Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
І. 0Б80Р ЛИТЕРАТУРЫ
Внутриклеточный транспорт тиреоидных гормонов .... 8
Биологическое значение специфических йодтиронинсвязы-вающих белков в транспорте и метаболизме тиреоидных гормонов 10
Связывание тиреоидных гормонов с клеточными белками.. 17
Физиологическое значение отдельных путей метаболизма тиреоидных гормонов 20
П. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
Ш. ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ОРГА
НАХ-МИШЕНЯХ И НЕМЙШЕНЯХ . . . . 43
IV. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ И СВЯЗЫВА
НИЕ ИХ С СУБКЛЕТОЧНЫМИ СТРУКТУРАМИ ТКАНИ ПЕЧЕНИ И ПОЧ
КИ 47
ІУ.І. Связывание тиреоидных гормонов с белками клетки ткани
печени 48
ІУ.2. Распределение тироксина и трийодтиронина в субклеточных
структурах ,% 53
ІУ.З. Роль субклеточных структур в процессе превращения
тироксина в трийодтиронин .... .56
ІУ.4. Связывание тиреоидных гормонов с рецепторами ядра
клетки печени у гипо- и гипертиреоидных крыс 60
V. ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ И ДЕЙОДИРОВАНЙЯ
ТИРОКСИНА В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ ВОЛЬНЫХ ТОКСИЧЕСКИМ
ЗОБОМ бб
Л. ВЛИЯНИЕ ГОРМОНОВ НА ПРОЦЕСС ПРЕВРАЩЕНИЯ ТЙГОКСЙНА В
ТРЙЙОДТЙРОНЙН ПРИ ТИРЕОЙДНОЙ ПАТОЛОГИИ 72
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
ВЫВОДЫ 89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .91.
- ц. -
Введение к работе
Молекулярные механизмы регуляции клеточного эффекта гормонов - актуальная проблема современной эндокринологии. Она включает взаимодействие гормонов с локализующимися в различных субклеточных структурах специфическими белками органов-мишеней, выполняющими транспортную, ферментативную и рецепторную функции. При этом важную роль играет плазматическая мембрана клеток-мишеней. Здесь почти все гормоны взаимодействуют со специфическими рецепторами, которые и обеспечивают реализацию гормонального сигнала. Реакция клеток-мишеней на действие гормонов осуществляется активацией аденилатциклазы и накоплением в клетках-мишенях ЦИКЛИЧвСКОГО аденоЗИНМОНОфОСфата (E.W.Sutherland et al.,1968; J. Robins et al., 1967 ; Я.Х.Туракулов и др., 1978).
Однако единая теория, объясняющая широкий диапазон дейст -вия тиреоидных гормонов отсутствует, так как еще не удалось найти первичный эффект или же основную субклеточную структуру, через которую йодтиронины реализуют все свои эффекты.
Представления о механизме действия тиреоидных гормонов и регуляции их активности дополнены новыми фактами (g.s. Levey .,
et al., 1973; R.N.Smith et al ., 1978; Я.Х.Туракулов и др., 1980). Показано участие 3'5'-цАМФ в клетках-мишенях. Тироксинчув-ствительные органы или клетки-мишени характеризуются реакциями повышения поглощения кислорода, изменения трансформации энергии в митохондриях, активного синтеза белков и нуклеиновых кислот, возникающими в ответ на действие йодтиронинов. В тканях, не являющихся мишенями, такие реакции не развиваются. Это может обусловливаться не только наличием или отсутствием в клетке специфичес-
ких рецепторних белков в различных субклеточных структурах ( j.h. Oppenheimer et al. , 197^,1975; L.DeGroot et al. ,1977; J.D. Baxter1979; K.Sterling et al . , 1976,1978), HO И неоднозначностью процессов клеточного метаболизма гормонов (М.Мирахмедов, 1979). Такое общее представление типично для тиреоидных гормонов, относительно которых роль отдельных субклеточных структур органов-мишеней в приеме первичного гормонального сигнала, до сих пор активно дискутируется.
Исследования последних лет свидетельствуют о том, что ядра и митохондрии клеток-мишеней - не единственные точки приложения для тиреоидных гормонов. В опытах in vivo a in vitroобнаружено повышение содержания цАМФ в клетках-мишенях при гиперти-реозе или при добавлении тиреоидных гормонов к изолированным срезам органов-мишеней (С.Далимова, 1982). Показано также, что на изолированных тимацитах ( I.Goidfine et al ., ,1975) и на культивируемых клетках сердца куриного эмбриона ( Segal et al . ,1975) тиреоидные гормоны увеличивают транспорт и поглощение клетками лейцина и аминоизобутиловой кислоты. Этот эффект развивается через несколько минут после добавления гормона. Расшифровка конкретных механизмов действия тироксина осложняется неясностью вопроса о путях внутриклеточного транспорта, взаимосвязи метаболизма и рецепции, а также роли отдельных клеточных структур в этом процессе. Более того, до сих пор не известно, каким образом гормоны щитовидной железы избирательно захватываются клетками-мишенями из крови, аккумулируются в них и транспортируются из цитоплазмы в ядро. Не ясен также механизм гетерогенности реакции клеток отдельных органов на действие тиреоидных гормонов и значение особенностей метаболизма гормонов в этом процессе. Поэтому представляется актуальным изучение транспорта,
- б -
связывания и метаболизма тироксина в субклеточных структурах органов-мишеней."
Основная наша цель заключалась в определении роли субклеточных структур органов-мишеней в распределении, связывании и метаболизме тиреоидных гормонов. Все эти вопросы очень важны при выяснении патогенеза заболеваний, связанных с гипер- и гипофункцией щитовидной железы. Главное внимание мы уделяли нарушению скорости конверсии тироксина в трийодтиронин, локализации этого процесса внутри клеток печени и почки у экспериментальных животных и лейкоцитах крови у больных гипо- и гипертиреозом. Полученные результаты позволяют утверждать, что нарушения транспорта, связывания и дейодирования тироксина занимают одно из основных мест в генезе гипер- и гипотиреоза у людей.
Зля достижения намеченной цели были определены следующие задачи:
изучить особенности распределения, связывания и дейодирования тироксина в тканях, чувствительных и нечувствительных к гормону;
изучить связывание тиреоидных гормонов с плазматической мембраной клеток ткани печени;
изучить субклеточную локализацию процесса конверсии Т^ в Т^ в клетках ткани печени и почки;
изучить связывание тиреоидных гормонов с белками клетки ткани печени;
определить влияние цитоплазматических йодтиронинтранспор-тирующих белков на связывание их в клеточном ядре;
изучить связывание и конверсию Т^ в лейкоцитах крови больных с тиреоидной патологией;
- 7 -7. изучить влияние гормонов на активность Т^-5'-дейоди-назы путем измерения уровня трийодтиронина в сыворотке крови у экспериментальных животных.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I.I. Внутриклеточный транспорт тиреоидных
гормонов
Применение меченых тиреоидных гормонов с высокой удельной активностью и радиоиммунного анализа дали возможность определить содержание, распределение и внутриклеточный транспорт гормонов щитовидной железы в периферических тканях, а также установить основной путь их обмена в субклеточных структурах.
Непременное условие физиологического действия тироксина -проникновение его внутрь клетки и взаимодействие с суоклеточными структурами. Механизм этого процесса привлекал и привлекает специалистов, изучающих метаболизм и механизм действия тиреоидных гормонов.
Многочисленные исследования по распределению и обмену тиреоидных гормонов в организме животных осуществили главным образом французские ученые группы Роша и Мишеля ( J.Roche et ai. , 1952-1962). Они, используя меченые тиреоидные гормоны, определяли наличие тироксина и трийодтиронина в крови, лимфе крыс и изучали их обмен в органах этих животных. J.Roche и его сотрудники (1955) показали, что при введении крысам меченных по йоду-131 тироксина и трийодтиронина они быстро исчезают из крови. Значительное количество гормонов авторы обнаружили в ткани печени, в желчи, почке и сердечной мышце.
A.Sturm, w.Wernitz (1956), вводя крысам и морским свинкам радиоактивный йод под кожу, проводили радиоавтографическое изучение распределения йода в передней и задней долях гипофиза, в гипоталамусе, коре мозга и мозжечке. Через 2 ч в мозге была обнаружена меньшая степень связывания йода, чем в печени. Во второй
серии исследований через 24 и 48 ч после инъекции отмечалось
значительное накопление йода в передней, задней долях гипофиза и гипоталамусе. В меньшем количестве он накапливался в клетках мозга.
A.Sturm, w.Wernitz не определяли фракций йода, однако они показали, что через 24 и 48 ч он представляет собой гормональный йод.
Позже распределение йодтиронияов было изучено более детально.
H.G.Irvine (1974) исследовал концентрацию тироксина в различных органах у овец. Он установил, что концентрация йодтиронияов в клетках печени и почки почти в 12 раз больше, чем в других органах. После однократной инъекции меченого гормона равновесие йодтиронина между сывороткой крови и тканями на уровне клеток печени и почки достигалось через 1-2 ч, в стенках кишечника - через 4 ч, в мышцах, коже и мозге - через 36 ч.
Аналогичные данные получили M.J.Obregon et ai. (1979). Авторы использовали методики изотопного равновесия и радиоиммунологического анализа гормонов. Самую высокую концентрацию тиреоидных гормонов (в 7-Ю раз выше, чем в сыворотке) они обнаружили в печени и почке, в меньшем количестве тиреоидные гормоны накапливались в легких и мозге.
Молекулярный механизм накопления тиреоидных гормонов и продуктов их обмена в высоких концентрациях в различных органах, а также его биологическое значение все еще неясны.
Для получения глубокого и всестороннего представления о механизме действия тиреоидных гормонов необходимо остановиться на значении специфических йодтиронинсвязывающих белков сыворотки крови в их транспорте и метаболизме.
- 10-1.2. Биологическое значение специфических йодтиронинсвязы-вающих белков в транспорте и метаболизме тиреоидных гормонов
Тиреоидные гормоны транспортируются к клеткам-мишеням плазменными белками: тироксинсвязывающим глобулином (ТСГ), ти-роксинсвязывающим преальбумином (ТСПА), а также неспецифической
альбуминовой фракцией - ТСА ( A.S.Gordon et al. , 1952; S.H. Ing-bar ,1958 ; P.J. Davis et al ., 1966).
ТСГ - гликопротеид с молекулярной массой 64000. ТСПА также представляет собой гликопротеид (углеводный компонент занимает всего 1%) с молекулярной массой 54000 ( j.s. Marshall et al ., 1971). Эти белки синтезируются в печени. Обнаруживаются они в сыворотке радиоиммунологическим и электрофоретичесним методами.
Сравнительные исследования, проведенные с плазмой различных видов позвоночных, позволили прийти к выводу, что ТСГ имеется лишь у высших млекопитающих. У низших млекопитающих, птиц, рептилий и рыб основными транспортными белками для гормонов щитовидной железы являются альбумины и преальбумины ( y. тапаЪе et al., 1969).
В плазме здоровых людей ТСГ содержится 1-2,7 мг%; с ним связывается 60-70% Т^. ТСПА определяется в количестве 30 мг%; он связывает 15-30% тироксина плазмы. Оставшаяся часть тироксина связывается с ТСА.
Уровень "свободного" Т^., т.е. не связанного с белками, незначителен - 1-2,5 нг%, что составляет 0,03% тироксина сыворотки. При гипертиреозе в плазме в первую очередь повышается содержание именно этой формы тироксина.
При физиологических значениях рН связывающая способность
-II -
ТСГ плазмы равна 20 мкг/100 мл, а связывающая способность ТСПА значительно ниже.
В крови Т^ циркулирует также в белковосвязанном состоянии, хотя связь его с ТСГ и ТСПА очень непрочная. Лишь 0,3$ общего
Т5 СЫВОРОТКИ Циркулирует В "СВОбОДНОМ" СОСТОЯНИИ ( I.J. Chopra,
1980).
Физиологические функции гормоневязывающих белков многогранны: а) они отвечают за возникновение интра- и экстрацеллюляр-ного гормонального пространства, задерживают в плазме гормоны, предохраняют их от преждевременного распада, препятствуют выделению с мочой (Я.Х.Туракулов, 1962; Е.А.Колли, 1968); б) связанные с белками гормоны являются резервом для биологически активных свободных Т^ и Т^.
При снижении концентрации ТСГ связывающая способность сыворотки уменьшается. При этом возникает новое состояние равновесия: функции ТСГ. до некоторой степени принимают на себя ТСПА и ТСА. В результате уровень "свободного" Т^ остается в норме, благодаря чему организм находится в эутиреоидном состоянии.
Гормонсвязывающая способность белков сыворотки меняется при некоторых физиологических состояниях (беременность), заболеваниях (нефроз и др.), а также при введении в организм некоторых фармакологических средств (дифенилгидантион и др.) .
Тироксин и трийодтиронин могут связываться как с плазменными, так и с тканевыми белками. Перенос гормонов из крови в ткани определяется главным образом конкуренцией между двумя типами белков. Факторы, снижающие сродство между тироксином и транспортными белками плазмы, повышают содержание свободного гормона в крови, а вместе с ним степень его фиксации в тканях( а.р. Hillier, 1972).
Каждая специфическая тироксинтранспортирующая белковая фракция (ТСГ или ТСПА) в сыворотке крови выполняет свои функции
( А.Р.Hillier, 1971). Согласно ДаННЫМ Литературы ( I.B.Gerstner
et аі.976; А.П.Калликорм, 1977; М.Мирахмедов и др., 1978), прямая корреляция, проявляющаяся между снижением скорости проникновения тироксина к клеткам-мишеням и уменьшением количества тироксинсвязывающего преальбумина, свидетельствует о том, что ТСПА играет в механизме транспорта и проникновения тироксина в клетку более важную роль, чем тироксиневязывающий глобулин. Можно полагать, что тироксинсвязывающий преальбумин является одним из белков, ответственных за транспорт тироксина к периферическим органам-мишеням, причем его значение в механизме действия тирео-идных гормонов, по-видимому, не исчерпывается только этой функцией ( А.P. Hillier , 1971).
K.A.Woeber (1963) показал, что после обработки антисывороткой, препятствующей связыванию гормона с тироксинсвязывающий преальбумином, содержание свободного тироксина в сыворотке крови повышается втрое. Авторы полагают, что при нормальных соотношениях белковых фракций сыворотки крови тироксинсвязывающий преальбумин занимает центральное место в транспорте тироксина и регуляции биологической активности тиреоидных гормонов ( А.Р Hillier , 1970, 1975).
j.H.Oppenheimer,M.L.Surks (1964) косвенными методами измеряли концентрацию связанных и свободных мест (3,36x10иГ*) для тироксинсвязывающего преальбумина.
В 1968 г. K.A.Woeber и s.H.ingbar на основании распределения тироксина между связывающими белками сыворотки приве-
я т ли схожие величины (2,3x10 М х) для тироксина, связанного с пре-
альбумином.
- ІЗ -
к. sterling и его сотрудники (1971) оценили константу ас-социации для Т^, связанного с дреальбумияом (5x10 М ).
A.M.Green et ai. (1972), применяя метод пробы флюоресцентным красителем, также получили более высокую константу сродст-
тл т
ва (2x10 Ж ) для тироксиясвязывающих белков.
S.F.Nilsson, P.A.Peterson (1975), используя метод скоростного диализа, установили, что Т4 при рН 7,4 более специфичен к
9 Т
преальбумину при Kacc=6xI0 М , а тироксинсвязывающий глобулин -при Касс=4хЮ9М"1.
В процессе дальнейших исследований в этом направлении методом равновесного диализа установлено возможное существование структурных различий в сайтах со связыванием двух транспортных белков ( S.M.Snyder et al., 1976; M.Tabachnick et al., 1978).
Трийодтиронин также связан белками крови, хотя его связь несколько слабее.Поведение этого гормона в крови сильно отличается от поведения тироксина. Соединения ъ -Тд с белками крови сосредоточены на глобулиновых гликопротеидах и значительно слабее соединений Т4 на тех же фракциях in vivo . Это явление большой физиологической важности. Оно объясняет ничтожное содержание Тд в крови,,несмотря на беспрерывное выделение его из щитовидной железы.
Б противоположность т., трийодтиронин, добавленный к сыворотке, ПОЧТИ не связывается С преальбуминОМ ( I.Robins,I.E.Rail , 1967).
Тироксин, трийодтиронин и их аналоги имеют неодинаковое сродство к тироксинсвязывающим глобулину и преальбумину ( J.R.Tata et al. , 1961).
Более поздние работы показали, что Тд также связывается с преальбумином, но только значительно слабее, и транспортируется
- 14 -в крови; в присутствии тироксина трииодтиронин вытесняется из комплекса ( S.F.Nilsson, P.H.Peterson, 1971; P.J.Davis et al., 1972; P.R.Larsen, 1972).
A.P.Hillier (1972), исследовавший поглощение тироксина печенью крысы, перфузируемой сильно разбавленным раствором тирок-синсвязывающих глобулина и преальбумина, обнаружил, что большая часть гормона адсорбируется поверхностями мембраны клетки. Переход Т^ из белков сыворотки на гормонсвязывающие участки клетки-мишени осуществляется после выделения его в свободное состояние.
Позже было установлено, что в клетку проникают и Т4, и Тд, но только в свободной форме. Так, результаты изучения скорости перехода Т4-1251 из плазмы в печень и обратно дали основание думать, что проникновению Т4 в клетку предшествует диссоциация гормона с сывороточными белками ( A.P.Hillier , 1975).
Данные анализа кинетики проникновения Tg в клетки печени свидетельствуют о том, что оно может идти двумя путями, причем второй путь характеризуется малой емкостью и высокой специфичностью ( G.S.Rao et ai. , 1976). Было показано, что Т4 усиливает поглощение Tg клетками печени, воздействуя на второй механизм с высоким сродством к гормону. Это подтверждает наличие разных транспортных систем для тироксина и трийодтиронина при проникновении их в клетку.
В 1977 г. е Институте биохимии АН УзССР А.Абдукаримов с сотрудниками выделили из клеток печени крыс преальбуминоподобную белковую фракцию в гомогенном состоянии, имеющую высокое сродство к Т4. Установлено, что Т4 в комплексе с цитоплазматическим белком-рецептором стимулирует РНК-полимеразную активность ядер клеток печени крыс (А.Абдукаримов, 1978).
В лаборатории биохимии гормонов Института биохимии АН УзССР
- 15 -было изучено действие тироксина на активность аденилатциклазы в грубой фракции плазматических мембран печени, почки, сердечной мышцы, мозга и седезенки нормальных, гипо- и гипертиреоидных крыс in vitro . Показано, что тиреоидный гормон стимулирует активность аденилатциклазы печени, сердца и почки. В препаратах же мозга и селезенки такой эффект не наблюдается ( Я.Х.Туракулов и др., 1980).
Действие Тд на ядро имеет решающее значение (s.jothy et ai., 1975; L.De Groot et ai., 1980 ). Опыты показывают, что реакция органа-мишени в значительной степени зависит от способности связывать тиреоидный гормон. В тканях, обладающих сродством к гордону, связывающих рецепторов больше, чем в тканях, не реагирующих на То» Следовательно, число специфически связывающих мест (рецепторы) определяет чувствительность ткани к Тз и Т^.
В осуществлении гормонального эффекта играет роль также специфичность взаимодействия. Примером может служить трийодтироуксус-ная кислота, хотя и обладает определенной активностью, но оказывает значительно более слабый метаболический эффект, чем трийод-тиронин.
Непосредственное влияние Тз и Т4 на клеточное ядро доказывается повышением активности РНК-полимеразы под влиянием этих гормонов ( ь. De Groot et ai., 1980 ), что является самым ранним признаком тиреоидной активности. При этом стимулируется синтез белка ( S.Jothy et al., 1975).
Многие исследователи утверждают, что гормоны щитовидной железы оказывают действие и на другие клеточные структуры. Они способны стимулировать потребление кислорода в сердце, почке, печени и скелетной мускулатуре, существенно не влияя на потребление кислорода в мозге, яичнике и лимфатических тканях ( S.в.Barker
1966 } J.Qharbi, J.Torresani, 1981).
При изучении действия тирвоидных гормонов на митохондрии было показано, что в концентрации ГО і! они вызывают набухание и увеличение проницаемости этих органелл, причем только в тех органах, которые обладают четкой реакцией на введение гормонов (Я.Х.Туракулов, 1977).
Гормоны щитовидной железы повышают активность ферментов тканевого дыхания - с^- глицерофосфат-дегидрогеназы, цитохром-ОКСИДазы И др. ( H.Uakamura et al., 1979).
Сверхфизиологические дозы гормонов вызывают разобщение окислительного фосфорилирования (А.И.Гагельганс и др., 1972 ). При этом АТФ не накапливается, увеличивается потребление кислорода , ускоряется транспорт электронов и большая часть энергии расходуется в виде тепла. Данная теория способна объяснить многие симптомы гиперфункции щитовидной железы ( увеличение потребления кислорода, повышение процессов метаболизма и др. ). Однако ее принимают далеко не все специалисты. Некоторые авторы считают, что описанный эффект вызывается гормонами путем активирования И"а+К+-зависимой АТФ-азы. В то же время показано, что гормоны щитовидной железы стимулируют синтез белка в митохондриях ( I.S.Edelman , 1975).
Все перечисленные процессы происходят в митохондриях» Неясно лишь, влияют ли тиреоидные гормоны на них непосредственно или эти изменения вторичны. Новейшие исследования говорят в пользу ВТОРОГО ПрвДПОЛОЖеНИЯ (K.Sterling , 1979).
Как видно из данных литературы, имеется два пути действия тиреоидных гормонов на клеточном уровне:
а) действие на клеточное ядро - усиление образования РНК и синтеза белков;
б) активация энергетических процессов в митохондриях, к.sterling (1977,1979) отмечает большую роль тиреоидных гормонов в модификации процессов трансмембранного переноса, в частности прямое влияние их на Яа+К+-зависимую АТФ-азу. В результате активации %+К+-зависимой АТФ-азы в клетках повышается концентрация калия, снижается на/К коэффициент, разобщается окислительное фосфорелирование и т.д. В остальных случаях тиреоидные гормоны тормозят активность цинксодержащих дегидрогеназ и других ферментов.
По мнению Б.Й.Гольдштейна (1957), Р.Й.Хильчевской (1965), З.Й.Фабри (1968), A- Burger et al. (1977), I.J.Chopra (1980 4, активность ферментативных систем под действием Т^ изменяется вследствие увеличения количества и усиления реактивной способности SH-rpynn.
Следовательно, столь широкий спектр действия трийодтирони-на и тироксина на биохимические процессы в организме может быть обусловлен влиянием их на многочисленные системы клетки.
1.3. Связывание тиреоидных гормонов с клеточными
белками
Взаимоотношение гормонов щитовидной железы со специфическими белковыми фракциями сыворотки крови занимает основное место в регуляции распределения и метаболизма их в организме. Связывание тиреоидных гормонов со специфическими белками крови обуславливает поддержание определенного соотношения свободной и связанной форм тироксина и трийодтиронина в крови.
Более 99^ тиреоидных гормонов, циркулирующих в крови, образуют обратимо диссоциирующие комплексы с транспортирующими белками сыворотки - ТСБ ( R.R.Cavalieri et al.,1975; G.Lotti et al., 1977).
Можно считать, что в отсутствие связывающих белков сыворотки внетиреоидный пул свободного гормона должен был бы исчезнуть за несколько часов после секреции Т^ из щитовидной железы. Более того, Т^ имеет большее сродство к гормонсвязывающим белкам сыворотки крови, чем T^i а трийодтиронин - гораздо большее сродство к внутриклеточным белкам.
L.K.Christensen (I960), добавляя к сыворотке крови че-ловека меченные по ^ 1-тироксин и трийодтиронин, установил, что трийодтиронин имеет слабое сродство к белкам сыворотки и связывается с ними в 13-18 раз слабее, чем тироксин.
По мнению S.H.Ingbar et al . (I960), J.H.Oppenheimer et al. (1963), A.P.Hilier (1975), основная функция йодтиронинсвязы-вающих белков сыворотки заключается в регуляции активности гормонов, так как связанные с этими белками Т^ и Т^ физиологически неактивны. Прочность связи Т^ и Т^ и их аналогов с белковыми фракциями крови являлась предметом многочисленных исследований ( L.K.Christensen, 1960; P.I. Davis et al., 1970, 1972; A.P. miller, 1975 ).
J.R.Tata (1958) в составе солевого экстракта мышц кролика обнаружил специфическую глобулярную фракцию, способную в физиологических дозах связывать как тироксин, так и трийодтиронин. Автор установил, что специфические тироксинсвязывающие белки обладают меньшим сродством к тироксину, чем сывороточные тироксинсвязывающие. Кроме того, специфические тироксинсвязывающие белки ткани обеспечивают транспорт тиреоидных гормонов внутри клетки и регулируют их деградацию.
Правильность полученных им данных можно подтвердить тем, >что добавление тироксинсвязывающих белков в инкубационную среду
- 19 -ослабляет дейодирование и деградацию тироксина в клетке ( s.Li-ssitzky , I960). Авторы изучали скорость дейодирования тироксина в срезах и фракциях клетки печени и других органеллах. При этом установлено, что деградация происходит в тех случаях, когда количество добавленного тироксина превышает концентрацию его для той или иной ткани.
L.K.Christensen (I960), добавляя к сыворотке крови че-
ловека меченные по АОА1 тироксин и трийодтиронин, установил,что трийодтиронин имеет слабое сродство к белкам сыворотки и связывается с ними в 13-18 раз слабее, чем тироксин.
S.Hamada et ai.(I976), применявшие колоночную хроматографию, обнаружили клеточные тироксинсвязывающие белки в ткани печени. В последующем было показано, что как по молекулярной массе, так и по некоторым физико-химическим свойствам специфические йодтиронинсвязывакщие белки клеток печени отличаются от аналогических сывороточных белков.
Действительно, на уровне плазматической мембраны клетки и в других субклеточных структурах органов-мишеней обнаружены белки (рецепторы), резко отличающиеся от гормонтранспортирующих белков сыворотки крови (М.Мирахмедов, 1976,1977; S.P.Singh et al., 1976; J.Gharbi, J.Torresani , 1979).
I.4.Физиологическое значение отдельных путей метаболизма тиреоидных гормонов
Взаимосвязь метаболизма тиреоидных гормонов и механизма их действия - одна из кардинальных проблем оиологического действия тироксина. Если говорить об обмене тиреоидных гормонов, то его направление может быть различным и включать коньюгирование, де-замияирование, декарооксилирование, разрыв дефинильэфирного мостика и самый важный путь обмена - дейодирование с превращением тироксина в трийодтиронин и реверсивный трийодтиронин.
Дезаминирование. С точки зрения количественных отношений окислительное дезаминирование гормонов щитовидной железы - менее еэжный метаоолический путь, чем дейодирование и превращения,связанные с изменениями в фенольной группе.
M.Nacano, T.S.Danowski (I960) инкуоировали 3,5-дийод- L -тиронин с неочищенной оксидазой аминокислоты яда кобры в присутствии больших количеств каталазы. При этом образовывалась 3,5-дийодо- тиропировиноградная кислота. Возможно, что уксуснокислые
производные тироксина и трийодтиронина являются активными гормонами на клеточном уровне. В экстрактах железы, почки и мышц млекопитающих после инъекции меченого трийодтиронина найдена три-йодтироуксусная кислота (R.Michel et ai. , 1957).
Тетрайодтироуксусная кислота обнаружена также в плазме ге-патоэктомированных сооак после инъекции тироксина ( s.v.Fiock et ai. , I960).
Хотя осноеной путь деградации аланинового остатка 3,5,3' -трийодтиронина ведет через тиропировиноградную кислоту, окислительное декарбоксилирование к образованию 3,5,3' - трийодтироук-сусной кислоты, незначительное количество ее посредством восста-
СІ сн сі сн
но-с & у с - о - с^ у с-сн2-соон
СІ СН СІ сн
но-с
3,5,3'5« - ТЕГРАЙОДГИРОУКСУСНАЯ КИСЛОТА
СІ СН СІ сн
& ^с - о - с^ ^ с-сн2-соон
СН СН CI сн
3,5,3» - ТРИЙОДГИРОУКСУСНАЯ КИСЛОТА
01 СВ cj сіі
но-с & у с - о - о^ у с-сн2-со-соон
СН СН СІ сн
3,5,3'- ТРИЙОДГИРОПИРОВИНОГРАДНАЯ КИСЛОТА
СІ СН СІ СН
НО-С с-сн2-со-соон
СІ СН СІ сн
3,5,3»5»- ТЕГРАЙОДГИРОПИРОВИНОГРАДНАЯ КИСЛОТА
- 22 -новления переходит в 3,5,3'-трийодтиромолочную кислоту. Об этом сообщили R. Michel et ai. (1962), обнаружившие в желчи и почке тиреоидэктомированных крыс после инъекции 3,5,3'-трийодтиронина, меченного по йоду-131, ничтожные количества тиролактата.
Декарбоксидирование. Превращение тетра- и трийодтиропирови-нограднокислых дериватов в уксуснокислые производные предполагает и реакцию окислительного декарбоксилирования.
R.A.Kot a. H.M.Klitgaard (1959), издавшие метаболизм С L -тироксина у нормальных, тиреоидэктомированных и гипертиреоид-ных крыс, в течение 12 ч после инъекции определяли в выдыхаемом воздухе около 12$ активности СС^* ^ мнению авторов, это свидетельствует декарбоксилировании тироксина. Однако трудно сказать, на каком этапе деградации молекулы тироксина происходит отщепление СОр. По крайней мере, это не результат прямого декарбоксилирования Т^, так как продукт декарбоксилирования тироксина -тироксамин - не удалось обнаружить.
О выявлении в содержимом кишечника крыс 3,5,3'-трийодтиро-намина после введения им 3,5,3'-То сообщили J. Roche et al. (1962). Этот продукт образуется, по-видимому, за счет декарбоксилирования гормона и его коныогатов кишечными бактериями.
Дальнейшее превращение тиреоидных гормонов в тканях после их дейодирования или без него, очевидно, сопровождается разрывом дифениль-эфирной связи.
Коньюгирование способствует накоплению тиреоидных гормонов в тканях печени и почки и регуляции их уровня в крови.
J.I.Gross, C.P.Leblond (1947) обнаружили захват значительного количества меченного по йоду-131 Т4 клетками печени и почки через 5 ч после введения меченного йодтиронина.
A. Taurog et al. (1951,1952, 1954) определили состав про-
- 23 -дуктов обмена Т^ в ткани печени и в желчи крыс. Авторы установили, что основными продуктами обмена тироксина, выделяемыми с желчью, являются глюкуро- и сульфоконьюгаты йодтиронинов. Физиологическое значение коньюгирования тиреоидных гормонов в то время еще не было установлено.
Наличие процессов коньюгирования йодтиронинов (Tg, pTg Tg и Tj) и их аналогов подтверждено и другими авторами ( J.Roche, R.Michel , 1959-1964; S.V.Flock et al., I960; М.Мирахмедов, 1966; I.J.Chopra , 1981).
Этот путь обмена йодтиронинов обнаружен как у людей ( A.Albert et al., 1952; N.B.Myant , 1956), так И у ЖИВОТНЫХ ( A.Taurog et al., 1952; J.Roche, R.Michel , 1962). Он характерен для клеток печени и почки.
С применением ферментативного гидролиза установлено, что Т^ в клетках печени и почки коньюгируется главным образом с глю-куроновой кислотой (N.Etiing, s.В.Barker , 1959). Фермент j>- глюкуронидаза, вырабатываемый кишечной флорой, гидролизует глюкуроконьюгат йодтиронинов, и освободившиеся гормоны вновь всасываются кровью.
Сульфоконьюгаты йодтиронинов обнаружили J.Roche et al. (1954, 1955) в желчи и сыворотке крови крыс, которым вводили меченный по йоду-ІЗІ Ти или Т3. Методом хроматографии и электрофореза на бумаге было продемонстрировано, что сульфоконыогиро-Еание характерно главным образом для Тд и осуществляется в клетках печени и почки.
Данный продукт обмена в следовых количествах обнаружен и в
йодистых компонентах мочи у животных после введения им меченого
гормона ( P.ThiVblemont ,1961).
Исследование состава продуктов обмена тиреоидных гормонов,
экстрагируемых с желчью, продолжается.
I.J.Chopra et ai. (1981) показали, что в желчи,кроме конь-югата Т4 и Т3, имеются коньюгаты pTg, Т2, Tj- и другие, неиденти-фицироваяные йодистые компоненты.
Таким образом, глюкоконьюгаты выделяются в основном с желчью в кишечник. Часть их расщепляется ферментом J> - глюкуронидазой, вырабатываемой кишечной флорой. Освободившийся Т4 вновь всасывается в кровь.
В физиологических условиях глюкурокояьюгаты йодтиронинов отсутствуют в крови. Что касается сульфоконьюгатов, то они в незначительных количествах попадают в кровь и там расщепляются. В периферических тканях сульфоконыогаты гормона под действием специфического фермента арил-сульфатазы расщепляются на остатки серной кислоты и свободный гормон. Освободившийся йодтиронин используется в периферических тканях ( «I.Roche et ai. , 1958, I960).
На основании приведенных выше данных литературы можно считать, что процесс коньюгирования гормонов щитовидной железы в печени играет существенную роль в механизме регуляции концентрации тиреоидных гормонов в крови. Он обеспечивает оптимальную концентрацию тиреоидных гормонов в организме и предохраняет его от отравления тироксином.
Дейодирование тироксина и превращение его в трийодтиронин и реверсивный трийодтиронин. Деградация гормонов щитовидной железы путем дейодирования занимает одно из центральных мест в общем метаболизме йодтиронинов. Ксли из щитовидной железы здоровых людей ежедневно секретируется в кровь в среднем 87 мкг Т^, то более 60% его в результате дейодирования превращается в организме в Т3 (3,5,5- ) и рТ3 (3,8'5'-Т3) ( I.J.Chopra , 1976).
Если исходить из того, что на атомы йода в составе молекулы Т^
приходится 60%, то становится ясным значение данного пути обмена гормона в оощем его метаболизме.
Результаты ранних исследований по значению дейодирования Т4 (до применения радиоиммунного анализа) были противоречивы. Попытки определить физиологическое значение дейодирования тиреоидных гормонов и уточнить связь их с механизмом его действия дали неубедительные результаты ( S.Lissitzky et al., i960; I.Wynn et al. , I96z; Л.Х.Туракулов, 1963; S.B. Barker , 1У66).
Б лаборатории оиохимии гормонов Института .биохимии ай УзОСґ детально изучались особенности метаболизма тиреоидных гормонов в различных органах беременных животных и их плодов.
Т.Д.иашюв (1975) установил, что при введении меченного по йоду-131 тироксина беременным животным процесс дейодирования протекает как в печени матери, так и в печени плода, Интєнсиб-ность дейодирования при введении меченого І-Тд в последние дни беременности в опытах как in vivo , так и in vitro в печени плода выше, чем в печени матери.
Исследования Ф.Я.Гуламовой(і98І) показали, что в печени плода скорость превращения Т"4 в Т3 на 30-40% ниже, чем в печени беременных крыс; содержание компонента, соответствующего обратному То, в печени плода выше, чем в печени матери.
Особенности связывания и метаболизма Т^ в возрастном аспекте изучала также Г.Б.Валуева (1980). Она пришла к выводу, что значительно более -высокая ферментативная активность дейодиназы-5' в тканях старых животных по сравнению с дейодиназой-5 обусловливает преимущественное монодейодирование у них Т^ в Тд, а не в
обратный Т'3, как у молодых. Этот механизм в старческом организме обеспечивает пополнение трийодтиронинового пула на 97,8% за счет
экстратиреоидального образования Т3 из Т^.
A. Nauman et alj(1979) обнаружили интенсивный переход Т^ в Т^ в гомогенате печени 5-недельных и 10-месячных крыс. Де йодирование тироксина снижалось начиная с 7-8-недельного возраста. Авторы пришли к заключению, что уровень трийодтиронина в крови зависит преимущественно от активности дейодирующей Т^ системы в тканях и, в меньшей степени, от активности гипоталамо-гипофизар-ной оси.
По данным R.D.utiger (1980), 80$ трийодтиронина в организме образуется путем дейодирования тироксина. Т^-5'-дейоди-наза, катализирующая превращение Т^ в Т^, наиболее активна в печени и почке, хотя обнаружена во всех тканях. Активность этого фермента регулируется sh -группами в цитозоле.
Дейодирующая способность субклеточных структур (плазматическая мембрана, митохондрии и микросомы). Экспериментальные данные о распределении дейодирующей активности ферментов в субклеточных структурах свидетельствуют о наличии в плазматической мембране, митохондриях и микрасомах дейодирующих систем.
E.C.Albright et ai . (1954) обнаружил дейодирование тироксина и переход его в трийодтиронин после инкубации со срезами ПОЧКИ. W.E. Spott, N.F.MacLagan (1955), ИСПОЛЬЗуя меченный
по йоду-131 Т^ и Т^ при инкубации со срезами печени, показали участие ферментной системы в этом процессе. Они установили, что каждый из тиреоидных гормонов имеют свои оптимум рН дейодирования. При инкубации тироксина с гомогенатом печени при рН 3,5 или 9,5 в течение 18 ч дейодируется всего 20% этого гормона. Дейодирование Т^ при этих же условиях протекает иначе. При рН 3,5 он вообще не подвергается дейодированию, а при рН 9,5 дейодируется
только 7% гормона. При рН инкубационной среды от 5,0 до 7,0 количество дейодированного Т^ увеличивается соответственно до 50-80$. Следовательно, активность дейодиназы йодтиронинов зависит от рН среды инкубации. Процесс деиодирования тироксина ускоряется после добавления в инкубационную среду флавина мононук-леотида (ФМН) ( j.B.stanbury et ai ., I960). При добавлении витамина С дейодирование гормона прекращается ( i.e. Rail et ai., 1963).
Высокая активность дейодиназы обнаружена в микросомальных фракциях клеток печени. Оптимальный рН для микросом печени в процессе деиодирования тиреоидных гормонов в цитратном буфере при температуре 42С равнялся 4,7 ( I. Wynn , R.Gibbs , 1962) . По данным этих авторов, дейодирование йодтиронинов в печени происходит при участии железосодержащего соединения, занимающего промежуточное положение между НАД.Н-оксидазой и цитохром-с-редук-тазой. Но все же вопрос об участии ферментной системы в механизме деиодирования гормонов щитовидной железы оставался спорным, так как были обнаружены спонтанные деиодирования, часть йодтиронинов дейодировались без участия ферментов ( a. Taurog , 1963).
Последующие исследования показали наличие ферментативных и неферментативных путей деиодирования тиреоидных гормонов в клетках печени и почек ( м.Жакапо et ai ., 1973). По мнению этих авторов в энзиматическом пути обмена Т^ участвуют НАД.Н, ФАД, а в не ферментативном пути обмена Т^ активируются Ре2+ и аскорбиновая кислота. Однако точные механизмы всех этапов различных путей деиодирования гормона ( образование 3,5,3'-Т5, 3,3^-1^, 3,3^2 и т.д.) и их физиологическое значение не ясны. Весьма вероятно, что неферментативный путь деиодирования йодтиронинов
связан с процессом инактивации излишних количеств гормонов или одним из путей деградации после реализации их клеточного эффекта.
Физиологически более важным является ферментативный путь обмена основного гормона щитовидной железы - Т^. Однако до сих пор не выделен в чистом виде фермент дейодиназа, не охарактеризованы его состав и физико-химические свойства.
В 1973 г Ushijimai et ai . предприняли попытку охарактеризовать места связывания катализирующей реакции дейодирования Т^, выделенного из клетки печени. Было показано, что он состоит из ZLfo белка, 60% фосфолипида и 19$ нейтральных жирных кислот. Этими исследованиями было опровергнуто мнение I. Wynn (1962 ) согласно которому в состав дейодиназы входят белки, связанные с
Таким образом, именно ферментативный путь отщепления атома йода от тироксина и превращения его в трийодтиронин в клетках-мишенях имеет большое физиологическое значение.
Скорость дейодирования йодтиронинов зависит также от по -ложения йода в тирониновом кольце тироксина. Атомы йода в положении 3' и 5' в тирониновой структуре тироксина удаляются последующим образованием 3,5,3^-1^ или 3,3'5'-Т7 (М.Мирахмедов, 1974, 1979). Начальные этапы процесса дейодирования йодтиронина рассмот'
рвНЫ также Я.Х.ТуракуЛОВЫМ (1964) И S.B. Barker (1966 ).
Еще в 1964 г Я.Х.Туракулов, работая в лаборатории известного специалиста по биосинтезу и метаболизму тиреоидных гормонов J. Roche (Франция), провел серию исследований по изучению взаимоотношений между дейодированием йодтиронинов и дыханием лейкоцитов. Полученные результаты дали основание полагать, что дейодирование тиреоидных гормонов не является простым механизмом инактивации.
Дальнейшие исследования подтвердили правильность этого предположения.
Согласно s.b. Barker (1966), взаимосвязь между метаболизмом тироксина и его биологическим действием включает связывание гормона с поверхностью белка-рецептора, что сопровождается специфическим дейодированием, после которого немедленно наступает внутриклеточное изменение в молекуле гормона. Однако такой взгляд не был экспериментально обусловлено.
В последние годы было показано ( М.Мирахмедов, 1976,1979; I.J. Chopra et al., 1976,1978; J.R.Surks et al ., 1977; Г.В. Валуева, 1980) важное значение дейодирования Т^ и превращение его в З,5,3'-Тз и З,3'5і-Тз как на уровне целостного организма, так и в условиях in vitro.
Однако, несмотря на обширные исследования по изучению различных путей дейодирования тиреоидны'х гормонов, все еще отсутствует четкое представление о механизме регуляции путей обмена -основного этапа тиреоидной регуляции. Нет четкого представления о локализации процесса превращения Т^ в Т$ в нлеточных компонентах органов-мишеней. Наконец, требует уточнения вопрос, является -ли тироксин активным гормоном или он только прогормон трийодти-ронина.
- зо -
П. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Основная наша цель заключалась в изучении роли клеточных структур органов-мишеней в транспорте, связывании и деиодировании тиреоидных гормонов. Работа включает материал экспериментов, проведенных на 496 белых беспородных крысах-самцах массой 180+20 г:
группа интактных животных - 140
группа гипертиреоидных животных - 87
группа гипотиреоидных животных - 82
Для уточнения практического значения модельных экспериментов нами были обследованы:
больные, страдающие токсическим зобом - 12
больные, страдающие гипотиреозом - 12
доноры - 18
Все больные были обследованы в клинике Института краевой
медицины МЗ УзССР. Кровь доноров получали из НИИ периливания
крови МЗ УзССР.
П.І. Метод воспроизведения экспериментального гипо- и гипертиреоза
Экспериментальный тиреотоксикоз вызывали у 87 крыс-самцов пероральным введением сухого порошка щитовидной железы (препарат тиреоидина) производства фармзаводов Иванова и Баку по 200 мг на 100 г массы животного. Препарат продолжали вводить до появления признаков интоксикации ( в среднем 60 дней).
В некоторых случаях использовали синтетический препарат-тироксин Венгерского производства фирмы "Реанал". Его вводили из расчета 4 мг на 100 г массы крысы в течение 8-Ю дней. На разных этапах развития тиреотоксикоза определяли концентрацию йода,
- ЗІ -связанного с белками сыворотки, методом Штольца (1963). На протяжении всего опыта животные содержались на обычном виварном рационе.
К концу соответствующего периода у животных отмечались резкое беспокойство, жидкий стул, выпадение шерсти, слабость, дрожание конечностей, уменьшение массы тела в среднем на 30—45%.
Экспериментальный гипотиреоз вызывали у 82 животных, подвергая их хирургической тиреоидэктомии по методу Кабака (1968). Стерильно побрив всю вентральную сторону шеи под эфирным наркозом, кожу в области операционного поля смазывали спиртом.Скальпелем разрезали кожу шеи на протяжении 2,5-3 см по средней линии. Острым пинцетом разделяли мышцы и обнажали трахею, удаляли одну долю щитовидной железы, затем перешеек со второй долей.
П.2.Методика определения распределения общего гормонального йода в различных тканях
Распределение общего гормонального йода в тканях, чувствительных и нечувствительных к тироксину, определяли по способу W.H.Richard et ai. (1963). Тиреоидэктомированным животным в течение 17 дней ежедневно вводили меченный по йоду-125 тироксин по 925 KBg/мг, 1,5 мг Т4 растворяли в 0,5 мл 0,01 М раствора хлористого натрия рН 7,4, содержащего 0,1% бычьего альбумина. Таким образом, стабильный гормон в организме максимально заменяли радиоактивным тироксином.
Через 24 ч после последней инъекции -" 1-Т4 животных убивали путем кровопускания. После инъекции 0,1% гепарина через нижнюю полую вену производили перфузию всех органов через сердце с использованием 0,01 М фосфатного буфера, 0,15 М Пасі рН 7,4 и 0,7% бычьего сывороточного альбумина, очищая их от остат-
ков крови.
Из каждого органа вырезали кусочек ткани, высушивали фильтровальной бумагой и взвешивали на торзионных весах (по 400 мг). Радиоактивность в исследуемых образцах ткани определяли на гамма-счетчике типа GGB 15227-ВТР (ФРГ). Затем объединяли аналогичные органы 3 или 4 крыс, гомогенизировали и определяли состав йодистых компонентов. Гомогенизирование тканей осуществляли в 0,15 М растворе Naci в гомогенизаторе с тефлоновим пестиком. Для экстракции йодистых компонентов из ткани применяли кислый, а затем нормальный бутанол или 95% этанол, тщательно встряхивая. Полученный экстракт йодистых компонентов высушивали досуха в вакуумном шкафу при 40-60С.
Высушенный осадок бутанолового экстракта исследуемых органов использовали для хроматографии и электрофореза на бумаге.
Состав и количественное соотношение йодистых компонентов определяли по М.Мирахмедову (1981).
П.3.Определение белковосвязэнного йода
I мл или I г биологического материала (сыворотка, ткань и т.д.) смешивали в тугоплавкой центрифужной пробирке с I мл 10% раствора SnSO^ и 2 мл 2н углекислого Na и сушили в кипящей водяной бане или сушильном шкафу при 97С.
Пробирки оставляли в муфельной печи на 1,50 мин при 600* ЮС. После охлаждения пробирок из сожженного остатка готовили суспензию в 6 мл воды. Образцы центрифугировали при 2 500 об/мин 10 мин. 2 мл прозрачного раствора над осадком переносили в другую пробирку. К раствору прибавляли 2 мл кислой смеси. После тщательного перемешивания штативы с образцами помещали в ледяную баню при 4С. Спустя 10 мин прибавляли 2 мл охлажденного раство-
pa сульфата церия аммония.
После прибавления раствора ко всем образцам содержимое пробирок тщательно перемешивали и штатив с образцами помещали на 20 мин в теплую водяную баню (40тО,1С). Затем штативы с пробирками снова охлаждали в течение 10 мин в ледяной бане (-4С), после чего прибавляли 0,5 мл 1% раствора бруцина и вновь перемешивали. Затем образцы переносили на 15 мин в термостат, где при температуре гЮ0С создавалась их стабильная окраска. Интенсивность окраски в течение 48 ч измеряли на спектрофотометре при длине волны 430 ммк.
Одновременно с каждой серией исследуемых образцов таким же образом обрабатывали стандартные растворы йода для построения калибровочной кривой. Ее прямолинейность обеспечивали, указав на миллиметровой бумаге на оси аосцисс концентрацию йода, а на оси ординат - соответствующее содержание йода в образцах, пересчитанное на 100 мл или на I г исследуемого материала.
П.4. Методика определения связывания тиреоидных гормонов с мембранами клеток печени
Метод выделения плазматических мембран. Плазматические мембраны получали по методу D.M.Neville (1967) в модификации С.Я.Давыдовой (1973).
Животных обезглавливали, вскрывали орюшную полость, надрезали Еоротную вену, вставляли в нее канюлю, через которую производили перфузию печени охлажденным ImM NaHCO* (гипотонический раствор) с добавлением 0,5 тМ СаС12 (рН 7,5) до тех пор, пока оттекающая жидкость не переставала окрашиваться кровью. Затем печень извлекали из брюшной полости, тщательно просушивали ф)иль-тровальной бумагой, освобождали от соединительной ткани, взвеши-
-Завали и измельчали ножницами, 5 г печени гомогенизировали в 25 мл I m м раствора Нансо^ (рН 7,5) в стеклянном гомогенизаторе типа Поттера-Эльвегейма, поднимая и опуская тефлоновый пестик 35-40 раз.
Полученный гомогенат разбавляли в 500 мл того же раствора Malice^ и встряхивали в течение 2 мин. Разбавленный гомогенат печени фильтровали через б слоев марли и центрифугировали при 1200 xg 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, верхний розовый слой осадка отделяли от нижнего, коричневого. Коричневый осадок отбрасывали.
Розовый осадок мембран суспендировали в среде для гомогенизации и центрифугировали при тех же условиях. Эту процедуру повторяли трижды. Осадок мембран суспендировали в воде и переносили в центрифужную пробирку ротора с откидными стаканами (бак-ет-ротор) препаративной ультрацентрифуги.
К 1,2 мл суспензии добавляли по каплям, при перемешивании, 2,1 мл сахарозы плотностью 1,34. Получали смесь плотностью 1,20. На нее осторожно наслаивали I мл раствора сахарозы плотностью 1,16. Центрифугировали 75 мин при 10 000 х g на центрифуге "Spinco " , бакет-ротор sw -39.
В результате центрифугирования на границах плотностей сахарозы 1,20-1,18 и 1,18-1,16 появлялись два отчетливых слоя. Плазматические мембраны выделялись в зоне между растворами сахарозы с плотностями 1,20 и 1,18. Слой плазматических мембран собирали шприцем, предварительно осторожно удалив жировую пленку. Препараты плазматических мембран дважды отмывали дистиллированной водой. Таким образом получали чистые плазматические мембраны.
Чистоту препаратов плазматических мембран проверяли под
электронным микроскопом и по наличию активности ферментов-маркеров (АТФ-азы и 5'-нуклеотидазы). Загрязненность изолированных плазматических мембран микросомами контролировали по присутствию глюнозо-6-фосфатазы.
Метод выделения ядер. Ядра изолировали из нормальной печени крыс по методу с .c.v/idneii et аі.(І966), И.Б.Збарского и др. (1967). Животных убивали декапитацией. Быстро извлекали печень и помещали ее в охлажденную среду, содержащую 0,25 М сахарозу на буфере ТКМ (буфер ТКМ содержит 0,005 М MgCl2 ,0,025 М КС1 и 0,001 М трис-НСІ буфер рН 7,5).
Охлажденную ткань печени измельчали ножницами и гомогенизировали при 4С в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с тефлоновым пестиком в 0,25 М растворе сахарозы на буфере ТКМ. Полученный гомогенат фильтровали через 4- и затем 8 слоев марли и центрифугировали при 300-400 хєв течение 10 мин. Супернатант использовали для получения митохондрий.
Осадок ядер суспендировали в 2,2 М сахарозе, а сверху наслаивали суспензию. Центрифугировали на центрифуге vac -601 75 мин при 105 000 xg . В осадке получали чистые ядра.
П.4.1. Методика определения связывания тиреоидных гормонов с плазматическими мембранами клеток ткани печени
Определение связывания тиреоидных гормонов с плазматическими мембранами клеток печени проводили по способу j.Gharbi , J.Torresard (1979).
Очищенную плазматическую мембрану инкубировали отдельно с меченным по йоду-125 тироксином и трийодтиронином (37kbg /мг, или около 40-60 пикомолей Т^ в инкубационной среде; удельная
_ 36 -
активность 1850-2590 kbg /мг) с последующим добавлением немеченого гормона в возрастающих концентрациях. Инкубационной средой служила система из 0,25 М сахарозы, 2,0 тМ триса, I m М MgCl2 , 2 mM ЭДЕА, 5,0 т М Had , 0,1 т М дитеотрейтола (ДТТ), 5% глицерина (рН 7,5).
Плазматические мембраны, содержащие белка около 100 мг/мл, инкубировали как с ^L-T^, так и с іСЗІ-Т^ ( в концентрации ЗхЮ^Ш) в 0,1 мл буфера при 24С 150 мин. После инкубации пробы центрифугировали при 1500 х g 20 мин при 4-С. Супернатант удаляли и осадок дважды промывали в I мл ледяного буфера, после чего определяли содержание связанного гормона, подсчитывая радиоактивность в колодезном гамма-счетчике.
трс трс
Сродство хс-^1-Т^ и ^I-T^ к очищенным плазматическим мембранам изучали путем конкурентного анализа с добавлением немеченого гормона в возрастающих концентрациях.
П.5. Метод определения превращения тироксина в три-йодтиронин в клетках ткани печени и почки
Определение превращения тироксина в трийодтиронин в клетках печени и почки проводили in vitro по способу I.J.Chopra (1977). Очищенные ядра получали по методу с.с. Widneil et ai. (1966) и И.Б.Збарского с соавторами (1967), очищенные плазматические мембраны - по способу d.m. Neville (1967) в модификации С.Я.Давыдовой (1973). Митохондрии выделяли по способу w.c. Schneider, G.H. Hogedoom (1950) В модификации S.F. Parsons, M. Simpson (1967).
Животных убивали кровопусканием, печень и почки очищали от остатков крови перфузией ледяным физиологическим раствором. Ткань печени и почек гомогенизировали в 0,25 М сахарозе с добав-
лением 0,05 М трис- неї рН 7,4, Гомогенат центрифугировали при 1500 х g в течение 30 мин. Супернатант использовали для инкубации, добавляя 5 мг/мл (6x10 М) стабильного тироксина, 0,2 М фосфатный буфер рН 7,5, I m М мернаптоэтанол и 5 тМ ЭДТА. Конечный объем реакционной смеси был равен 2 мл.
Параллельно инкубировали субклеточные структуры без добавления немеченого гормона. Инкубацию осуществляли на аппарате Варбурга при 37С 30 мин. После окончания инкубации в среду добавляли равный объем 95% этанола, экстрагировали 20 мин на электрической мешалке и центрифугировали при 23 000 об/мин 45 мин. Супернатант высушивали досуха, под вакуумом, при температуре 40-60С. Сухой осадок этанолового экстракта, содержащий йодистые компоненты, растворяли в фосфатном буфере (0,15 М, рН 7,4).
Содержание трийодтиронина в опытных и контрольных образцах определяли методом радиоиммунного анализа с использованием наборов фирмы " Amersham " на гамма-счетчике "РАК-ГАММА" фирмы ЛКБ (Швеция).
П.б. Методика исследования связывания тиреоидных гормонов с йодтиронинтранспортирующими белками клетки ткани печени
Определяли процентное распределение между белковыми фракциями экзогенно введенного в индикаторных дозах тироксина и трийодтиронина, меченного по йоду-125 (удельная активность 1850-2590 kbg /мг).
Перед определением распределения экзогенно добавленного меченого гормона между белковыми фракциями клеток ткани печени ( in vitro ) , их очищали от неорганического йода-125, свободных ^51-Та и "I-Tv Диализ осуществляли против бидистиллиро-
-38-ванной воды. Такую процедуру проводили при температуре +4С в течение 16-18 ч, и затем определяли процентное распределение меченных гормонов щитовидной железы, инкубированной с цитозольными и растворимыми белками клетки печени. Растворимые белки печени выделяли по методу О.Б.Кузовлевой (I960).
В опытах in vivo после многократного введения йода-125 животных убивали путем кровопускания. Печень очищали от остатков крови. Ткань печени гомогенизировали при 0С в 0,25 М растворе сахарозы. Гомогенат центрифугировали при 105 000 х g в течение I ч, затем выделяли супернатант, содержащий растворимые белки ткани печени. Из супернатантов методом гельфильтрации выделяли йодтиронинсвязывающие фракции растворимых белков.
Выделенные грубоочищенные гормонсвязывающие белки насыщали тироксином или трийодтиронином, меченными по йоду-125. Раствор белков пропускали через колонку с сефадексом G -25 (Юх 1,3 см) с целью очистки их от свободного йода и тиреоидных гормонов. Определенную часть этих меченых белков фракционировали методом колоночной хроматографии. Фракционирование йодтиронин-
СВЯЗЫВаЮЩИХ белков клетки Пвчени ПРОВОДИЛИ На КОЛОНКе " Pharmacia " (Швеция). Колонку с сефадексом G -75 промывали 0,01 М трис-НС1 буфером в течение 18-20 ч, после чего она считалась готовой к фракционированию.
