Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Бактериальные аспарагиназы и их свойства 11
1.1.1. Распространение и противоопухолевая активность 11
1.1.2. Механизм ферментативной реакции 14
1.1.3. Физико-химическая характеристика бактериальных L-аспарагиназ 18
1.1.4. Свойства терапевтически значимых L-аспарагиназ 22
1.2. Бактериальные аспарагиназы как противоопухолевые препараты, проблемы и перспективы их применения 25
1.3. Модификация белков полиэтилен гликолем 28
1.3.1. Пегилирование и его преимущества 28
1.3.2.Структура и свойства полиэтилен гликоля 29
1.3.3. Биохимия пегилирования 31
1.3.4. Производные полиэтиленгликоля, применяемые для модификации белков 34
1.3.5. Влияние пегилирования на фармакокинетические и фармакодинамические свойства белка 40
2. Материалы и методы 44
2.1. Экспрессия рекомбинантной L-аспарагиназы и ее выделение 44
2.1.1. Культивирование штамм а-продуцента и экспрессия фермента 44
2.1.2. Очистка и выделение L-аспарагиназы 45
2.2. Физико-химическая и кинетическая характеристика белка 47
2.2.1 .Электрофорез в ПААГ/ДСН геле 47
2.2.2. Изоэлектрофокусирование 47
2.2.3. Определение аспарагиназной активности 47
2.2.4.0пределение концентрации белка 48
2.2.5. Определение кинетических параметров аспарагиназы 48
2.3. Модификация аспарагиназы производными полиэтиленгликоля 49
2,3.1.Модификация белка 2,4-бис (о-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-э-триазином 49
2.3.2. Модификация аспарагиназы метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонатом 50
2.3.3. Масс-сп ектрометри чес кий анализ 50
2.4. Определение цитотоксическои активности аспарагиназы in vitro 51
2.5. Определение иммуногенности аспарагиназы 52
2.5.1. Получение специфических поликлональных антител 52
2.5.2. Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) 52
3.Результаты и обсуждение 54
3.1. Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora 54
3.2. Подбор модифицирующего реагента 58
3.2.1. Получение 2,4-бис (О-метоксиполиэтиленгликоль) -б-хлор-Б-триазина 58
3.2.2. Получение метоксиполиэтиленгликоль- п-нитрофенилкарбоната 61
3.3. Получение пегилированнои рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora и оптимизация процесса модификации 62
3.4. Физико-химическая и кинетическая характеристика модифицированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora 71
3.5. Стабильность модифицированного фермента 77
3.7. Оценка цитотоксической активности ПЭГ-аспарагиназы in vitro 83
3.6. Характеристика иммуногенности пегилированнои L-аспарагиназы Erwinia carotovora 87
4. Выводы 89
5.Литература 90
- Механизм ферментативной реакции
- Производные полиэтиленгликоля, применяемые для модификации белков
- Очистка и выделение L-аспарагиназы
- Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora
Введение к работе
Биологические катализаторы, каковыми являются ферменты, обладают чрезвычайно высокой специфичностью и мощным каталитическим воздействием на различные стороны метаболизма в организме. Поэтому они представляют собой уникальные лекарственные средства, используемые в медицине для лечения заболеваний различной этиологии [43,34].
Бактериальная L-аспарагиназа (L-аспарагинамидогидролаза КФ 3.5.1.1), являющаяся представителем ферментов класса треониновых амидо-гидролаз, катализирует превращение L-аспарагина до L-аспарагиновой кислоты и аммиака. Длительное время бактериальные аспарагиназы применяются в онкологической практике при комбинированной химиотерапии различных видов лейкозов. В последние годы появились сообщения о положительном эффекте аспарагиназы при лечении болезни Ходжкина, хронической лимфоцитарной лейкемии и меланосаркомы [78,53,89].
Механизм противоопухолевого действия аспарагиназы заключается в расщеплении аминокислоты аспарагин, находящейся во внеклеточном пространстве. Для опухолевых лимфобластов аспарагин является незаменимой аминокислотой, без поступления которой в клетку извне нарушается синтез белков и клетка становится неспособной к дальнейшему делению. Таким образом, реализация цитотоксичности аспарагиназы не подразумевает контакта или проникновения активного вещества в опухолевую клетку, что принципиально отличает этот фермент по механизму действия от других ци-тостатиков [121].
Сниженная или полностью отсутствующая активность аспарагинсин-тетазы - фермента, синтезирующего L-аспарагин, является отличительной чертой не только лейкемическнх лимфобластов, но и миелобластов, и целого ряда клеток других опухолей. Большинство здоровых, в том числе гемо-поэтических, клеток способно синтезировать собственный аспарагин. Это определяет вторую, крайне важную характеристику фермента, а именно минимальное миелотоксическое действие.
Целый ряд аспарагиназ из различных бактериальных штаммов обладает противоопухолевым действием. Так проти вол ейкозную активность проявляют L-аспарагиназы Escherichia coli, Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Vibrio succinogenes, Proteus vulgaris и некоторые другие. Однако использование препаратов аспарагиназы в противоопухолевой терапии ограничено различными побочными эффектами, поэтому только два наименее токсичных фермента, а именно L-аспарагиназы из Esherichia coli (ЕсА2) и Erwinia chrysanthemi (ErA), нашли применение в онкотерапии [25]. Причем, наименее токсичными признаны препараты, полученные из Erwinia chrysanthemi, что указывает на важность исследования аспарагиназ рода Erwinia. Тем не менее, даже аспарагиназы штаммов Erwinia вызывают развитие иммунологической гиперчувствительности к L-аспарагиназе, проявляющееся в диапазоне от слабых аллергических реакций до анафилактического шока [72]. Помимо этого, эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой терапии ограничена довольно низкой стабильностью фермента в физиологических условиях.
Таким образом, актуальным является получение модифицированных форм L-аспарагиназ штаммов Erwinia устойчивых к протеолитической деградации в крови, обладающих низкой иммунологической активностью при сохранении высокой ферментативной активности.
В настоящее время существует ряд различных методов модификации терапевтически значимых ферментов. Одним из наиболее эффективных является химическая модификация белка полиэтиленгликолем (ПЭГ), т.н. пегилирование [97]. Она заключается в физико-химической трансформации, достигаемой соединением нативной молекулы белка с ПЭГ. Применение этого метода позволяет значительно повысить терапевтическую эффективность фармакологических препаратов пептидной структуры.
Цель и задачи исследования
Цель работы состояла в получении модифицированной полиэтиленгликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora, обладающей повышенной стабильностью и пониженной иммуногенностью.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. модификация полиэтиленгликолем L-аспарагиназы Env. carotovora и оптимизация процесса пегилирования;
2. детальная характеристика физико-химических свойств пегилированной L-аспарагиназы Env. carotovora (pi, каталитические параметры, термодинамическая стабильность);
3. определение цитотоксичности пегилированной аспарагиназы на чувствительных к ней клетках лейкоза человека;
4. оценка иммуногенности модифицированной полиэтиленгликолем аспарагиназы Env. carotovora.
Научная новизна работы
Впервые в качестве объекта для получения пегилированной формы аспарагиназы использован генно-инженерный фермент Erw. carotovora, на основе которого в настоящее время в лаборатории медицинской биотехнологии ГУ НИИ БМХ РАМН проводятся работы по созданию отечественного лекарственного препарата рекомбинантной аспарагиназы.
В настоящем исследовании впервые разработана и оптимизирована методика модификации полиэтиленгликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Erw. carotovora. Получены экспериментальные данные для пегилированной формы рекомбинантной аспарагиназы Erw. carotovora о ее физико-химических и каталитических свойствах, иммуногенности и цитотоксичес-ком действии на опухолевые клетки различных линий.
Показано, что модифицированная аспарагиназа оказывает более выраженное цитотоксическое действие на опухолевые клетки лимфобластной Т-клеточной лимфомы и лимфомы Беркитта по сравнению с нативным фер ментом. Выявлено возрастание устойчивости пегилированной аспарагиназы к протеолизу и повышение термостабильности по сравнению с исходным белком. Установлено, что пегилированная форма рекомбинантной L-acnapa-гиназы Erw. carotovora обладает пониженной иммуногенностью.
Практическая значимость исследования
В настоящее время в клинической практике используется лишь единственный пегилированный препарат бактериальной аспарагиназы - «Онкас-пар», получаемый на основе фермента Е. colt Наличие нескольких препаратов аспарагиназ со сниженной иммуногенностью позволит проводить заместительную терапию различных видов лейкозов у пациентов, в особенности детей, обладающих повышенной аллергенностью к существующим препаратам бактериальных аспарагиназ. В этом отношении не вызывает сомнения высокая практическая значимость получения пегилированной формы аспарагиназы Erw. carotovora.
Результаты данной работы могут быть использованы в качестве основы для создания нового лекарственного препарата пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erw. carotovora для лечения ряда форм лейкозов, и в первую очередь острого лимфобластного лейкоза.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих конференциях: II научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2005), «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006), Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярные основы и клинические проблемы резистентности к лекарственным средствам» (Киев, 2006). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов. Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 21 декабря 2006 года.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 3-х глав обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 7-й глав раздела «Результаты исследования и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 122 источника. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 4 таблицы.
Исследование выполнено на базе ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке гранта №2828 Международного научно-технического центра (США), и гранта № 06-04-49792 Российского фонда фундаментальных исследований.
Механизм ферментативной реакции
L-Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза; К.Ф. 3.5.1.1.), относящаяся к треониновым амидогидролазам, катализирует гидролитическое расщепление L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты и аммиака, и является одним из ключевых ферментов, осуществляющих взаимосвязь азотистого и углеродного обмена у про- и эукариотических организмов.
Формирование фермент-субстратного комплекса обеспечивается наличием в молекуле аспарагиназы специфического участка связывания аспа-рагина. К каталитически важным группировкам аспарагина следует отнести способные к ионизации карбоксильную группу, аминогруппу в а-положении, а также карбонильную группу в р-положении. Действительно, для аспарагиназы из Erw. carotovora показаны: 1) абсолютная необходимость наличия в аспарагине свободной карбоксильной группы для гидролиза любого его аналога; 2) важность а-аминогруппы для образования стабильного фермент субстратного комплекса; 3) снижение ферментативной активности аспарагиназы при замещении в субстрате карб оке иамидогруппы на алифатические группировки. Специфичность L-аспарагиназы к субстрату обеспечивается трехточечным связыванием. Авторы работы [44] считают, что активный центр фермента должен иметь положительно заряженный участок для связывания с карбоксилом, слабо заряженную отрицательную группировку для связывания с а-аминогруппой и третий участок, образующий водородную связь с р-карбоксилом на поверхности фермента. Есть все основания полагать, что аналогичная картина формирования фермент-субстратного комплекса имеет место и для аспарагиназ из других источников. Так, для аспарагиназы из Е, coli введение заместителя (алкиль-ной группы) в р-кар бокси амид ную группу L-аспарагина приводит к неспособности аналога связываться с активным центром фермента, введение заместителя в а-аминогруппу L-аспарагина превращает соединение в ингибитор, однако аспарагинилпептиды связываются с аспарагиназой, причем, длина пептидной цепочки коррелирует со снижением скорости гидролиза концевого аспарагина. У ряда микроорганизмов (например, Pseudomonas) аспарагиназа эффективно гидролизует как L-аспарагин, так и L-глутамин, причем, последний даже с большей скоростью, как показано для глу-таминазы-аспарагиназы из Achromobacter sp. Имеются примеры сопоставимой ферментативной активности гидролиза даже трех субстратов: L-аспарагина, L-глутамина и D-аспарагина. Вы со ко очищенная аспарагиназа из Ps. fluorescens кроме гидролиза L-аспарагина и L-глутамина с достаточно высокой скоростью дезамидирует D-аспарагин (70%), D-глутамин (100%), N-бутиласпарагин (63%) и глицил-L-acnaparHH (40%) [119]. Наличие высокой ферментативной активности белка в отношении широкого спектра субстратов указывает на его весьма гибкий активный центр, индуцирующий сте-рическое соответствие за счет координированного изменения заряда входящих в него группировок на противоположное значение, либо за счет существования в активном центре двух участков для L- и D-стереоизомеров аспарагина и глутамина с фиксированным расположением заряженных группировок.
Полностью механизм реакции пока не ясен, но тем не менее на основании результатов кинетического анализа предполагается, что в ходе ее происходит нуклеофильная атака р-амидной группы аспарагина, приводящая к образованию промежуточного комплекса р-аспартил-фермент (рис. 1). Основным вопросом в изучении механизма действия аспарагиназы является идентификация первичного нуклеофила в структуре белковой молекулы, участвующего в образовании промежуточного ацил-ферментного комплекса.
Enzyme При изучении взаимодействия аспарагиназ с химически модифицированными аналогами субстрата были получены противоречивые результаты. В одном случае аналог субстрата связывался с консервативным, присутствующим в структуре всех известных бактериальных аспарагиназ остатком Thrl2 (глутамин (аспарагин) аза Acinetobacter glutaminasificans), в другом случае аналог субстрата взаимодействовал с не являющимся консервативным остатком Serl20 (аспарагиназа Е. coli). Аминокислотные остатки фермента, входящие в его активный центр, были идентифицированы в реакции аспара-гиназы с 5-диазо-5-оксонорвалином (ДОНВ), являющимся аналогом аспара-гина. Взаимодействующий с ДОНВ остаток Thrl2 находится в пределах консервативной восьмичленной аминоконцевои последовательности аспарагиназ Erw. carotovora, Е. coli и P. vulgaris. Получены доказательства того, что ДОНВ ковалентно присоединяется к пептиду, включающему 116-121 остатки молекулы фермента.
Участок активного центра аспарагиназы Е. coli идентифицирован как фрагмент из аминокислотных остатков Serhr-Ser (117-119). Опыты по химической модификации аспарагиназы и результаты исследований с помощью ядерного магнитного резонанса указывали на важность для активности фермента остатков гистидина и одного или двух остатков тирозина [7]. Выделение кристаллических препаратов ряда бактериальных амидогидролаз и их рентгеноструктурный анализ (аспарагиназа ЕсА2, аспарагиназа Envinia chrysanthemi; глутамин (аспарагин) аза Pseudomonas 7А, глутамин (аспара-гин) аза Acinetobacter glutaminasificans), а также изучение структуры мута-нтных форм аспарагиназ, полученных методами сайт-направленного мутагенеза, позволили установить роль отдельных аминокислотных остатков в катализе и стабилизации структуры фермента.
В опытах на мутантных формах аспарагиназы ЕС-2 из Е. coli было показано, что, по меньшей мере, пять остатков аминокислот (Thrl2, Туг25, Thr89, Asp90 и Lys 162) являются крайне важными для проявления активности фермента. Palm et al, [76] получили мутантную форму аспарагиназы Е. coli, в молекуле которой остаток Thr89 был заменен на остаток Val. Анализ структуры этого белка, у которого остаток Thrl2 был ковалентентно связан с аспартатом, указывает на то, что первичным нуклеофилом является остаток Thrl2.
В опытах по сайт-специфическому мутагенезу и химической модификации Derst et al. [21] исследовали вклад пяти тирозиновых остатков аспарагиназы Е.соїі в катализ и стабилизацию структуры фермента. Установлено, что Туг25 имеет непосредственное отношение к катализу, а гидроксильные группы остатков Туг 181, Туг250, Туг289 и Туг32 являются несущественными для проявления ферментативной активности. В то же время, остатки Туг! 81 и Туг326 важны для стабилизации нативного тетрамера аспарагиназы. Этот же автор выявил позднее важную роль для специфичности действия фермента остатка Asn248, образующего водородную связь с остатком Asp90. Функциональное значение остатка Asn248, возможно, состоит в стабилизации конфор-мации активного центра фермента за счет нейтрализации отрицательного заряда нескольких расположенных рядом остатков дикарбоновых аминокислот (Asp60, Asp90 и Glu283).
Производные полиэтиленгликоля, применяемые для модификации белков
Более низкая реакционная способность остающегося хлора вызывает избирательную модификацию остатков лизина и цистеина без дальнейших побочных реакций.
Другим алкилирующим реагентом, использующимся для неспецифического модифицирования различных аминогрупп, образующих вторичную амидную связь с белками, вирусами и липосомами является ПЭГ-трезилат (рис, 7)- Несмотря на то, что он более специфичен к реакциям с аминогруппами, по сравнению с предыдущим производным, получаемые в результате реакции с ПЭГ-трезилатом продукты конъюгирования неоднородны и их состав не вполне определенный. Например, Gais et al.[33] установил, что конюгирование ПЭГ-трезилата с маленькими молекулами аминов может давать продукты, содержащие разрушенную сульфамидную связь. Поэтому, полученная в результате присоединения ПЭГ-трезилата к белку гетерогенная смесь может содержать набор конъюгатов с разрушенными связями. Ацилирующие производные ПЭГ Большинство из применяемых производных полиэтиленгликоля образуют конъюгаты реакцией ацилирования.
Два широко использовавшихся ранее активированных мПЭГ это -сукцинимидил карбонат (SC-PEG) и бензотриазол карбонат (BTC-PEG) (рис. 7) [104,67,24]- Эти производные реагируют преимущественно с остатками Lys и образуют карбаматную связь, но также известно, что они реагируют и с остатками гистидина и тирозина. SC-PEG немного более устойчив к гидролизу, чем BTC-PEG с периодом полужизни 20,4 мин при рН 8,0 и 25 С по сравнению с 13,5 мин у BTC-PEG при тех же условиях [85]. Недавно было замечено, что SC-PEG и BTC-PEG соединяются с радикалами гистидина в молекуле интерферона в слабокислых условиях и формируют гидролитически нестабильную им ид азол карбаматную связь. Слабая связь является существенным недостатком, потому что полученное таким образом соединение протеина с полимером будет нестабильным.
Следующее ПЭГ-производное - сукцинимидил сукцинат, (SS-PEG, рис. 7) получают реакцией мПЭГ с янтарным ангидридом, с последующим активированием карбоксикислоты до сукцинимидилового эфира [1]. Основная цепь полимера содержит двойную эфирную связь, которая сохраняется после реакции конъюгирования с белком. Эта связь высоко восприимчива к гидролизу, последующему за присоединением полимера к белку. Мало того, что гидролиз ведет к потере преимуществ, полученных в результате присоединения ПЭГ, но и фрагменты сукцината, которые остаются на белке после гидролиза могут действовать как гаптен и привести к иммуногенности остающегося белка [15].
Другими ПЭГ-ацилирующими реагентами, образующими протеины с карбаматной связью, являются: п-нитрофенилкарбонат (pNPC-PEG), три- хлорфенилкарбонат (TCP-PEG) и карбонилимидазол (CDI-PEG) [94,9], Эти реагенты получают реакцией хлороформатов или карбонилимидазола с концевой гидроксильной группой на мПЭГ, и они имеют более низкую реакционную способность, чем SC-PEG или BTC-PEG.
Как правило, чем медленнее протекает реакция, тем более специфичен реагент к определенным аминокислотным группам белка- Таким образом, достигается некоторая избирательность в конъюгировании. Интересен тот факт, что в отличие от бесцветного трихлорфенилкарбоната, п-нитро-фенилкарбонат имеет бледно-желтое окрашивание, интенсивность которого возрастает во время пегилирования, вследствие образования уходящей фенольной группы. Исходя из вышесказанного, степень и интенсивность модификации белка в случае с pNPC-PEG могут быть легко отслежены по отщеплению п-нитрофенольной группы с помощью колориметрического анализа.
Изменения фармакокинетических и фармакодинамических свойств ПЭГ-модифицированных пептидов зависят как от массы молекулы ПЭГ, так и от специфических мест связывания. Так, например, продемонстрирована прямая корреляция между массой молекулы ПЭГ и периодом полужизни собственно пептида [40]. В таблице 2 приведены сравнительные данные периода полужизни некоторых биологически активных нативных пептидов и их ПЭГ-коньюгатов.
В основном, более длинные цепи ПЭГ обуславливают большую продолжительность периода полужизни коньюгата «ПЭГ-пептид» и его фармакологическую стабильность. Еще одним важным фактором, влияющим на фармакодинамику и фармакокинетику ПЭГ-модифицированных пептидов, является структура ПЭГ-цепочек: разветвленная молекула ПЭГ формирует замедление активного метаболизма препарата, что также влечет за собой уд- линение времени активной циркуляции препарата.ІС разветвленной структурой цепочек ПЭГ связана также и значительно меньшая иммуногенность модифицированных препаратов при сохранении их основных фармакологических свойств.
Подобные эффекты могут быть достигнуты и другим путем - связыванием пептида, например, не одной, а несколькими молекулами полиэти-ленгликоля, имеющими при этом линейную структуру цепочек, В таблице 3 приведены данные о ПЭГ-модифицированных соединениях пептидной структуры, разрешенных FDA как к практическому применению в медицинской практике, так и в продолжающихся клинических испытаниях.
Как следует из таблицы, современные технологии пегилирования биологически активных пептидных молекул привели к значительному расширению области их настоящего и будущего практического применения.
Очистка и выделение L-аспарагиназы
На начальном этапе работы необходимо было получить препарат нативной аспарагиназы в количестве достаточном для проведения последующей модификации фермента полиэтиленгликолем и определения стабильности и цитотоксичности препаратов пегилированного белка.
При культивировании экспрессионного штамма для индукции синтеза рекомбинантной аспарагиназы использовали ИПТГ. Уровень экспрессии целевого белка составлял 30-40 МЕ/мл культуры, что свидетельствует о высокой продуктивности фермента. Наибольшие потери фермента происходят на начальной стадии получения бесклеточного экстракта. В работе [60] применялась обработка биомассы ацетоном для повышения проницаемости клеточной стенки. При этом выход аспарагиназы составлял только 56%. Кроме того, в данном случае требовались повторные процедуры фильтрации и центрифугирования для удаления субклеточных частиц. Наиболее привлекательный для широкомасштабного выделения аспарагиназы щелочной лизис биомассы, примененный для выделения рекомбинантной ЕгА из 400 литров культуры Erw. chrysanthemi D2T/4 и позволяющий экстрагировать до 90% фермента [36], согласно работе [57] также оказался не эффективным. Поэтому для получения бесклеточного экстракта, было решено использовать ультразвуковую обработку.
Результаты очистки фермента представлены в таблице 4. Аспараги-назная активность в бесклеточном экстракте составляла 29,8 МЕ/мг, что соответствует 7-8% активного фермента от общего количества белка. При последующем центрифугировании, вероятно, вследствие адсорбции L-аспарагиназы осадком разрушенных клеток, терялось 15-20% ферментативной активности, однако, на этой стадии происходило и удаление почти 50% балластных белков. Таким образом, выход фермента был достаточно высоким (более 80%).
Нанесение растворимой фракции бесклеточного субстрата на SP-Сефарозу при рН 5,5 позволило избавиться от основной массы балластных белков. Значение изоэлектрической точки рекомбинантной аспарагнназы, равно 8,5, что соответствует pi фермента из дикого штамма Erw. carotovora (8,5-8,7 [119]), поэтому более 95% аспарагнназы Erw. carotovora, нанесенной на сильный катионообменник SP-Сефарозу при рН 5,5, связывается с сорбентом, а большинство белков Е. coli, имеющих рі в кислой области рН, обнаруживается в элюате (рис. 10, треки 2 и 3). После промывки сорбента низкосолевым фосфатным буфером с рН 5,5 аспарагиназу элюировали линейным градиентом КС1. В некоторых случаях сорбент промывали низкосолевым фосфатным буфером с рН 6,3, а белок элюировали тем же раствором при рН 7,0. Использование однокомпонентного элюата вместо градиента концентрации соли исключало необходимость дальнейшего обессоливания и концентрирования белка, а также позволяло значительно облегчить процесс выделения рекомбинантной аспарагнназы.
После хроматографической стадии очистки удельная активность фермента составляла 390 МЕ/мг, что в 13,1 раз превышает значение исходной активности. Из приведенных в литературе данных значения активности аспарагнназы дикого штамма Erwinia carotovora варьируют в диапазоне от 300 МЕ/мг [60] до 550 МЕ/мг [13]. Это связано с тем, что концентрация фермента существенно зависит от применяемого метода определения концентрации белка [57].
В данной работе, в качестве наиболее адекватного способа определения концентрации белка для аспарагиназ штаммов Erwinia, мы использовали метод Лоури-Фолина [42]. Помимо этого метода, концентрацию аспарагнназы определяли через коэффициент экстинкции. В обоих случаях данные расходились не более чем на 5-7%.
На заключительном этапе выделения препарат L-аспарагиназы необходимо было обессолить и сконцентрировать. Для концентрирования белка идеально подходит метод с использованием ультрафильтрационных мембран. При его применении можно не только успешно проводить процедуру концентрирования аспарагиназы и замены буфера, но и одновременно освобождаться от низкомолекулярных примесных белков. После концентрирования объединенных фракций фермента, как это описано в п. 2.1.2. аспарагиназная активность практически не изменялась. Проблема обес-соливания и одновременно смены буфера для лиофилизации была успешно решена путем гель-фильтрации концентрированного образца на колонках PD10 с Сефадекс G-25. Электрофоретическая картина образцов, после гель-фильтрации мало отличалась от таковой после ионообменной хроматографии. При электрофоретическом анализе очищенного препарата аспарагиназы в 12,5%-ном поли акрил амид ном геле обнаруживается один главный компонент с молекулярной массой 34 кДа (рис. 10, треки 4-6), что свидетельствует о более чем 90%-ной гомогенности выделенного фермента. Также наблюдаются минорные компоненты с Mr 15 и 30 кДа (обозначены стрелками на рис. 10), которые присутствуют и в препарате аенарагиназы En-vinia chyzanihemi («Sigma») (рис. Ц), трек 7). Эти компоненты, количество которых увеличивается при длительном хранении раствора фермента, являются продуктами гидролиза аснарапша-ш, но-видамому, вследствие присутствия следовых количеств протеаз. Ингибиторы протеаз в процессе выделения не использовали, гак как они являются высокотоксичными соединениями, и их присутствие недопустимо в препарате, предназначенном дли те
Известно, что для повышения стабильности Ь-аспарагаиазьт при; хранении, к препарату добавляют различные стабилизаторы [1]. Однако, при выполнении данной работы лиофилизадню белка проводили без каких-либо добавок и через 6 месяцев хранения при -20С препарат сохранял 85% от исходной активности. Причиной настолько эффективного хранения фермента является его высокая степень очистки, а также оптимально подобранные условия для лиофшгйзаши.
Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora
Для клеток MOLT-4 величина LGJO оказалась равной 1,1 МЕ/мл для ECAR_LANS и 0,8 МЕ/мл для PEG-ECAR_LANS. Другими словами, значение LC50 пегилированнои аспарагиназы для этих клеточных линий примерно на треть ниже по сравнению с LC5o исходного фермента.
Очевидно, что модификация аспарагиназы, привела к повышению ци тотоксическои активности аспарагиназы, что можно объяснить повышением ее стабильности по отношению к действию клеточных протеаз. Присоединение молекул ПЭГ приводит к увеличению длительности периода полувыведения и повышению возможности взаимодействия пегилированного препарата аспарагиназы и развития биологического эффекта.
Важной характеристикой терапевтически значимых ферментов является отсутствие у них токсичности в отношении нормальных (не опухолевых) клеток человека. Для оценки данного свойства пегилированного белка, протестировали влияние PEG-ECAR_LANS на клеточный рост эмбриональных фибробластов человека (ЭФЧ).
Как видно из рис, 34 рост ЭФЧ в присутствии нативного и пегили-рованного белка практически не изменяется, выживаемость клеток не менее 90-95%. Таким образом, установлено, что полученный фермент, также как и нативный, не является токсичным для нормальных клеток в биологических концентрациях.
Одним из основных преимуществ белков, модифицированных с помощью производных полиэтиленгликоля, перед нативными ферментами является их пониженная иммуногенность. Это объясняется тем, что конъю-гирование с ПЭГ маскирует поверхность фермента и увеличивает молекулярный размер полипептида, и тем самым, предотвращает приближение антител или антителпродуцирующих клеток.
На заключительном этапе работы был проведен сравнительный анализ иммуногенности препаратов нативной и модифицированной аспарагиназ. С этой целью необходимо было определить титр антител, полученных согласно подобранной схеме иммунизации [98],
В качестве схемы иммунизации выбрали цикл инъекций аспарагиназы, применяемый для оценки противоопухолевой активности фермента на одной из линий перевиваемых опухолей мышей (лимфаденоз L 5I78Y) [109]. Животных иммунизировали, как это описано в пункте 2.5Л, с помощью внутрибрюшинных инъекций антигена в дозе 25 мкг ежедневно в течение 10 дней, В эксперименте было 3 группы животных: по 5 мышей на нативную и модифицированную аспарагиназы, и 3 мыши в контрольной группе. На 10-е сутки мышей декапитировали и отбирали пробы крови. Полученный пул антисывороток использовали для постановки прямого твердофазного ИФА. Определение титра антиаспарагиназных антител в антисыворотках проводили с помощью ИФА как это описано в пункте 2,5-2, За титр принимали точку перегиба кривой, полученной аппроксимацией данных нескольких независимых экспериментов полиномом 5-й степени,
В результате опытов установлено, что титры антисывороток составляли 128 - для ECAR LANS и 16 - для PEG-ECAR_LANS (рис. 35). Таким образом, пегилирование рекомбинантной аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообразования. Подобный эффект модификации на выработку антител описан во многих работах (Kamisaki et ah, 1981; Kawamuraet al., 1985).
Таким образом, пегилирование рекомбинантной аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообразования, что является хорошим результатом. Подобный эффект модификации на выработку антител описан во многих работах [47,48]. Можно сделать вывод о том, что применение пегилироваиной аспарагиназы будет более предпочтительно в связи с ее в значительной степени уменьшенной иммуногенностью. 4, Выводы 1, Впервые получена модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинантная аспарагиназа Erw, carotovora. Разработанный метод пегилирования с использованием в качестве модифицирующего реагента метоксиполиэтиленгликоль-л-нитрофенилкарбоната с молекулярной массой 5000 позволяет сохранить около 80% активности модифицированного фермента. 2, Установлено, что пегилированная аспарагиназа обладает более высокой стабильностью к протеолизу под действием трипсина и трип-синоподобных протеаз плазмы крови, а также к воздействию температуры по сравнению с нативным ферментом. 3, В опытах in vitro показано, что модифицированная рекомбинантная аспарагиназа Erw.caroiovora проявляет более высокую противоопухолевую активность в отношении клеток линий MOLT-4 и Raji, по сравнению с нативным ферментом. Значение LC50 пегилированнои аспарагиназы для этих клеточных линий примерно на треть ниже LC5o немодифицированного фермента, 4, В опытах на лабораторных животных установлено, что препарат пегилированнои аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообразования по сравнению с нативным ферментом и, таким образом, обладает пониженной иммуногенностью. 5, Полученные в ходе изучения пегилированнои рекомбинантной аспарагиназы Erwinia carotovora результаты - повышение устойчивости к протеолизу и температурному воздействию, снижение иммуногенности и высокая противоопухолевая активность позволяют рассматривать модифицированный фермент в качестве перспективной основы для создания лекарственного препарата, более эффективного по сравнению с нативной аспарагиназой.
