Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Патохимические аспекты формирования повреждения сердца при сахарном диабете 2 типа 13
1.2. Кардиотропные метаболические эффекты хронической алкогольной интоксикации 25
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Объект и дизайн клинического раздела исследования 40
2.1.1. Формирование групп обследуемых 41
2.1.2. Сведения о группе клинически здоровых лиц 41
2.1.3. Сведения о группах больных сахарным диабетом 2 типа 42
2.1.4. Сведения о группе больных хроническим алкоголизмом 43
2.2. Экспериментальные объекты и модели 44
2.2.1. Моделирование экспериментального сахарного диабета 45
2.2.2. Моделирование хронической алкогольной интоксикации, сочетания сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Характеристика экспериментальных групп 45
2.2.3. Протокол взятия экспериментального биоматериала 47
2.3. Методы исследования
2.3.1. Метод выявления признаков злоупотребления алкоголем 49
2.3.2. Методы биохимического исследования
2.3.2.1. Методы определения содержания метаболитов 54
2.3.2.2. Методы определения активности ферментов
2.3.3. Хемилюминесцентный анализ 61
2.3.4. Методы статистического анализа 62
Клинический раздел 63
Глава 3. Биохимические критерии и показатели активности повреждения миокарда у больных сахарным диабетом 2 типа, имеющих признаки хронического злоупотребления алкоголем 63
Глава 4. Качество гликемического контроля и липидный спектр плазмы крови при сахарном диабете 2 типа у пациентов с симптомами
Хронического злоупотребления алкоголем 71
Глава 5. Интенсивность процессов свободнорадикального окисления у больных сахарным диабетом 2 типа, имеющих признаки хронического злоупотребления алкоголем 77
Экспериментальный раздел 83
Глава 6. Уровень маркеров миокардиодеструкции и острофазового ответа при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической интоксикации алкоголем 84
Глава 7. Характеристика гликеии и содержания свободных жирных кислот в плазме крови при хронической алкогольной интоксикации в условиях экспериментального сахарного диабета 94
Глава 8. Активность свободнорадикальных и антиокислительных процессов при сочетании экспериментального сахарного диабета с хронической интоксикацией этанолом 101
Глава 9. Анализ содержания конечных стабильных производных оксида азота (ii) и активности каспазы-3 в сердце при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикаци 119
Глава 10. Обсуждение полученных результатов 127
10.1. Биохимическая характеристика формирования повреждения миокарда у больных сахарным диабетом 2 типа с признаками хронического злоупотребления алкоголем 127
10.2. Молекулярные аспекты реализации деструктивных процессов в сердце при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации 137
Список используемых сокращений 162
Список литературы
- Кардиотропные метаболические эффекты хронической алкогольной интоксикации
- Сведения о группе больных хроническим алкоголизмом
- Уровень маркеров миокардиодеструкции и острофазового ответа при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической интоксикации алкоголем
- Биохимическая характеристика формирования повреждения миокарда у больных сахарным диабетом 2 типа с признаками хронического злоупотребления алкоголем
Введение к работе
Актуальность исследования
Медико-социальная значимость исследуемой проблемы во многом обусловлена значительным уровнем инвалидности и смертности вследствие развития поздних осложнений сахарного диабета 2 типа, которым страдает в пределах 3% населения Российской Федерации (А. Г. Обрезан, 2008). Сердечно-сосудистая патология лидирует среди осложнений сахарного диабета 2 типа практически во всех странах мира (D. J. Betteridge, 2001). Нарушения липопротеинового спектра крови в комплексе с провоспалительной иммунологической перестройкой при сахарном диабете способствуют атерогенезу в коронарных сосудах и последующему развитию ишемических поражений (И. И. Дедов, 2004). Некоронарогенный механизм повреждения миокарда при сахарном диабете типа 2 связан с явлениями глюкозотоксичности и липотоксичности, а также с развитием окислительного стресса на фоне дефицита энергии и антиокислительных механизмов защиты сердца (M. Aragno, 2006). Инактивация оксида азота вследствие образования при гиперпродукции активных форм кислорода приводит к дефициту вазодилятации (J. E. Wright, 2006), способствует ишемии миокарда и является важным звеном механизма повреждения сердца при сахарном диабете (Y. Xia, 2007).
Сахарный диабет 2 типа нередко сочетается с другими заболеваниями, также способствующими поражению сердечно-сосудистой системы (Т. Melchior, 2000), что является фактором прогредиентности кардиальных осложнений и увеличивает риск развития сосудистых катастроф. С высокой частотой в формировании широкого круга подобной коморбидной патологии принимают участие различные аддиктивные состояния, среди которых по распространенности лидирует злоупотребление алкоголем (В. Я. Cемке, 2008). Хроническая алкогольная интоксикация сопутствует сахарному диабету 2 типа, по крайней мере, у 8,3% больных (П. И. Сидоров, 2002). Это сочетание повышает вероятность возникновения и способствует прогрессированию сосудистых осложнений сахарного диабета, а при длительном употреблении высоких доз алкоголя – ассоциировано с увеличением смертности вследствие сердечно-сосудистых нарушений (P. Diem, 2003). Наряду с прямыми повреждающими эффектами алкоголя, процессы и продукты его биотрансформации способствуют развитию окислительного стресса в кардиомиоцитах (V. R. Preedy, 1999) с реализацией цитоксического действия на уровне модификации биомолекул, мебранотропных эффектов и вмешательства в работу сигнальных механизмов, включая NO-зависимые каскады (X. Deng, 2007).
Биохимические аспекты развития структурных нарушений при алкогольном и диабетическом поражении сердца, как следует из анализа литературных данных, имеют некоторые общие черты. Тем не менее, не определены молекулярные механизмы и последствия влияния на сердце хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете 2 типа.
Цель исследования
Установить патохимические механизмы формирования повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать патохимические признаки повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа и хронической интоксикации алкоголем.
-
Проанализировать уровень белков острофазового ответа, как возможных показателей активности течения кардиальной патологии при сахарном диабете 2 типа в сочетании с хронической алкогольной интоксикацией.
-
Исследовать воздействие хронической алкогольной интоксикации на качество гликемического контроля и липидный спектр крови при сахарном диабете 2 типа.
-
Изучить влияние хронической алкогольной интоксикации на антирадикальную и антиперекисную защиту в сердце при сахарном диабете 2 типа.
-
Определить интенсивность процессов липопероксидации и окислительной модификации протеинов как факторов повреждения миокарда при сахарном диабете 2 типа на фоне хронической алкогольной интоксикации.
-
Исследовать значение оксида азота (II) в развитии миокардиодеструкции при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической интоксикацией алкоголем.
-
Выяснить роль процессов апоптоза и некроза в формировании повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.
-
Оценить наличие особенностей патохимических механизмов и последствий кардиотропного влияния хронической алкогольной интоксикации на различных этапах развития сахарного диабета.
Научная новизна
В результате проведенных исследований, впервые, на основе применения современных методов, получены сведения о характере патохимических нарушений в сердце и системных метаболических сдвигах при сочетании сахарного диабета 2 типа и хронической алкогольной интоксикации. Установлено влияние хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете 2 типа на комплекс биохимических характеристик, отражающих механизмы развития кардиальных повреждений, включающий: биомаркеры повреждения миокарда и острофазовой реакции, показатели состояния углеводного, липидного и белкового обмена; параметры интенсивности свободнорадикальных процессов, антиокислительной защиты и активности апоптоза в сердце; уровень оксида азота (II). Получено клинико-экспериментальное биомаркерное подтверждение развития деструкции кардиомиоцитов при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Выявлено, что при сахарном диабете под влиянием хронической алкогольной интоксикации углубляется нарушение гликемического контроля. Обнаружено выраженное повышение содержания продуктов липопероксидации, окислительной модификации белков в крови и сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Определено, что в условиях сахарного диабета, под влиянием алкогольной интоксикации формируется существенный дефицит активности супероксиддисмутазы и каталазы в сердце. Идентифицированы проапоптотически направленные изменения в сердце в виде значительного увеличения активности каспазы-3 при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Установлено повышенное содержание конечных стабильных производных оксида азота (II) в плазме крови и сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Представлена интегральная характеристика уровня пероксид-зависимой инициации свободнорадикальных процессов в плазме крови и сердце при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Выяснено, что в зависимости от этапа развития сахарного диабета отмечаются особенности патохимических последствий влияния хронической алкогольной интоксикации и различная выраженность кардиальных повреждений.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенного исследования представляют новые знания о патохимических механизмах развития повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией и создают теоретические предпосылки для создания соответствующих методов профилактики, диагностики и терапии.
Практический интерес представляют полученные данные о некротическом характере развивающегося поражения миокарда при сахарном диабете 2 типа и хронической алкогольной интоксикации. Это свидетельствуют о целесообразности активного выявления хронического злоупотребления алкоголем среди больных сахарным диабетом 2 типа, с последующим скрининговым биомаркерным обследованием, направленным на обеспечение дальнейшей адекватной лечебно-диагностической тактики. Сведения о неблагоприятном влиянии хронической интоксикации алкоголем при сахарном диабете 2 типа на гликемический контроль и интенсивность свободнорадикальных процессов, представленные в настоящем исследовании, могут быть учтены при разработке способов патогенетически обоснованной профилактики и коррекции миокардиодеструкции у таких пациентов. Данные об отличиях в выраженности миокардиального повреждения при воздействии алкоголя на различных этапах развития сахарного диабета и о сопряжении этих различий с установленными патохимическими особенностями, могут иметь перспективное прогностическое и диагностическое значение. Фактически обоснованные выводы о взаимосвязи развивающегося повреждения сердца с гиперпродукцией оксида азота ставят вопрос о необходимости оценки возможности безопасного использования ряда лекарственных препаратов – доноров оксида азота (II) – у больных сахарным диабетом 2 типа, хронически злоупотребляющих алкоголем.
Внедрение результатов исследования
Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии Тюменской государственной медицинской академии; на кафедре биохимии и лабораторной медицины, на кафедре госпитальной терапии, а также на курсах клинической биохимии и клинической лабораторной диагностики Омской государственной медицинской академии.
Апробация работы
Материалы исследования представлены на межрегиональной научной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003), на V межрегиональной научной конференции «Актуальные вопросы наркологии» (Омск, 2003), на III конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на межрегиональной научной конференции, посвященной 85-летию Самарского государственного медицинского университета (Самара, 2005), на юбилейной научной сессии, посвященной 85-летию ОмГМА (Омск, 2006), на заседании Омского отделения общества биохимиков и молекулярных биологов РАН (Омск, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов СО РАН (Новосибирск, 2008), на заседании Омского отделения научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики России (Омск, 2009), на межрегиональной научной конференции, посвященной памяти профессора Р. И. Лифшица (Челябинск, 2009), на совместном заседании кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО; кафедры психиатрии, наркологии и клинической психологии, кафедры общей и биоорганической химии ОмГМА.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Хроническая алкогольная интоксикация при сахарном диабете типа 2 способствует развитию некротического и апоптотического повреждения кардиомиоцитов в течение алкоголизации и в послеалкоголизационном периоде.
-
Углубление нарушения качества гликемического контроля, снижение обеспечения миокарда свободными жирными кислотами, окислительный стресс и активация каспазы-3 в сердце являются важными патохимическими факторами повреждения кардиомиоцитов при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.
-
Высокое содержание оксида азота (II) и нитритивный стресс выступают ключевым звеном некротического повреждения миокарда при сочетании сахарного диабета 2 типа и злоупотребления алкоголем.
-
Выраженность повреждения и патохимических нарушений в сердце, развивающихся при сахарном диабете под влиянием хронической алкогольной интоксикации, достигает максимального уровня в условиях постинтоксикационного состояния, а в период алкоголизации – становится более значительной с увеличением продолжительности воздействия этанола.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, Из них 13 – в рецензируемых периодических изданиях по перечню ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 202 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Работа содержит 34 таблицы, 14 рисунков и 1 схему. Список цитированной литературы включает 338 источников, в том числе 51 – на русском языке.
Кардиотропные метаболические эффекты хронической алкогольной интоксикации
Сахарный диабет 2 типа является одним из главных независимых факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, которые зачастую определяют прогноз для жизни у данной категории больных [19]. Комплекс эндок-ринно-метаболических нарушений, являющихся факторами риска развития кардиоваскулярной патологии, известен под различными названиями: метаболический трисиндром (Camus J., 1966), полиметаболический синдром (Avogaro Р., 1965), синдром изобилия (Mehnert А., 1968), синдром X (Reaven G., 1988), смертельный квартет (Kaplan J., 1989), метаболический синдром (Hanefeld ML, 1991), гормональный метаболический синдром (Bjorntorp Р., 1991), синдром инсулинорезистентности (Haffher S., 1992), смертельный секстет (Enzi G., 1994), метаболический сосудистый синдром (Hanefeld М., 1997). В современной литературе эта патология определяется термином «метаболический синдром», в основе которого лежит инсулинорезистент-ность [41].
К числу важнейших причин развития метаболического синдрома относится сахарный диабет 2 типа (СД2) [41]. Сердечно-сосудистая патология занимает лидирующее место среди осложнений СД2 практически во всех станах мира и является причиной смерти более чем в 60% случаев летального исхода СД2 [60, 77, 133, 305]. У 33 % больных с хронической сердечной недостаточностью имеется СД2 [7]. Риск развития ишемической болезни сердца при СД2 в 2-4 раза выше, а риск возникновения острого инфаркта миокарда - в 6-10 раз выше, чем в общей популяции [3, 25, 306]. Причинами столь высокой заболеваемости и смертности является тот факт, что, наряду с общими для всей популяции механизмами развития коронарной патологии, у больных СД2 имеется дополнительный комплекс специфических патогенетических механизмов кардиоваскулярных повреждений, характерных только для СД2 [221]. Считается, что при СД2 создаются эндокринно-метаболические условия, которые с одной стороны повышают уровень активности факторов атерогенеза, а с другой — оказывают прямое повреждающее действие на сердечно-сосудистую систему [14, 37, 232].
Среди метаболических расстройств в кардиомиоцитах при сахарном диабете главенствующее положение занимают нарушения энергетического обмена, обусловленные абсолютной или относительной инсулиновой недостаточностью [320]. Снижается способность кардиомиоцитов захватывать и расщеплять глюкозу, в результате чего происходит переключение метаболизма с углеводного на липидный вариант (окисление жирных кислот и/или кетоновых тел) [4, 14, 76]. В экспериментах убедительно продемонстрировано снижение содержания белка-переносчика глюкозы (GLUT 1 и 4 изо-форм) и его мРНК при сахарном диабете, что объясняет соответствующее нарушение транспорта. Инсулин вызывает перемещение этих изоформ из внутриклеточного пула на клеточную мембрану, в результате чего поступление глюкозы в клетку существенно возрастает. При сахарном диабете в миокарде снижается как общее количество молекул GLUT1 и GLUT4, так и уровень их экспонирования на сарколемме [211, 286].
Вследствие уменьшения действия инсулина на жировую ткань в крови значительно повышается содержание жирных кислот и их поступление в клетки миокарда, а изменения активности цитозольных ферментов создают условия для массивного проникновения жирных кислот в митохондрии. Жирные кислоты активно включаются в процесс Р-окисления, в результате которого в митохондриях происходит накопление ацетил-КоА, который в свою очередь угнетает активность митохондриального пируватдегидроге-назного комплекса [225]. Разобщаются процессы гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях [67, 100, 101, 152, 315], что способствует нарушению функционирования миокарда. Подавление гликолиза приводит к накоплению кальция в кардиомиоцитах, провоцирует контрактуры и нарушение сократительной способности миокарда [32, 137, 242, 297]. Кроме того, жирные кислоты являются наиболее кислородоёмким субстратом процессов окисления [17, 18, 210, 212]. Они оказывают разобщающий эффект в митохондриях миокарда, накапливаясь в связи с неспособностью к полному окислению их возросших количеств [18], и существенно нарушают энергообеспечение сердечной деятельности.
Потребление избытка свободных жирных кислот индуцирует синтез церамидов из длинноцепочечных жирных кислот в цитозоле кардиомиоци-тов, а накопление церамидов инициирует апоптоз кардиомиоцитов, что влечет за собой развитие сердечной недостаточности [135]. Исследования эн-домиокардиальных биоптатов пациентов с СД2 при хронической сердечной недостаточности подтвердили наличие усиленного апоптоза как в кардиомиоцитах, так и в эндотелиоцитах по сравнению с группой пациентов без сахарного диабета [333].
Важной особенностью поражения сердечно-сосудистой системы при СД2 является раннее развитие атеросклероза, что связано с целым рядом патогенетических факторов: инсулинорезистентностью, гипергликемией, ги-перинсулинемией, дисфункцией эндотелия и нарушениями гемостаза. Атеросклероз при СД2 распознается уже на стадии нарушения толерантности к глюкозе, а по сравнению с теми лицами, у которых диабет отсутствует, он начинается на 8 -10 лет раньше, быстрее прогрессирует и протекает в более тяжелой форме [10, 39]. Инсулинорезистентность при СД2 является независимым фактором риска развития атеросклероза [72, 78, 285], который служит морфологической основой ишемической болезни сердца и цереброва-скулярных заболеваний [2, 13, 46, 48]. Однако механизм, посредством которого инсулинорезистентность ускоряет развитие атеросклероза, остается неясным.
Сведения о группе больных хроническим алкоголизмом
Содержание тиобарбитурат-реактивных соединений (ТБК-РС) оценивали колориметрическим методом [45], основанным на цветной реакции продуктов ПОЛ с 2-тиобарбитуровой кислотой в присутствии трихлорацетата. Измерение производили при длине волны 540 нм, против воды, в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Для расчета концентрации ТБК-РС использовали коэффициент микромолярной экстинкции комплекса малондиальде-гид-ТБК, равный 0,156. Содержание ТБК-РС выражали в мкмоль-л"1 плазмы крови и в мкмоль-мг"1 белка ткани.
Уровень окисленных белковых производных (ОБП) оценивали спек-трофотометрическим методом, предложенным Е.Е. Дубининой [21]. Принцип данного метода основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков (карбонильных групп) белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием альдегидо- и кетопро-изводных 2,4-динитрофенилгидразона. Для осаждения белков к 0,2 мл плазмы крови добавляли 2,0 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). К осадку денатурированных белков добавляли 2,0 мл 2 М 2,4-ДНФГ растворенного в 2 М НС1. В контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ добавляли 2,0 мл 2 М НС1. Смесь инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре при постоянном перемешивании, затем центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 минут. После отделения супернатанта осадок промывали 4-х кратно смесью этанол-этилацетат (1:1) для удаления липидов и свободного 2,4-ДНФГ. Далее, осадок просушивали с целью устранения следов этанол-этилацетатной смеси и растворяли в 1,85 мл 8 М раствора мочевины. Для лучшего растворения осадка к нему добавляли 150 мкл 2 М НС1. Оптическую плотность регистрировали при Х—ЪЮ нм. Содержание карбонильных групп рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции образовавшихся динитрофенилгидразонов, равный 21 000 М"1 см"1. Степень окислительной модификации белков выражали в нмоль на 1 грамм белка для гомогената и в мкмоль на 1 литр плазмы крови.
Концентрацию конечных производных оксида азота оценивали по методу, предложенному L.C. Green et al. [143]. Он основан на определении содержания суммарного количества нитратов и нитритов при помощи цветной диазореакции с реактивом Грисса. При определении образцы депротеинизи-ровали добавлением к 0,4 мл исследуемого материала 0,8 мл 0,5 М NaOH и 0,8 мл 10% мл раствора сульфата цинка. Содержимое пробирки перемешивали, а затем нагревали в течение 6 минут на кипящей водяной бане. После охлаждения пробы центрифугировали в течение 5 минут при 9000 об./мин. Для измерения содержания суммарного количества нитратов и нитритов проводили восстановление нитрата в нитрит гранулированным кадмием в депро-теинизированных пробах. К 900 мкл супернатанта добавляли 100 мкл аммонийного буфера и гранулированный кадмий покрытый медью. Пробы инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. К 1 мл полученного раствора добавляли равный объем реактива Грисса, перемешивали и через 10 минут инкубации фотометрировали при 538 нм против контрольной пробы, содержащей вместо биологического материала дистиллированную воду. Содержание нитритов определяли с помощью стандартных растворов нитрита натрия по калибровочной зависимости, рассчитанной для диапазона от 5 до 100 мкМ.
Содержание свободных жирных кислот определяли энзиматическим колориметрическим методом в микропланшетном формате с помощью набора реактивов «Free Fatty Acid Quantification Kit» фирмы «BIOVISION» и выражали в мг-эквивалентах пальмитиновой кислоты на литр плазмы крови.
Уровень С-реактивного белка изучали с использованием иммунофер-ментных систем высокочувствительного анализа: «C-reactive protein» произ 59 водства «ALPCO Immunoassays» (клиническая часть) и «Rat C-reactive protein» компании «Immunology Consultants Laboratory» (экспериментальная часть).
Альфа-1-кислый гликопротеин в клиническом разделе работы определяли иммунотурбидиметрически при помощи набора фирмы «Sentinel» (Италия), а в экспериментальной части — иммуноферментным методом — набором «Rat Alpha-1-Acid Glycoprotein EIA Kit» производства «Alpco Diagnostic».
Концентрацию фибронектина изучали иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов: «Human Fibronectin EIA Kit» компании «American Diagnostica» (клиническая часть) и «Rat Fibronectin» фирмы «Immunology Consultants Laboratory» (экспериментальная часть).
Измерение активности супероксиддисмутазы проводили по методике, предложенной Т. В. Сирота [43]. Принцип метода основан на ингибировании реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии супероксиддисмутазы (СОД) вследствие дисмутации супероксидных анион-радикалов, которые образуются в ходе окисления катехоламина.
Интенсивность аутоокисления адреналина характеризовали по накоплению продукта, имеющего максимум поглощения при 347 нм, химическая структура которого не описана в литературе. Образование данного вещества опережает по времени генерацию адренохрома с максимумом поглощения при А=480 нм . В пробирку вносили 50 мкл гомогената сердца и 450 мкл дистиллированной воды, предварительно охлажденной до +4 С. Мешающее влияние миоглобина устраняли добавлением 250 мкл этанол-хлороформной смеси (1:1). Полученную суспензию интенсивно перемешивали и центрифугировали при 8000 об./мин. в течение 15 минут. Супернатант использовали для определения активности СОД.
При определении исходного уровня реакции аутоокисления адреналина (холостая проба) к 3 мл карбонатного буфера добавляли 150 мкл 0,1% раствора стандартного аптечного препарата адреналина (5,46 мМ), быстро перемешивали и измеряли величину оптической плотности при длине волны 347 нм через 15 секунд в течение 3 мин. Для выяснения ингибирующего влияния суперкосиддисмутазы на данную реакцию к 3 мл буфера добавляли 50 мкл исследуемого материала, а затем инициировали реакцию введением 150 мкл 0,1% раствора адреналина, перемешивали и измеряли нарастание оптической плотности при тех же условиях (опытная проба). Исходная концентрация адреналина в пробе равнялась 230 мкМ. Измерение проводили в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Для расчета активности СОД использовали показатели поглощения холостой и опытной проб. За единицу активности СОД принимали уровень 50%-го ингибирования реакции окисления адреналина и выражали в данных принятых условных единицах на 1 мг белка.
Об активности каталазы судили по убыли перекиси водорода при А=230 нм [75] в инкубационной среде, содержащей трис-НС1-ЭДТА (рН=8,0) - 500 мкл, раствора перекиси водорода (ЮмМ) - 900 мкл, деионизированной воды - 30 мкл. Гомогенат сердца вносили в инкубационную смесь в количестве 20 мкл. Снижение оптической плотности измеряли при 25 С каждые 30 секунд в течение 3 минут против контрольной пробы, в которую вместо гомогената вносили эквивалентный объем дистиллированной воды. Активность фермента определяли по количеству разрушенной перекиси водорода за 1 мин и выражали в международных единицах.
Уровень маркеров миокардиодеструкции и острофазового ответа при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической интоксикации алкоголем
Гипогликемическое действие алкоголя нередко используют в качестве одного из аргументов безопасности, а иногда и целесообразности употребления спиртных напитков при сахарном диабете [68, 209]. Однако, наряду с ги-погликемическим эффектом, при алкогольной интоксикации и связанном с ней абстинентном синдроме формируется широкий спектр метаболических расстройств [34]. В сочетании с диабетогенными биохимическими изменениями они могут стать дополнительным механизмом неблагоприятного воздействия. Изучение в эксперименте показателей, отражающих инсулинорези-стентность, при различных вариантах сочетания хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета нами проведено с целью определения интоксикационных и постинтоксикационных эффектов потребления алкоголя в отношении качества гликемического контроля при данной сочетанной патологии.
В соответствии с полученными данными об уровне глюкозы крови (табл. 20), при алкогольной интоксикации продолжительностью 2 и 4 месяца (группы А2 и А4) проявился небольшой, но статистически значимый гипог-ликемический эффект этанола, который отсутствовал через 2 мес. после прекращения алкоголизации (группа А2-ОА2). Содержание глюкозы в крови особей СД было повышено на 86,8 % (pUn OjOOl), что подтвердило корректность моделирования экспериментального диабета. В случае, когда воздействие алкогольной интоксикации происходило во время моделирования инсулинорезистентности и прекращалось к началу развития сахарного
Концентрация глюкозы плазмы крови при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации (ммоль-л"1)
Примечание: n - численность выборки, pU - статистический уровень значимости отличий (U-тест Манна-Уитни) по отношению к соответствующей группе, указанной нижним индексом. диабета (группа А2-СД) обнаружена более выраженная гипергликемия, с превышением контрольного уровня концентрации глюкозы на 158,3% (pUnc 0,001).
Воздействие алкоголя при уже сформированном диабете, а также сочетание эффектов алкоголизации на этапе развития инсулинорезистентно-сти с продолжением интоксикации этанолом при начавшемся сахарном диабете - характеризовались гипергликемией, соответствующей по величине наблюдавшейся в группе неалкоголизированных особей с сахарным диабетом. Значение концентрации глюкозы в плазме крови крыс СД+А2 было увеличено на 80,9%, а в группе А2-СД+А2 - на 92,1% по сравнению с особями ГК (pUrK 0,001, соответственно).
Содержание фруктозаминов (ФА, табл. 21), как ретроспективная характеристика качества гликемического контроля, отразило наличие гипергликемии при экспериментальном сахарном диабете. Уровень ФА при сахарном диабете возрос в 2,39 раза по отношению к контролю (pUn OjOOl). При сочетании с алкоголизацией: в группе А2-СД он был выше в 2,65 раза (pUrK OOl), в условиях СД+А2 - увеличивался в 3,36 раза (pUnc OOl), а в экспериментальной ситуации А2-СД+А2 - повышался в 3,03 раза (pUrr OjOOl). Зарегистрировано, что в группах СД+А2 и А2-СД+А2 наблюдается более высокая концентрация ФА, по сравнению с группой СД (pUcfl=0,007 и рисд=0,015, соответственно). Между тем, значимых отличий по уровню ФА между группами СД и А2-СД не выявлено.
Следовательно, нами обнаружены особенности нарушения качества гликемического контроля, обусловленные вариантом сочетания хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Интоксикационные эффекты алкоголизации при сахарном диабете реализовались в виде совокупного углубления нарушений качества гликемического контроля (рост уровня ФА в соответствующих группах по отношению к группе СД). Влияние синдрома отмены алкоголя преимущественно охарактеризовалось гликемическим
Уровень фруктозаминов в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации (мкмоль-л" )
Примечание: n — численность выборки, pU — статистический уровень значимости отличий (U—тест Манна-Уитни) по отношению к соответствующей группе, указанной нижним индексом. проявлением базального дефицита действия инсулина, вне пищевой стимуляции его продукции (повышения содержание глюкозы натощак в группе А2-СД по сравнению с СД). Возвращаясь к результатам главы 3, проявления патологии углеводного обмена, аналогичные вышеописанным в группе А2-СД, наблюдались у пациентов с сахарным диабетом 2 типа и признаками злоупотребления алкоголем.
Очевидно, что синдром хронической гипергликемии при сахарном диабете 2 типа характеризуется инсулинорезистентностью тканей [6J.JB частности, нарушается блокирующая функция инсулина в отношении секреции в кровь свободных жирных кислот (СЖК) из адипоцитов [18], что приводит к повышению уровня СЖК в крови. Таким образом, уровень СЖК отражает степень инсулинорезистентности и выступает в качестве её маркера [6]. Для оценки чувствительности тканей к инсулину при сочетании хронической интоксикации алкоголем и сахарного диабета нами проведено определение уровня СЖК в плазме крови особей экспериментальных групп.
Согласно полученным данным (табл. 22), при изолированном течении сахарного диабета отмечается классическое проявление инсулинорезистентности в виде повышения на 74,1 % содержания СЖК по сравнению с уровнем показателя в контрольной группе (pUrK=0,031). Однако во всех группах сочетания сахарного диабета с алкоголизацией концентрация СЖК была статистически значимо ниже, чем в группе СД. Более того, в группе А2-СД и СД+А концентрация СЖК была ниже значений в контроле, соответственно, в 2,1 раза (риГк=0,021) и в 1,41 раза (pUrK=0,05). При А2-СД+А наблюдался аналогичный сдвиг, но уже в виде тенденции (риГк=0,06). Такой же тип изменений отмечается и при изолированной хронической интоксикации алкоголем, но они были значительно более выраженными. Уровень изучаемого показателя уменьшен в 5,1 раза (pUn OjOOl) при 2-х месячном потреблении алкоголя и в 5,3 раза (pUrK=0,001) - при 4-х месячном. Однако после отмены алкоголя (группа А2-ОА2) рассматриваемая концентрация уже не отличалась Таблица 22 Содержание свободных жирных кислот в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации (мг-л" )
Биохимическая характеристика формирования повреждения миокарда у больных сахарным диабетом 2 типа с признаками хронического злоупотребления алкоголем
Причинами миокардиодеструкции, в данном случае, может быть развитие более тяжелой формы сахарного диабета вследствие алкоголизации на стадии «предболезни». Анализ результатов оценки качества гликемического контроля показывает правомочность такого предположения (рис. 7). У животных данной группы наблюдается наибольшая выраженность гипергликемии среди всех изучаемых вариантов сочетания сахарного диабета и хронической интоксикации алкоголем. Кроме того, высокий уровень повреждения миокарда может быть обусловлен повышением чувствительности клеток к неблагоприятным диабетогенным воздействиям вследствие развития после-алкоголизационного состояния, сопровождающегося выраженными нарушениями метаболический процессов и биоэнергетики [1]. Отмеченное нами снижение плазменного уровня СЖК (рис. 14), практически безальтернативного источника энергии в условиях диабета [18], может способствовать про-грессированию нарушений метаболических процессов в сердце.
Воздействие алкоголя, перенесенное на этапе развития инсулинорези-стентности, не оказывает влияния на интенсификацию свободнорадикальных процессов в сердце, наблюдающуюся при развившемся сахарном диабете, но проявляется возрастанием уровня тиобарбитурат-реактивных соединений в плазме крови особей данной экспериментальной группы (рис. 9, 11). На уровне антиокислительной защиты плазмы крови и сердца рассматриваемые послеалкоголизационные эффекты при сахарном диабете проявляются принципиально аналогично интоксикационным (рис. 8). Однако, по сравнению с другими вариантами сочетания воздействия алкоголя и сахарного диабета, при анализируемой ситуации в сердце преобладают нарушения антиперекисной защиты. Это характеризуется значительно более низкой активностью ка-талазы при отсутствии сдвигов со стороны супероксиддисмутазы по отношению к экспериментальному сахарному диабету вне воздействия алкоголя (рис. 10).
Нарушение элиминации Н2Ог может быть причиной антиоксидантной неэффективности СОД. При обнаруженном нами дефиците каталазы и других факторов антиперекисной защиты в реакциях Фентона и Гебера-Вейса пероксид водорода преобразуется в гидроксильный радикал [47], который способен вызывать разрыв связей в ДНК [27], что является одним из инициаторов реализации механизмов клеточной смерти.
В данных условиях нами выявлен наивысший рост концентрации конечных стабильных производных NO (NOx) в сердце и плазме крови (рис. 12). Высокая концентрация оксида азота при наличии окислительного стресса способствует резкому увеличению продукции пероксинитрита. Установлено цитотоксическое действие избытка NO в крови на В-клетки поджелудочной железы [247], что может выступать причиной обнаруженного нами ухудшения качества гликемического контроля при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Декомпенсация диабета нередко сопряжена с миокардиодеструкцией [44]. Следовательно, один из потенциальных путей наблюдаемого снижения эффектов инсулина под влиянием интоксикации алкоголем может иметь NO-зависимое происхождение.
Известно, что избыточные концентрации пероксинитрита обладают некротическим действием [312]. Показано, что в сердце пероксинитрит инак-тивирует аконитазу [103], что угнетает цитратный цикл и способствует углублению дефицита интрацеллюлярного пула НАД+ и АТФ, наблюдающегося вследствие диабета. Повреждение ДНК пероксинитритом способствует активации в миокарде поли(АДФ)-рибозилирования, [248], что сопровождается дополнительными затратами энергии и в условиях изначально низкого уровня АТФ, как установлено [151], влечет за собой развитие некроза. С этих позиций, мощный рост содержания конечных стабильных продуктов оксида азота, наблюдаемый нами в сердце и плазме крови, можно расценивать как патохимический фактор развития обнаруженного нами ярко выраженного некротического процесса в миокарде при сахарном диабете, возникшем в периоде после прекращения хронической алкогольной интоксикации.
Данные об активности каспазы-3 свидетельствуют о том, что перенесенная в периоде формирования инсулинорезистентности хроническая алкогольная интоксикация оказывает свое проапоптотическое влияние в сердце в виде некоторого патохимического следа, который в дальнейшем сопровождает течение сахарного диабета (рис. 13).
Таким образом, зарегистрированные нами наивысшие проявления некротического процесса в миокарде при сахарном диабете, возникшем в периоде после прекращения хронической алкогольной интоксикации, сочетаются с определенными особенностями нарушений биохимических процессов. Среди таких отличительных сдвигов: преимущественное ингибирование антипере-кисных защитных механизмов, многократное увеличение содержания NO в сердце и наиболее значительный рост концентрации ТБК-РС в плазме крови. Согласно полученным результатам, наиболее значимым в отношении развития миокардиодеструкции является увеличение содержания оксида азота в сердце. Проведенный корреляционный анализ выявил статистически значимую взаимосвязь между уровнем тропонина І в плазме крови и концентрацией стабильных конечных производных оксида азота (II) в сердце (Р=0,765; р 0,01) и плазме крови (г=0,598; р 0,01) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Других существенных и статистически значимых корреляционных взаимосвязей между уровнем повреждения сердца и величиной оцениваемых биохимических параметров нами не установлено.
Полученные результаты показывают, что различные варианты сочетания экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации сопровождаются повреждением миокарда, характеризуются наличием общих закономерностей метаболических нарушений (схема 1), а также их особенностями, отражающими степень повреждения кардиомиоцитов и отличительные черты его механизма.
