким спектром действия шаперонов в различных компартментах клетки интерес к ним не ослабевает и список вновь открываемых шапероноподобных белков неуклонно растет. Однако, несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов при денатурации и агрегации белков в условиях стресса, молекулярные механизмы действия шаперонов остаются невыясненными.
Все известные в настоящее время шапероны обладают общими свойствами: они имеют гидрофобные домены, экспонированные на поверхности их молекулярных структур, способные узнавать и связывать определенные интермедиаты фолдинга белковых ^уКотрятрп Однако структурно-
"»С НАЦИОНАЛЬНАЯ, БИБЛИОТЕКА
ъж-
С-Ъ*пр6ургС ' '
» 09
функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны.
В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфипатической вторичной структуры. Одним из таких белков является фактор ингибирования миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor, MIF), принадлежащий к семейству цитокинов. Около 40 лет назад MIF был идентифицирован как фактор, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, по его способности тормозить миграцию макрофагов in vitro [Bloom and Bennet, 1966]. В последующие годы было показано, что низкомолекулярный высококонсервативный белок MIF (12,5 кДа) широко распространен в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих), его наибольшее количество обнаружено в макрофагах и в различных отделах мозга. Далее MIF был вновь «открыт» как медиатор системного ответа организма на стресс [Bucala, 1996; Donn and Ray, 2004], однако, его участие в биохимических механизмах формирования защитных реакций организма при тепловом шоке ранее не исследовалось, хотя структурно-функциональные характеристики MIF аналогичны многим шапероноподобным белкам.
Целью настоящей работы является изучение шапероноподобных свойств MIF в тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики тепловой агрегации модельных белковых субстратов. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
-
Выделить MIF из мозга быка в гомогенном состоянии и изучить его физико-химические и ферментативные свойства.
-
Исследовать влияние MIF на кинетику тепловой агрегации белковых субстратов - малатдегидрогеназы (MDH) из сердца свиньи, гликогенфосфорилазы Ъ (Ph b) из скелетных мышц кролика и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (ADH) при различных температурах (41-48С) и
концентрациях белков.
-
Исследовать возможность реактивации частично денатурированных белковых субстратов под влиянием MIF.
-
Проанализировать изменения олигомерного состояния белковых субстратов и MIF при тепловом воздействии.
Научная новизна и практическая ценность работы. Наряду с традиционными представлениями о защите клеток от теплового повреждения с помощью системы, включающей шапероны и ферменты фолдинга, рассмотрена возможность существования пути регуляции, опосредуемого биологическими эффектами низкомолекулярньгх термостабильных гидрофобных белков, имеющих амфипатическую вторичную структуру.
Показано, что MIF, выделенный из мозга быка с использованием нового оригинального метода, обладает шапероноподобными свойствами. Это подтверждается следующими экспериментальными результатами:
при исследовании кинетики термоагрегации MDH и Ph Ъ турбидиметрическим методом продемонстрировано торможение агрегации белковых субстратов под действием MIF;
обнаружено защитное действие MTF в процессе термоинактивации частично денатурированных MDH и Ph Ь\
показано, что в зависимости от экспериментальных условий MIF может как тормозить, так и ускорять агрегацию белков. При температуре, близкой к физиологическому уровню (41,5С), наблюдается образование легко растворимых агрегатов и стабилизация олигомерной структуры субстрата, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия. Таким образом, в этих условиях МЕР может играть шапероноподобную роль;
анализ состояния агрегатов с помощью электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях показывает, что защитное действие MEF проявляется в торможении роста агрегатов субстратного белка.
Полученные данные позволяют существенно расширить представления о шапероноподобных белках, а также о механизмах регуляции их шаперонной активности. Наличие в молекуле шаперона гидрофильных сайтов способствует лучшему растворению гетероагрегатов, образующихся при тепловом стрессе.
Большой интерес к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов вызван не только проблемами, связанными с процессами агрегации при получении рекомбинантных белков, но и с необходимостью разработки эффективных средств защиты клеток в условиях развития патологических состояний в результате нарушения конформации белков. Это направление исследований представляется также весьма перспективным в выявлении защитных реакций организма при температурах среды, близких к физиологически допустимому уровню (41-43С), что может иметь большое значение в биологии и медицине.
Обладая выраженной стабильностью и способностью к образованию амфифильной вторичной структуры, стресс-индуцируемый белок, MIF, в сочетании с другими белками с аналогичными свойствами может войти в семейство конститутивно экспрессируемьгх «малых шаперонов», участвующих в адаптации организма к стрессу, на начальных этапах его развития.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пушино, 2003); на 19-ой конференции Международного нейрохимического общества, ISN (Гонконг, 2003); на Ш Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" (Тюмень, 2005), на FEBS конгрессе (Будапешт, 2005).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в ведущих российских и зарубежных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
Семейство Hsp70
В отсутствие субстратов АТФазная активность GroEL ингибируется GroES. GroEL и GroES содержатся в клетке в больших количествах и синтезируются конститутивно. Показано, что GroEL участвует в образовании активной конформации ряда ферментов - прокариотической рибулозобисфосфаткарбоксилазы, цитратсинтазы и других [Gething, Sambrook, 1992; Goloubinoff et al., 1989]. Частично прошедшие укладку протомеры этих белков образуют бинарные комплексы с GroEL. Полипептиды в конечном итоге высвобождаются из комплексов в форме, которая необходима для выполнения физиологической функции.
Семейство Hsp70. Представители семейства Hsp70 характеризуются АТФазной активностью. В Е. coli они представлены шапероном DnaK, в цитозоле эукариот - шапероном Hsp72, в митохондриях - Hsp73 (mHsp), а в ЭР - шапероном Вір. В структуру Hsp70 входят две функциональные области. N-конец представляет собой высококонсервативную АТФазную область, которая прочно связывает АДФ и АТФ (в присутствии Mg2+ и К+) и гидролизует АТФ, тогда как С-концевая область требуется для связывания полипептида [Fink, 1998; На et al., 1998]. Для реализации фолдинга требуется совместное функционирование обоих доменов. Многие функции Hsp70 и DnaK осуществляются с участием двух кофакторов DnaJ и GrpE соответственно [Hartl, 1996; Hightower, Leung, 1998].
Шапероны семейства Hsp70, локализованные в митохондриях и ЭР, необходимы не только для укладки полипептидов, но и для процесса их транслокации через мембраны [Ungermann et al., 1994]. Полипептидная цепь проходит через митохондриальную мембрану в развернутом состоянии. mHsp79 присоединяется к соответствующему сайту переносимой цепи, как только она появляется на внутренней мембране, и предотвращает ее скольжение назад. Участие Hsp70 в транслокации полипептида сопровождается гидролизом АТФ.
Структура белков, относящихся к семейству Hsp70, весьма консервативна в плане эволюции; значительные участки полипептидной цепи ( 50%) этого белка идентичны у про- и эукариот [Bardwell, Craig, 1984; Pelham, 1989]. Семейство Hsp70 весьма обширно. Большинство организмов имеет множество разных стереотипов Hsp70. В эукариотах обнаружены, по меньшей мере, около 12 стереотипов в различных компартментах клеток.
Наиболее известные шапероны этого семейства млекопитающих: конститутивная и стресс-индуцируемая цитозольные формы Hsc70 (Hsp73 и Hsp72 соответственно); ВІР (Grp78) - форма, обнаруженная в ЭР; mHsp70 (Grp75). В дрожжах гомологами Hsc70 и ВІР являются Ssal-4 и Каг2 соответственно [Fink, 1999].
Была определена структура Hsc70 млекопитающих [Flaherty et al., 1990; Sriram et al., 1997; Zhu et al., 1996]. АТФазный домен, который имеет структурное сходство с актином и гексокиназой, состоит из четырех маленьких областей, образующих две доли с глубокой впадиной, внутри которой связываются MgATO и М&АДФ. Структура пептид-связывающего домена состоит из сс-спиральных и р-структурных элементов. Показано, что Hsc70 способен специфично связывать короткие гидрофобные пептиды, а также взаимодействовать с отрицательно заряженными аминокислотными остатками [Blond-Elguindi et al., 1993; Flynn et al., 1991; Takenaka et al., 1995].
Хотя механизм взаимодействия между отдельными представителями шаперонов Hsp70 и полипептидом-мишенью изучен недостаточно, имеются некоторые общие черты функционирования этих белков: 1 - дифференцированное узнавание полипептида-мишени и изменение его конформации; 2 -связывание с полипептидом и гидролиз АТФ [Gething, Sambrook, 1992]. В эукариотических клетках в условиях теплового шока Hsp70 может кооперироваться с шапероном другого семейства - Hsp90, содержащимся в клетке в больших количествах. Функция этих шаперонов может дополняться действием АТФ-независимых низкомолекулярных белков теплового шока ( 25 кДа) [Fink, 1999]. Показано, что DnaK включается в модулирование белок-белковых взаимодействий. В Е. coli DnaK функционирует совместно с DnaJ и GrpE. Их участие показано в процессе репликации бактериофага [Zylicz et al., 1983; Liberek et al., 1993]. DnaK может также реактивировать РНК-полимеразу, инактивированную в результате теплового шока. Этот процесс зависит от гидролиза АТФ [Skowyra et al., 1990].
В ЭР эукариот найден Hsp78 (ВІР). При нормальных условиях в клетке ВІР синтезируется конститутивно в большом количестве (около 5% содержимого пузырьков ЭР). Возможно, для функционирования ВІР нуждается в кооперировании с DnaJ-подобным белком. В дополнение к DnaJ и GrpE, которые были идентифицированы несколько лет назад как кошапероны DnaK, недавно были обнаружены другие кофакторы, взаимодействующие с Hsp70. К их числу можно отнести Hip, BAG-1 и оксилин [Bole et al., 1986]. Существование множества кофакторов свидетельствует о сложности функционирования шаперонов семейства Hsp70 в клетке.
GrpE является ключевым компонентом системы Hsp70, обеспечивающей фолдинг бактериальных и митохондриальных белков. GrpE регулирует активность АТФазы DnaK и нуклеотидный обмен, однако, детали подобного механизма не вполне ясны. GrpE характеризуется высоким сродством к нативному мономеру DnaK, однако, к АТФ, АДФ, или к DnaK в олигомерном состоянии GrpE сродства не проявляет [Reid et al., 1996; Schonfeld et al., 1995].
Hip можно отнести к тетрамерным кошаперонам, участвующим в регуляции Hsc70 эукариот, механизм которой отличается от действия Нір в системе DnaK. Предполагается, что кошаперон способствует формированию стабильного комплекса Hsc70 с субстратным белком, причем, один олигомер НІр связывается с АТФазными доменами, по меньшей мере, двух молекул Hsc70. Данный процесс зависит от активации АТФазы Hsc70 под действием Hsp40, Интересно, что Hip может самостоятельно играть роль шаперона, связываясь с некоторыми развернутыми белками [Bruce et al., 1997; Hohfeld et al., 1995].
BAG-1 был недавно открыт, как регулятор активности Hsp70 [Stoldt et al., 1996; Zeiner et al., 1997]. BAG-1 взаимодействует с различными стероидными гормональными рецепторами, которые нуждаются в молекулярных шаперонах Hsp70 и Hsp90 для активации. Действие BAG-1 аналогично действию GrpE в бактериальных клетках в том, что он связывается с АТФазным доменом Hsp70. В сочетании с Hsp40 он стимулирует скорость гидролиза АТФ [Hohfeld et al., 1997].
Оксилин является кофактором Hsp70 с молекулярной массой 100 кДа, связывающимся с ним с высоким сродством в присутствии АТФ. Наличие J домена на С-конце указывает на то, что оксилин является членом семейства DnaJ: удаление J домена приводит к потере активности оксилина как кофактора [Ungewickell et al., 1995].
Механизм таутомеразной активности MIF
Отщепление или замена пролина на другой остаток, или перемещение его внутрь N-концевой последовательности путем добавления аминокислот лишало MIF ферментативной активности. Замена двух других основных остатков MIF, His-41 и His-бЗ, не влияла на ферментативную активность. Отщепление 5 или 11 остатков с С-конца лишало MIF способности формировать тример, а, следовательно, и каталитической активности. Мутации MIF, приводившие к потере ферментативной активности, однако, не устраняли его способность к противодействию эффектам глюкокортикоидов [Bendrat et al., 1997]. Однако не исключена роль ферментативной активности в проявлении других иммунологических реакций MIF.
В отличие от D-допахрома, фенилпируват и НРР являются физиологическими молекулами, образующимися при биосинтезе фенилаланина и тирозина соответственно. Однако предполагается, что они не могут быть субстратами MIF из-за кинетичских параметров для таутомеразнои реакции: концентрации этих молекул в 1000 раз ниже, чем значение Кт для MIF [Rosengren et al., 1997].
Идентификация физиологического субстрата MIF, возможно, приведет к открытию новой роли MIF, не связанной с регуляторной функцией в иммунной системе.Таутомеразные ингибиторы. Проводились некоторые исследования по обнаружению таутомеразных ингибиторов MIF (Рис. П). Букала и сотр. показали, что некоторые аналоги допахрома тормозят таутомеразную активность MIF [Orita et al., 2002]. Значение ІС5о для этих соединений находится, однако, в пределах 100-1000 мкМ. Рецептор MIF. Весьма немного исследований было посвящено взаимодействию MIF с возможными клеточными рецепторами. На поверхности макрофагов рецептор для MIF не был идентифицирован. Работы, в которых использовались неочищенные препараты MIF, показали, что углеводные остатки на поверхности моноцитарных клеток важны для торможения их миграции под действием MIF [Liu et al., 1989]. Последующие исследования продемонстрировали, что активация de novo миграции макрофагов осуществляется с участием MIF-независимых факторов, а не в результате ингибирования взаимодействия MIF с рецепторами, опосредованного углеводными остатками [Gordon et al., 1987].
Анти-моноцит моноклональные антитела блокируют торможение миграции моноцитов человека в присутствии MIF. Антитела распознавали антигены на двух белках с молекулярными массами 80 и 50 кДа. Функции и структуры этих белков предстоит определить, чтобы выяснить, имеют ли они отношение к рецепторам MIF. MIF-связывающие белки. Сарколектин - лектин, являющийся стимулятором роста и антагонистом IFN. Он специфично и с высоким сродством связывается с MIF (значение Kd и концентрация лектина составляли 2.1 и 113 нМ соответственно). Сарколектин также блокирует активность MIF, проявляемую при миграции макрофагов [Zeng et al., 1994]. Роль взаимодействия сарколектин-MIF не была определена, однако, связывание MIF с этим белком может приводить к модуляции широкого спектра активности MIF и к ограничению его действия в пораженной ткани. MIF-подобные белки. Фактор ингибирования гликозилирования (glycosylation inhibiting factor, GIF) - белок с молекулярной массой 12,5 кДа, аминокислотная последовательность которого идентична MIF. Единственное различие MIF от GIF состоит в том, что у последнего Ser (в положении 106) замещен на Asp. GIF ингибирует гликозилирование IgE-связывающих факторов, которые в негликозилированном состоянии способны тормозить синтез IgE. Хотя MIF и GIF идентичны по аминокислотной последовательности и вторичной структуре, они обладают совершенно различными биологическими активностями. В то время как действие MIF проявляется на макрофагах и Т-клетках, для активности GIF требуется посттрансляционная модификация. Биологическая активность рекомбинантного GIF может быть восстановлена в результате химической модификации остатка Cys60 [Nakano et al., 1997], что продемонстрировано лишь на супрессорных Т-клетках in vivo. В то время как рецептор MIF, возможно, присутствует на макрофагах, связывание GIF с высоким сродством показано на Т-хелперах и Т-киллерах, но не на макрофагах. Несмотря на структурное сходство между MIF и GIF, значительные различия в их активностях показывают, что даже незначительные структурные изменения могут приводить к глубоким физиологическим последствиям. Клеточные и тканевые источники MIF. Передняя доля гипофиза. Передняя доля гипофиза является богатым источником MIF. С помощью иммуногистохимического анализа и ELISA показано, что содержание MIF составляет приблизительно 0,05 % от общего содержания белка в гипофизе [Bernhagen et al., 1993]. Для сравнения отметим, что уровни "классических" гипофизарных гормонов АКТГ и пролактина составляют 0,2 % и 0,08 % соответственно [Thomer et al., 1992; Frantz, Wilson, 1992]. У мышей MIF был обнаружен в кортикотропных клетках передней доли гипофиза, а именно в секреторных гранулах. Было также показано, что клетки гипофиза в первичной культуре высвобождают значительное количество MIF в ответ на стимуляцию кортиколиберином [Nishino et al., 1995].
Влияние MIF на агрегацию модельных белковых субстратов
Добавление MIF в конечной концентрации 10 мкг/мл через 12 минут после начала агрегации MDH приводило к ее полному торможению (Рис. 22 Г, кривая 3). Полученные результаты показывают, что MIF может связываться с частично развернутой молекулой субстрата. Эта способность присуща многим шаперонам.
Для более детального выявления молекулярного механизма действия MIF после окончания процесса агрегации пробы центрифугировали при 10000g в течение 20 минут и исследовали состояние агрегатов в осадках и супернатантах.
Осадки, растворенные в 4 М мочевине (в случае Ph b), или в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0 (в случае MDH), подвергали электрофорезу в присутствии Ds-Na (Рис. 23 А).
Анализ электрофореграмм показал, что по мере увеличения концентрации MIF количество белка в осадках уменьшается, что согласуется с кривыми агрегации. Это свидетельствует о том, что MIF обладает шапероноподобными свойствами. В случае Ph b на конечной стадии агрегации наблюдается образование гетероагрегатов: Ph b и комплекса Ph b с MIF (Рис. 23 А). Последнее наблюдалось и для MDH в случае больших концентраций MDH и MIF (данные не показаны).
При нативном электрофорезе солюбилизированного осадка MDH, полученного на конечной стадии тепловой агрегации, в отсутствие MIF (Рис. 23 Б, дорожка 1) обнаружена одна полоса с кажущейся молекулярной массой 70 к Да. Это свидетельствует о том, что MDH во время агрегации не распадается на мономеры, а агрегирует в виде димера. С помощью электрофореза в неденатурирую щих условиях осадка MDH, полученного после агрегации в присутствии MIF и растворенного в 20 мМ Tris-HCl, рН 7,0, показано, что MDH остается также в виде димера. Интенсивность пятен на электрофореграммах, соответствующих кривой агрегации 2 (Рис. 22 А) остается такой же, как в случае контроля (кривая 1). Растворимость осадка в присутствии MIF улучшается, что также подтверждает его шапероноподобную активность.
Также проводилось измерение содержания субстратного белка в пробах до начала и после окончания агрегации. Было показано, что при данных условиях MDH агрегирует на -80- 90%, a Ph Ь только лишь на 30%.
Для подтверждения того, что в присутствии MIF растворимость денатурированного белка увеличивается, был проведен следующий эксперимент. К осадкам MDH, полученным на конечной стадии тепловой агрегации, были добавлены растворы MIF в разных концентрациях. Электрофорез полученных проб в неденатурирующих условиях показал, что по мере увеличения концентрации MIF растворимость осадка MDH увеличивается (Рис. 24). Наибольшая растворимость осадка MDH (26 мкг/мл) была показана при концентрации MIF 30 мкг/мл.
Полученные результаты могут быть обусловлены способностью MIF к образованию амфипатической вторичной структуры, при которой экспонированные наружу гидрофильные сайты MIF обеспечивают лучшую растворимость образовавшихся агрегатов. Для определения олигомерного состояния денатурированного белкового субстрата и его предполагаемого комплекса с MIF была проведена эксклюзионная хроматография MDH в отсутствие и в присутствии MIF с использованием системы FPLC на колонке Superdex 10/300 GL (Рис. 25). Образцы нагревали в течение 30 минут при 40,5С (Рис. 22 А, кривые 1 и 4), затем центрифугировали при 10000g в течение 20 минут и наносили на колонку. При анализе образца, не содержащего MIF, на хроматограмме наблюдалось значительное уменьшение количества белка (Рис. 25 А, пунктирная линия). При хроматографии MIF-содержащего образца наблюдалось смещение пика влево по отношению к пику MDH (Рис. 25 А), соответствующему 70 кДа (Рис. 24 Б.) Эти данные в сочетании с результатами электрофореза показывают, что MIF образует комплекс с MDH, причем 2 мономера MIF связываются с димером MDH.
Усиление агрегации белков в присутствии MIF
В данном эксперименте, характеризующемся более мягкими денатурирующими условиями, агрегаты в осадках оказались легко растворимыми в Tris-HCl буфере, не содержащем мочевины.
Анализ нативного электрофореза в ПААГ проб ADH, инкубированных при 41,5С в отсутствие или в присутствии MIF в течение 20 минут (Рис. 36), показал, что супернатант содержит димер и тетрамер ADH (кажущиеся молекулярные массы 80 и 160 кДа соответственно), причем в присутствии MIF (дорожка 3) содержание этих олигомеров меньше, чем в его отсутствие (дорожка 1).
В растворенном осадке в отсутствие MIF наблюдаются слабо выраженное пятно, соответствующее тетрамеру ADH, и высокомолекулярные олигомеры, едва проникающие в гель (дорожка 2). В присутствии MIF (дорожка 4) в осадке обнаруживаются довольно яркие полосы, которые могут соответствовать димеру и тетрамеру ADH, а также высокомолекулярные олигомеры и полоса MIF (кажущаяся молекулярная масса 12 кДа), что свидетельствует об образовании гетероолигомеров, содержащих как В этом случае высокомолекулярные олигомеры располагаются в области более низких молекулярных масс (дорожка 4) по сравнению с пробой, не содержащей MIF (дорожка 2).
На основании анализа результатов последнего эксперимента можно сделать важный вывод о том, что при тепловом стрессе в диапазоне температур, близких к физиологическим, несмотря на ускорение агрегации субстратных белков в присутствии MIF, образующиеся агрегаты оказываются легко растворимыми. Это может означать, что после снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка к нативному состоянию. В этом смысле в начале развития процесса агрегации MIF обратимо связывается с частично денатурированным белком, стабилизируя его структуру и, возможно, концентрирует субстрат в агрегированном состоянии. Однако, в конечном итоге, в случае снятия теплового стресса и возврата системы к нормальному состоянию, MIF может играть шапероноподобную роль. ,
Была исследована активность ADH в супернатантах и осадках, солюбилизированных в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 6,8, а также определено содержание белка в этих фракциях. Падение активности ADH в супернатантах после агрегации коррелировало со снижением в них содержания белка ( на 30%). Анализ кинетических кривых показал высокую степень кооперативности процесса агрегации лабильных белковых субстратов в присутствии MIF. Особенно ярко это проявляется при агрегации ADH при температуре, близкой к физиологическому уровню (Рис. 35). Сигмоидная кривая агрегации в сравнительно коротком промежутке времени (около 15 минут) демонстрирует возрастание величины Ацт в -10 раз под действием MIF в субстехиометрическом диапазоне концентраций. Некоторые известные шапероны, в частности PDI и TF (PPI), являющиеся катализаторами фолдинга, при определенных условиях ускоряют агрегацию субстратных белков. Анализ кинетических параметров агрегации позволяет сделать вывод о том, что при различных экспериментальных условиях, например, при повышении температуры до от 42С до 48С (при использовании Ph Ъ в качестве белкового субстрата) происходит смена кинетического режима агрегации (Курганов, 2002), сопровождающаяся изменением характера действия MIF на процесс агрегации. При относительно низких температурах скоростьлимитирующей стадией процесса агрегации может быть стадия разворачивания белковой молекулы, а при более высоких температурах -стадия роста агрегата. Для решения вопроса о том, как MIF может функционировать в многокомпонентной шаперонной сети совместно с другими шаперонами требуются дальнейшие исследования. выводы 1. Разработан новый оригинальный метод выделения фактора ингибирования миграции макрофагов из мозга быка, основанный, главным образом, на эксклюзионной хроматографии на полимере TSK Toyopearl HW-55. 2. Показано, что фактор ингибирования миграции макрофагов представляет собой смесь гомоолигомерных форм с кажущимися молекулярными массами 12,48, 60, 120, 168 и 480 кДа. 3. Обнаружено, что фактор ингибирования миграции макрофагов обладает шапероноподобными свойствами, проявляющимися в способности тормозить тепловую агрегацию модельных белковых субстратов (гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика и малатдегидрогеназы из сердца свиньи) в диапазоне температур 40-42С и различных концентрациях белков. 4. Продемонстрировано защитное действие фактора ингибирования миграции макрофагов в процессе термоинактивации частично денатурированных малатдегидрогеназы и гликогенфосфорилазы Ь, проявляющееся как в торможении падения ферментативной активности при тепловом воздействии, так и в ускорении реактивации ферментов после снятия теплового стресса. 5. Показано образование гетероагрегатов, содержащих белковый субстрат и фактор ингибирования миграции макрофагов. Фактор ингибирования миграции макрофагов проявляет шаперонную активность в форме мономера.
