Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Общие требования к биомаркерам 11
2.2. Биомаркеры рака яичника, используемые в клинической диагностике 12
2.3. Разработка новых диагностических методов путем комбинирования биомаркеров 13
2.4. Применение транскриптомного подхода для поиска новых биомаркеров 15
2.5. Использование протеомных технологий для открытия новых биомаркеров 15
2.5.1. Двумерный электрофорез 16
2.5.2. Антительные микрочипы 20
2.5.3. Масс-спектрометрические методы. Технология белковых чипов SELDI-TOF 21
2.5.3.1 Общий подход к разработке диагностического алгоритма на основе масс-спектров 25
2.5.3.2 Результаты применения технологии SELDI-TOF для диагностики рака яичника 26
2.5.3.3 Подбор выборок для исследования 27
2.5.3.4 Природа маркерных масс-спектрометрических пиков 30
2.5.3.5 Биомаркеры, идентифицированные с использованием технологии SELDI-TOF 33
2.5.3.6 Сывороточный амилоид А острой фазы: возможная связь с раком 38
2.5.3.7 Анализ модификаций белков с использованием технологии SELDI-TOF 43
2.5.3.8 Перспективы использования технологии SELDI-TOF 45
3. Материалы и методы 47
3.1. Материалы 47
3.2. Объекты исследования 47
3.3. Иммуноферментный анализ 49
3.3.1 Измерение концентрации сывороточного амилоида А методом иммуноферментного анализа 49
3.3.2. Измерение концентрации СА125 методом иммуноферментного анализа 49
3.4. Профилирование сывороток с применением SELDI-TOF 50
3.4.1 Протокол пробоподготовки с использованием анионообменных чипов SAX2 50
3.4.2. Протокол пробоподготовки с использованием катионообменных чипов WCX 50
3.4.3. Протокол пробоподготовки с использованием обращеннофазовых чипов Н4 50
3.4.4. Протокол пробоподготовки с использованием нормальнофазовых чипов NP20 51
3.5. Анализ масс-спектров 51
3.6. Статистическая обработка результатов 51
3.6.1. Метод опорных векторов и рекурсивный отбор признаков 52
3.5.2. Логистическая регрессия и информационный критерий Акаике 52
3.5.3. Определение эффективности диагностического алгоритма 53
3.5.4. Метод пар с наибольшим счетом (top scoring pairs, TSP) 53
3.5.5. Вычисление коэффициента корреляции 53
3.5.6. Кластерный анализ 54
3.5.7. Программное обеспечение 54
4. Результаты и обсуждение 55
4.1. Определение концентрации белка A-SAA в сыворотках методом иммуноферментного анализа 55
4.2. Масс-спектрометрическая детекция белка A-SAA в сыворотке крови 56
4.2.1. Определение чувствительности детекции A-SAA с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF. 57
4.2.2. Масс-спектрометрическое определение различных форм сывороточного амилоида в сыворотке 60
4.3. Обработка масс-спектров спектров SELDI-TOF, полученных с использованием чипов с нормальнофазовои поверхностью, с использованием жестких критериев для идентификации пиков 63
4.4. Классификация масс-спектров SELDI-TOF с использованием метода пар с наибольшим счетом (TSP) 63
4.5. Разработка диагностического алгоритма на основе комбинированных протеомных данных с использованием метода опорных векторов и логистической регрессии 64
4.6. Анализ результатов перекрестной проверки достоверности 66
4.7. Кластерный анализ данных масс-спектров SELDI-TOF 69
4.8. Дискриминаторные пики, отобранные различными классификаторами 79
5. Заключение 83
6. Выводы 85
7. Список литературы 86
- Биомаркеры рака яичника, используемые в клинической диагностике
- Использование протеомных технологий для открытия новых биомаркеров
- Измерение концентрации сывороточного амилоида А методом иммуноферментного анализа
- Определение концентрации белка A-SAA в сыворотках методом иммуноферментного анализа
Введение к работе
Актуальность
В современном обществе одной из основных причин смертности являются злокачественные опухоли. Огромное внимание в медицине и примыкающих к ней дисциплинах уделяется поиску новых подходов к лечению этого заболевания. Однако эффективность лечения рака во многом определяется возможностью его ранней диагностики, поэтому очень важной проблемой является разработка простых и эффективных способов диагностики рака, в особенности, на ранних стадиях. Вовремя диагностированный рак в большинстве случаев вылечивается, причем для полного выздоровления зачастую оказывается достаточно одного лишь хирургического вмешательства. Проблема ранней диагностики особенно актуальна в отношении рака яичника - наиболее распространенного из гинекологических раков. Ранние стадии рака яичника протекают практически бессимптомно, в результате почти в 90% случаев рак яичника диагностируют только на поздних стадиях, когда заболевание уже, как правило, не поддается лечению [Jacobs et al, 2004; Petricoin et al, 2002].
Из-за отсутствия клинических симптомов на ранних стадиях рака яичника для своевременного выявления болезни необходимо проводить периодический скрининг «групп риска» - определенных возрастных групп или людей, по той или иной причине имеющих индивидуальную предрасположенность к раковым заболеваниям. Для широкомасштабного обследования населения необходимо наличие простого и дешевого, но в то же время достаточно надежного диагностического метода.
Одним из распространенных и перспективных способов малоинвазивной диагностики рака является диагностика по концентрации в крови опухолевых биомаркеров. К настоящему времени для клинической диагностики рака яичника используют только один биомаркер - СА125. Однако этот биомаркер обладает невысокими чувствительностью и специфичностью (при специфичности 97% чувствительность составляет всего 65%) [Zhang et al, 2004]. Известно большое количество других биомаркеров рака ячника, однако ни один из них в отдельности не обладает высокой точностью диагностики. По-видимому, из-за сложного состава сыворотки и гетерогенной природы рака, выявить в крови универсальные белки-маркеры рака невозможно. Основной идеологией современных исследований является созданиеспособов диагностики на основе комбинаций нескольких биомаркеров.
Интенсивное развитие протеомных технологий открыло новые перспективы для поиска биомаркеров заболеваний. Одной из наиболее высокопроизводительных и перспективных платформ для поиска биомаркеров является масс-спектрометрическая технология белковых чипов SELDIOF (Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight - усиленная поверхностью времяпролетная лазерная десорбция/ионизация).
Применение масс-спектрометрии SELDIOF в этих целях началось около пяти лет назад и сразу дало многообещающие результаты [Petricoin et al, 2002; Kozak et al, 2003]. В ряде работ была продемонстрирована точность диагностики, близкая к 100 % [Zhu et al, 2003]. Однако плохая воспроизводимость результатов между разными лабораториями и во многих случаях неизвестная природа дискриминаторных масс-спектрометрических пиков порождало сомнения в возможности внедрения результатов в практическую медицину.
Анализ идентифицированных с использованием технологии SELDIOF биомаркеров рака яичника показывает, что все они присутствуют в сыворотке в достаточно высоких (в основном микромолярных) концентрациях, а изменение их концентрации обусловлено системным ответом организма на сопутствующее опухоли воспаление. Особое место среди найденных биомаркеров занимает идентифицированный в лаборатории диагностической протеомики ГУ НИИ БМХ РАМН в 2004 году биомаркер рака яичника сывороточный амилоид А острой фазы (A-SAA). Несмотря на то, что A-SAA давно известен как маркер воспаления, он обладает рядом уникальных и ценных для потенциального биомаркера рака свойств.
Во-первых, его концентрация в сыворотке крови в норме в 10-100 раз ниже, чем у других кандидатных маркеров. Во-вторых, при болезни концентрация A-SAA увеличивается в 100 и более раз, тогда как концентрация большинства других маркеров меняется сравнительно слабо. В-третьих, A-SAA синтезируется в тканях некоторых злокачественных опухолей [Gutfeld et al, 2006; Kovacevic et al, 2006]. И наконец, на основании последних данных о молекулярных эффектах и взаимодействиях A-SAA, повышение его концентрации при злокачественных опухолях может играть активную роль в развитии последних. Так, показана способность A-SAA индуцировать экспрессию транскрипционного фактора NFKB [He et al, 2003], играющего ведущую роль в блокировании апоптоза, и матриксных металлопротеиназ ММР1, ММРЗ и ММР9 [O Hara et al, 2004; Lee et al, 2005], вызывающих деградацию межклеточного матрикса и тем самым способствующих ангиогенезу и метастазированию. Способность A-SAA стимулировать пролиферацию клеток, ингибировать апоптоз, а также стимулировать ангиогенез была напрямую продемонстрирована на синовиоцитах больных ревматоидным артритом [Lee et al, 2006].
Перспективным подходом к разработке нового метода диагностики рака яичника может стать объединение данных масс-спектрометрических методов с данными иммуноферментного анализа о концентрациях классического биомаркера рака яичника СА125 и белка A-SAA.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является разработка экспериментальной системы диагностики рака яичника путем комбинирования данных иммуноферментного анализа о концентрациях СА125 и A-SAA и протеомных профилей сыворотки крови с примением различных методов статистической обработки результатов.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:
1. Измерить методом иммуноферментного анализа концентрации СА125 и А- SAA в выборке сывороток больных раком яичника на разных стадиях, больных доброкачественными гинекологическими опухолями и здоровых лиц.
2. Провести масс-спектрометрическое профилирование (SELDIOF) всех сывороток в условиях, оптимизированных для измерения уровня A-SAA, и определить чувствительность масс-спектрометрической детекции A-SAA в сыворотке.
3. Провести статистический анализ полученных данных, разработать диагностический алгоритм и определить его точность, чувствительность и специфичность.
Научная новизна работы
Впервые определена чувствительность масс-спектрометрии SELDIOF для детекции белка A-SAA в составе сыворотки крови. Ранее чувствительность метода при работе с такой сложной смесью, как сыворотка крови, была неизвестна.
С помощью кластерного анализа определена природа большей части дискриминаторных пиков на масс-спектрах.
Создана экспериментальная диагностическая система на основе комбинации масс-спектрометрических данных с данными о концентрации белка A-SAA и биомаркера рака яичника СА125.
К масс-спектрометрическим данным впервые применен статистический метод пар с наибольшим счетом.
Практическая значимость работы
Предложена новая экспериментальная диагностическая система для рака яичника, разработанная с применением современных статистических методов на основе комбинации данных о концентрации классического биомаркера рака яичника СА125, концентрации сывороточного амилоида А острой фазы и данных масс-спектрометрии с точностью диагностики 95,2%. Путем анализа выборки сывороток больных и здоровых людей российского населения показана применимость масс-спектрометрического метода для диагностики рака яичника.
Положения диссертации, выносимые на защиту
1. Определение чувствительности масс-спектрометрии SELDIOF для детекции белка сывороточного амилоида А острой фазы в составе сыворотки крови.
2. Разработка алгоритмов распознавания сывороток больных раком яичника и сывороток женщин, не страдающих раком яичника с помощью статистических методов логистической регрессии, опорных векторов и пар с наибольшим счетом при различных комбинациях исходных данных.
Апробация работы
Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:
1. 4-ый Ежегодный Всемирный Конгресс международной организации «Протеом человека» (HUPO 4h Annual World Congress), Мюнхен, Германия, 28 августа-1 сентября 2005 года;
2. Международная школа-конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», (Звенигород, 28 ноября - 2 декабря 2005 г.);
3. 3-я Международная Конференция «Геномика, Протеомика, Биоинформатика и Нанотехнологии для Медицины» (3rd International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine"), Новосибирск, 12-16 июля 2006 года;
4.5-ый Ежегодный Всемирный Конгресс международной организации «Протеом человека» (HUPO 5th Annual World Congress), Лонг Бич, Калифорния, 28 октября-1 ноября 2006 года.
Список публикаций по материалам диссертации
1. S. Moshkovskii, М. Vlasova, М. Safarova, О. Makarov, and A. Archakov "Serum amyloid A as ovarian cancer biomarker" II Abstr. HUPO 4th Annual World Congress, (August 28-September 1, 2005, Munich). - Molecular & Cellular Proteomics. - August 2005.-Vol. 4, Number 8 (Suppl. 1);
2. M.A. Власова, C.A. Мошковский, M.P. Сафарова, О.В. Макаров, А.И.Арчаков "Молекулярная диагностика рака яичника с использованием протеомных технологий" // Биомедицинская химия. - 2005. - т. 51 № 4. - с. 367-383;
3. М. А. Власова, С. А. Мошковский, А. И. Арчаков «Комбинирование данных масс-спектров SELDI и концентрации СА125 для диагностики рака яичника» // Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (28 ноября - 2 декабря 2005 г., Москва). - МАКС Пресс. -2005.-с. 18;
4. Е.И. Гоуфман, С.А. Мошковский, О.В.Тихонова, П.Г.Лохов, В.Г. Згода, М.В. Серебрякова, И.Ю. Торопыгин, М.А. Власова, М.Р.Сафарова, О.В.Макаров, А.И. Арчаков Протеомное исследование термостабильной фракции сыворотки пациентов с различными опухолями с применением двумерного электрофореза. // Биохимия. - 2006. - т. 71 №4. - с. 354-360;
5. М.А. Власова, С.А. Мошковский. Молекулярные взаимодействия сывороточного амилоида А острой фазы: возможная связь со злокачественными опухолями. // Биохимия. - 2006. - т. 71 №10 -с. 1051-1059;
6. S.A. Moshkovskii, М. A. Vlasova, М.А. Pyatnitskiy, A.I. Archakov Acute phase serum amyloid A in ovarian cancer as an important component of proteome diagnostic profile. II Abstr. 3rd International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine" (July 12-16, 2006, Novosibirsk, Russia) - p. 64;
7. Moshkovskii S.A., Vlasova M.A., Pyatnitskiy M.A., Archakov A.I. Serum amyloid A and tranthyretin forms constitute discriminatory SELDl profile for ovarian cancer. II Abstr. HUPO 5th Annual World Congress (October 28-November 1, 2006, Long Beach, California). - Molecular & Cellular Proteomics. - 2006. - Vol. 5, Number 10 (Suppl.);
8. Moshkovskii S.A., Vlasova M.A., Pyatnitskiy M.A., Tikhonova O.V., Safarova M.R., Makarov O.V., Archakov A.I. Acute phase serum amyloid A in ovarian cancer as an important component of proteome diagnostic profiling. II Proteomics. Clinical Applications. - 2007. - Vol. 1 (1). - p. 107-117.
Работа выполнена в лаборатории диагностической протеомики Государственного учреждения Научно-исследовательского института Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.
Проведенные исследования были поддержаны Государственным контрактом от 28 февраля 2006 года № 02.442.11.7426 в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» «Белок сывороточный амилоид А как потенциальный маркер для ранней протеомной диагностики рака яичника».
Биомаркеры рака яичника, используемые в клинической диагностике
К настоящему времени для рака яичника идентифицирован ряд маркеров. Из них широко используют в клинической диагностике единственный маркер - СА125. Этот биомаркер был обнаружен как антиген к одному из моноклональных антител, образующихся при иммунизации животных раковыми клетками человека, и представляет собой высокомолекулярный гликопротеид [Jacobs & Bast, 1989; Jacobs & Menon, 2004]. Концентрацию CA125 в крови обычно измеряют с помощью иммунного анализа. Уровень СА125 в крови может повышаться не только при раке яичника, но и при некоторых других видах рака, при доброкачественных опухолях, а также при нормальных физиологических состояниях: менструации или беременности [Jacobs & Bast, 1989]. К особенно существенным недостаткам этого маркера можно отнести повышение его концентрации при доброкачественных опухолях яичника. В этом случае их нельзя отличить от злокачественных, даже совмещая использование СА125 с ультразвуковым исследованием. Кроме того, концентрация этого маркера нередко возрастает только на поздних стадиях рака яичника. Если среди пациентов, больных раком в поздней стадии, концентрация СА125 повышена у 80%, то среди пациентов с раком яичника в начальной (первой) стадии только у 50-60% [Petricoin et al, 2002]. Перечисленные свойства объясняют невысокие чувствительность и специфичность СА125: при чувствительности 83% он обладает специфичностью 52%, а при чувствительности 65% - специфичностью 97% [Zhang et al, 2004].
Были проведены исследования по измерению концентрации СА125 в коллекции сывороток, собранных за 5 лет до постановки диагноза рака яичника.
Оказалось, что концентрация этого маркера была повышена только у 25% из 59 исследованных сывороток [Jacobs et al, 2004]. Это указывает на невозможность использования СА125 для прогнозирования рака яичника.
Несмотря на перечисленные недостатки, за отсутствием лучшего метода клинической диагностики, СА125 широко используют в диагностической практике в сочетании с ультразвуковым исследованием.
Распространенным подходом к увеличению чувствительности и специфичности метода диагностики является совместное использование нескольких маркеров. Однако надо понимать, что если для набора маркеров пользоваться критическими концентрациями, используемыми для каждого маркера в отдельности, и считать раком тот случай, когда концентрация хотя бы одного маркера выйдет за пределы нормы, то при существенном повышении чувствительности недопустимо понизится специфичность. Поэтому для создания системы диагностики на основе набора маркеров необходимо использовать методы многомерной статистики и вырабатывать более сложный алгоритм классификации [Skates et al, 2004].
Из методов биоинформатики для указанной цели наиболее часто применяют метод логистической регрессии, построения классификационного древа и дискриминантныи анализ. Метод логистической регрессии позволяет на основе экспериментальных данных вывести формулу, включающую в качестве переменных концентрации биомаркеров. При подстановке в эту формулу новых наборов концентраций, она возвращает значение вероятности того, что данный пациент болен раком. Метод дискриминантного анализа позволяет аппроксимировать на основе экспериментальных данных многомерную плотность вероятности для распределения здоровых и больных. Модель, построенная с помощью дискриминантного анализа, при использовании ее для диагностики, также возвращает вероятность рака на основе отношения плотностей вероятности для рака и не рака. Построение классификационного древа основано на поэтапном включении в классификацию нескольких биомаркеров. Сначала экспериментальные данные делятся на две группы на основе уровня одного из маркеров, затем каждая из ветвей расщепляется на две на основе концентраций других биомаркеров, и так продолжается до тех пор, пока каждой конечной точке не будет сопоставлен диагноз (рак, отсутствие рака или доброкачественная опухоль) [Skates et al, 2004].
Предпринимались многочисленные попытки [Jacobs et al,1993; Woolas et al,1995; Zhang et al, 1999; Skates et al, 2004] использовать для диагностики рака яичника в комбинации с СА125 белки, известные как биомаркеры различных видов рака: СА15-3 (маркер рака молочной железы [Li et al, 2002]), СА72-4 (маркер рака поджелудочной железы) и M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor -макрофагальный колонии-стимулирующий фактор) - цитокин, стимулирующий пролиферацию лимфоцитов, липид-ассоциированную сиаловую кислоту (LASA), известную как маркер рака мозга [Katopodis et al, 2001] и рака молочной железы [Brower et al,1995] и некоторых других видов рака, OVX1 - маркер рака эндометрия [Xu et al, 1994], СА9 - маркер рака почек, а также СА54/61, являющийся маркером рака яичника [Nozawa et al,1992]. Все упомянутые маркеры обладают низкой специфичностью для конкретного вида рака, и их концентрация во многих случаях изменяется по сравнению с нормой и при раке яичника. Использование различными исследователями панелей из 4-5 перечисленных белков для диагностики рака яичника позволило несколько улучшить специфичность и чувствительность метода по сравнению с одним СА125 (для ранней стадии рака удалось повысить чувствительность диагностики от 45% до 70% при неизменной. специфичности [Skates et al, 2004], для разграничения доброкачественных и злокачественных опухолей яичника удалось повысить чувствительность и специфичность с 78,1% и 76,8% соответственно, до 90,6% и 93,2% [Woolas et al,1995]). Таким образом, использование набора биомаркеров вместо одного является перспективным подходом к диагностике. Еще один подход к увеличению эффективности диагностики - это проведение нескольких повторных измерений концентрации СА125. Так, например, к группе риска относят женщин с невысоким, но увеличивающимся от измерения к измерению уровнем СА125 [Skates et al, 2003].
Поиск панелей биомаркеров, а также комбинирование биомаркеров, обнаруженных разными методами, является основной идеологией большинства современных исследований в области разработки биохимических диагностических методов.
Использование протеомных технологий для открытия новых биомаркеров
Преимуществом протеомного профилирования по сравнению с транскриптомным является то, что за реализацию основных биохимических функций организма отвечают именно белки, а не мРНК, и поэтому изменения их концентраций могут быть непосредственно связаны с патофизиологическими процессами. Большую роль в функционировании белков играют посттрансляционные модификации, и маркерами заболеваний могут служить определенные модифицированные формы белков. Кроме того, белки, модифицируемые или меняющие концентрацию при болезни, являются потенциальными мишенями лекарственных препаратов [Omenn et al, 2006].
С развитием протеомных технологий открылись совершенно новые перспективы по выявлению белковых маркеров рака. Протеомные технологии позволяют получать информацию сразу о больших совокупностях белков и сравнивать наборы белков у больных и здоровых людей, что дает возможность выявлять не один, а сразу несколько маркеров. В применении протеомных технологий к выявлению биомаркеров можно условно выделить два разных подхода. Первый подход использует новые технические возможности только для поиска новых маркеров с лучшими характеристиками и их дальнейшей идентификации. После этого можно использовать найденные маркеры в диагностике аналогично применяемым в настоящее время, то есть, выявлять их иммунными и подобными аффинными методами. Другой подход не предполагает обязательной идентификации биомаркеров, а основан на сравнении протеомного профиля в целом для больных и здоровых людей с привлечением статистических методов для выявления значимых различий, не выявляя их причин [Petricoin et al, 2001]. При этом диагностическим признаком является сам состав протеомного профиля, то есть исследования и непосредственная диагностика могут проводиться одним и тем же методом [Xiao et al, 2005].
Среди протеомных методов, используемых для непосредственного обнаружения и идентификации биомаркеров, существенную роль играет двумерный электрофорез с последующей масс-спектрометрической идентификацией белков. Метод двумерного электрофореза позволяет осуществлять разделение белков в одном направлении - методом изоэлектрофокусирования, а в другом - по массе. Изоэлектрофокусирование представляет собой разделение белков в градиенте рН: каждый белок движется в геле до тех пор, пока не достигнет значения рН, совпадающего с его изоэлектрической точкой. В последнее время используют иммобилизованные в геле градиенты рН, при этом доступны градиенты рН очень узкого диапазона (до 0,2), что позволяет разделять белки с близкими значениями pi и соответственно увеличивает разрешение [Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002]. Часто сначала производят разделение белков в широком диапазоне рН, с грубым разрешением, а затем отдельные фракции разделяют в более узком диапазоне рН. Такое предварительное разделение позволяет получить обогащенные фракции, и в результате детектировать не только мажорные, но и минорные белки [Hanash, 2003]. Для выявления биомаркеров сравнивают интенсивность пятен на геле для нормы и болезни. Затем пятна, которые существенно различаются между нормой и болезнью, вырезают из геля и идентифицируют масс-спектрометрически.
В качестве материала для двумерного электрофореза часто используют не кровь, где концентрация потенциальных маркеров, скорее всего, невелика, а непосредственно опухолевые и нормальные ткани исследуемого органа, где абсолютная концентрация гипотетического маркера должна быть большей и различия в концентрации более явными. Однако как здоровые, так и опухолевые ткани представлены различными типами клеток, что усложняет воспроизводимость и интерпретацию результатов. Решить эту проблему в значительной степени позволило изобретение метода лазерной микродиссекции, с помощью которого можно отделить интересующую клеточную популяцию от окружающих тканей [Craven et al, 2002; Wulfkuhle et al, 2003].
Помимо классического двумерного электрофореза для обнаружения маркеров заболеваний используют также его усовершенствованные варианты.
Среди таких методов - дифференциальный электрофорез в геле (DIGE). Белковые экстракты из больной и здоровой тканей метят двумя различными флуоресцентными зондами и смешивают. Затем проводят двумерный электрофорез, после чего для каждого пятна измеряют интенсивность флуоресценции и определяют различие в интенсивности между двумя флуоресцентными метками. Такой подход позволяет достичь полной идентичности условий проведения электрофореза и за счет этого повысить воспроизводимость результатов [Unlu, Morgan & Minden, 1997; Zhou et al, 2002]. Двумерный электрофорез также применяют для скрининга сыворотки больных раком с целью выявления белков, связывающихся с аутоантителами, полученными к белкам раковых клеток [Wulfkuhle, Liotta and Petricoin, 2003].
Измерение концентрации сывороточного амилоида А методом иммуноферментного анализа
Для определения концентрации A-SAA использовали набор для иммуноферментного анализа Human SAA (Biosource, США). Анализ проводили в соответствии с протоколами производителя. Для всех сывороток концентрацию А-SAA измеряли, как минимум, в двух повторностях, а для высоких концентраций - в разных разведениях. Сначала лунки дважды промывали промывочным буфером. После этого в каждую лунку, содержащую моноклональные антитела к человеческому сывороточному амилоиду А, добавляли по 50 мкл раствора конъюгированного анти-SAA антитела (стоковый раствор разводили в 25 раз непосредственно перед добавлением в лунки). Затем в лунки добавляли по 50 мкл стандартных растворов SAA в концентрации от 9 до 150 нг/мл или по 50 мкл разведенной буфером для разведения (в 100 - 50000 раз) сыворотки. Две лунки использовали в качестве отрицательных контолей: одну лунку заполняли 100 мкл буфера для связывания, в другой смешивали 50 мкл буфера и 50 мкл раствора анти-SAA антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Плашку инкубировали в течение 1 часа при 37 С, затем содержимое выливали, лунки 3 раза промывали промывочным буфером и в каждую лунку наносили по 100 мкл раствора субстрата PNPP (пара-нитрофенилфосфата), который готовили непосредственно перед нанесением. Плашку в течение 1 часа инкубировали при 37 С в темноте, после чего добавляли раствор для остановки реакции по 50 мкл в каждую плашку. Поглощение измеряли при длине волны 405 нм.
Для определения концентрации СА125 использовали набор для иммуноферментного анализа СА125 EIA (CanAg, Канада). Лунки промывали промывочным буфером, затем добавляли по 25 мкл калибровочных растворов и проб сыворотки и по 100 мкл антител, конъюгированных с биотином, и 2 часа инкубировали на шейкере при комнатной температуре. После этого лунки три раза промывали промывочным буфером и добавляли раствор антител, конъюгированных с ферментом. Инкубировали 1 час на шейкере и промывали 6 раз. После этого добавляли раствор субстрата и инкубировали при комнатной температуре на шейкере 30 минут. По завершении инкубации реакцию останавливали (добавляли раствор для остановки реакции и перемешивали 1 минуту) и измеряли поглощение при длине волны 405 нм.
Профилирование сывороток с применением SELDIOF Для оптимизации условий профилирования были использованы различные типы белковых чипов: NP20 (нормальнофазовые), SAX2 (сильные анионообменники), WCX (слабые катионообменники), Н4 (обращеннофазовые) (Ciphergen Biosystems, США). Наилучшие спектры были получены при использовании чипов NP20.
Сыворотку разводили в 2 - 5 раз 50 мМ Tris HCI с рН 7-9, содержащем 0,02% Triton Х-100. Пятна на чипе обводили гидрофобной ручкой, затем наносили по 10 мкл указанного выше буфера. Инкубировали в течение 5 минут во влажной камере при комнатной температуре, затем процедуру повторяли еще 2 раза. Затем наносили по 3 мкл разведенной пробы на каждое пятно и инкубировали во влажной камере в течение получаса. Затем пятна на чипе промывали 5 раз буфером и дважды деионизованной водой и высушивали на воздухе.
Сыворотку разводили в 2 - 5 раз 50 мМ ацетатом аммония рН 4-6, содержащем 0,02% тритона Х-100 и наносили по 3 мл на слабый катионообменный чип СМИ0, предварительно активированный 10 мМ HCI и уравновешенный указанным выше буфером, и инкубировали 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. Затем пятна на чипе промывали 5 раз буфером и дважды деионизованной водой, после чего высушивали на воздухе.
Пятна на чипе перед началом процедуры обводили гидрофобной ручкой, затем наносили по 5 мкл 40-60% ацетонитрила. Использовали раствор с тем же процентом содержания ацетонитрила, что и раствор для связывания/промывания. Затем наносили по 3 мкл сыворотки, разведенной в 5 раз 40-60% ацетонитрилом и инкубировали в течение 20 минут во влажной камере. Затем трижды промывали каждое пятно тем же раствором ацетонитрила, высушивали и наносили раствор матрицы.
Определение концентрации белка A-SAA в сыворотках методом иммуноферментного анализа
Среди дискриминаторных пиков присутствуют пики, соответствующие нативной и цистеинилированной формам транстиретина, причем пик цистеинилированной формы был отобран всеми четырьмя классификаторами. Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными, согласно которым обе упомятые формы TTR имеют при раке яичника пониженную концентрацию [Fung et аі, 2005; Kozak et al, 2005]. Пик 17017 Да, согласно результатам кластерного анализа, объединен в один кластер с немодифицированной и цистеинилированной формами транстиретина, поэтому, по-видимому, тоже соответствует форме TTR.
Одним из маркерных пиков, отобранных методом опорных векторов, является пик 6441 Да, соответствующий аполипопротеину CI с отщепленными N-концевыми треонином и пролином. Этот белок был идентифицирован, наряду с полноразмерным аполипопротеином СІ, в качестве биомаркера рака толстой кишки [Ward et al, 2006].
Природа двух маркерных пиков, 10265 и 12168 Да, выявленных одновременно всеми четырьмя использованными методами, осталась невыясненной. В то же время то, что они были выявлены несколькими независимыми методами говорит о том, что они имеют биологический смысл и не являются артефактами.
Хотя, как было рассмотрено выше, добавление данных о концентрации А SAA к данным ИФА о концентрации СА125 не привело к повышению точности диагностики, среди дискриминаторных масс-спектрометрических пиков присутствуют несколько форм A-SAA. По-видимому, наличие данных о соотношении различных модификаций биомаркеров вносит вклад в повышение эффективности диагностики. Выше были рассмотрены примеры исследований, в которых показано, что анализ модификаций путем совмещения иммунных и масс-спектрометрических методов приводит к существенному улучшению диагностики [Fung et al, 2005; Song et al, 2006]. Яркой иллюстрацией того, как анализ модификаций влияет на возможность отличить рак от контроля, служит исследование злокачественной В-клеточной лимфомы [Miguet et al, 2006]. Было показано, что среди дискриминаторных пиков присутствуют пики с M/Z 13766,13876 и 13848, причем первые 2 имеют в среднем пониженную интенсивность у больных злокачественной лимфомой, а последний, наоборот, повышенную интенсивность по сравнению с контролем. Белки, соответствующие этим 3 пикам, были выделены и идентифицированы как разные формы транстиретина (13766 - нативный транстиретин, 13876 - цистеинилированный и 13848 - сульфитированный транстиретин). Несмотря на явные различия в рисунке модификаций между раком и нормой, уровень транстиретина, измеренный с помощью иммуноферментного анализа, практически не различался между указанными группами.
Результаты проведенного исследования доказывают, что используя масс-спектрометрическую технологию SELDIOF, можно с достаточно высокой эффективностью распознавать раковые сыворотки и сыворотки здоровых или больных доброкачественными гинекологическими опухолями женщин.
Основой разработанной экспериментальной диагностической системы являются масс-спектрометрические данные, использование которых в отдельности позволило получить точность диагностики около 90%. Добавление к масс-спектрометрическим данным данных иммуноферментного анализа о концентрации СА125 и SAA привело к повышению точности диагностики до 95%. Наилучшие результаты были достигнуты при применении метода опорных векторов. Попытки объединения данных масс-спектрометрии SELDIOF и данных о концентрации СА125 предпринимались ранее Zhang с соавторами, однако они не привели к повышению точности диагностики [Zhang et al, 2004].
Большим преимуществом предложенного нами метода профилирования является его простота. Отсутствие стадий префракционирования сыворотки приводит к повышению воспроизводимости результатов и увеличивает шансы на внедрение методики в практическую диагностику.
В мировой практике использования SELDIOF есть тенденция к усложнению стадии предобработки сыворотки или плазмы перед масс-спектрометрическим профилированием. Стадия предобработки часто включает в себя очистку сыворотки от мажорных белков [Kozak et al, 2005; Chen et al, 2007], хроматографическое префракционирование сыворотки [Zhang et al, 2004; Ward et al, 2006]. В то же время, существенного увеличения чувствительности масс-спектрометрии SELDIOF не наблюдается, и набор идентифицированных белков ограничивается мажорными компонентами сыворотки. Значительная часть описанных компонентов масс-спектрометрических профилей были детектированы нами на масс-спектрах, полученных с использованием предельно упрощенной процедуры получения спектров. Панель выявленных маркерных пиков сопоставима с предложенными другими исследовательскими группами [Zhang et al, 2004; Kozak et al, 2005].
Полученные результаты могут служить предпосылками для внедрения в перспективе в медицинскую практику нового способа диагностики рака яичников.
1. Предел чувствительности масс-спектрометрической детекции белка А-SAA в сыворотке крови составляет 0,2-0,3 г/л (1,7-2,6 х 10"5 М).
2. На выборке из российского населения показана применимость метода масс-спектрометрии SELDIOF для классификации сывороток больных раком яичника, доброкачественными гинекологическими опухолями и здоровых женщин. Наиболее высокая точность диагностики была получена при применении к масс-спектрометрическим данным метода опорных векторов и составила 89,5 %.
3. Добавление к масс-спектрометрическим данным данных иммуноферментного анализа о концентрации СА125 и A-SAA привело к повышению точности диагностики до 95%.
4. На основе результатов кластерного анализа масс-спектрометрических данных и анализа литературных данных часть пиков на масс-спектре аннотирована. Показано, что несколько дискриминаторных масс спектрометрических пиков соответствуют сывороточному амилоиду А острой фазы, транстиретину и их модификациям
