Введение к работе
В последние годы существенно расширились представления о роли различных нейрохимических систем (дофаминергической, серотонинергической, ГАМК-ергической и других) и соответствующих нейромедиаторов в деятельности нервной системы. Особенно важным для понимания функционирования мозга в норме и патологии является факт их взаимодействия на рецепторном уровне [Shutoh et al., 2000, Svensson, 2000]. Это делает необходимым не только уточнение, но и, возможно, пересмотр существующих гипотез патогенеза эндогенных психозов, в частности, шизофрении, большинство из которых основаны на относительной дискретности нейрохимических систем.
В свете сказанного особое внимание привлекает к себе глутаматергическая система мозга. Глутамат (Глу) - это основной возбуждающий нейромедиатор в центральной нервной системе. Глутаматергическая система включает в себя рецепторы (ионотропные и метаботропные) и переносчики Глу. Особенность передачи сигнала в синапсе при посредстве Глу состоит в том, что кроме нейронов в процессе непосредственно участвуют глиальные клетки: поскольку для прекращения возбуждающего действия Глу необходима его эвакуация из синаптической щели, Глу переносится в астроциты, где «нейтрализуется», превращаясь в глутамин (цикл Глу/глутамин работает значительно интенсивнее «обратного захвата» нейромедиа-тора нейронными переносчиками Глу).
Такой факт, как образование многими монаминергическими нейронами (дофаминовыми, серотониновыми, норадреналиновыми, холинергическими) «глутама-тергических» синапсов и высвобождение ими Глу в качестве второго нейромедиато-ра [Tradeau, 2004, Gras et al., 2002, Allen et al., 2006], принципиально изменил постулаты, господствовавшие еще в конце прошлого века. Некоторые исследователи рассматривают глутаматергическую систему как своего рода регулятор (или модулятор) активности других нейромедиаторных систем [Zarate, 2003, Tamminga, 2006], но этот аспект еще не нашел достаточного отражения в литературе.
Возникновение глутаматергической (глутаматной) гипотезы патогенеза шизофрении можно отнести к 1980 г., когда J. Kim и соавт. обнаружили пониженные концентрации Глу в спинномозговой жидкости больных шизофренией. Некоторое время гипотеза оставалась без должного внимания, вероятно, из-за ограниченных знаний о глутаматной системе мозга человека и главенствующих представлений о том, что нарушение ее функции приводит к развитию Глу-индуцированной «нейро-токсичности», вызывающей нейродегенеративные изменения либо глубокие нару-
шения развития и функционирования нервной системы, каких не наблюдается при шизофрении. Следующие 20 лет происходило постепенное накопление фундаментальных знаний и клинических наблюдений, способствующих формированию глу-таматергической гипотезы патогенеза шизофрении.
Сформировавшаяся на рубеже веков гипотеза предполагала снижение активности Глу-зависимого проведения нервных импульсов в мозге больных из-за недостаточной активности (ингибирования) Глу- рецепторов NMDA типа. Первоначально гипотеза основывалась на общих представлениях о дисфункции этих рецепторов и психотомиметических свойствах их антагонистов, а затем были получены и нейрохимические, а также фармакологические доказательства ее правомерности [Heresco-Levy & Javitt 1998, Krystal et al., 1999]. Появились и предположения о том, что модулирование активности глутаматергической системы (в частности, регуляция функции рецепторов Глу) может быть перспективным подходом к лечению шизофрении [Carlsson, 2000, Goff et al., 1999, 2001], хотя на практике использовалось мало препаратов, действие которых направлено на глутаматергическую систему [Anand et al, 2000, Patiletal, 2007].
Ситуация, сложившаяся в области развития глутаматергической гипотезы шизофрении связана с тем, что проведение глутаматного нейромедиаторного сигнала зависит не только от количества и активности компонентов глутаматергической системы - рецепторов и переносчиков Глу, - но и от интенсивности метаболизма Глу. Публикуется все больше данных генетических, протеомных и биохимических исследований о том, что патологический процесс при шизофрении затрагивает ферменты важнейших путей метаболизма Глу - Глу/глутаминового, у-глутамильного (глутатионового), N-ацетиласпартил-глутаматного (NAAG) циклов и глутаматде-карбоксилазу, декарбоксилирующую Глу с образованием у-аминомасляной кислоты [Gluck et al., 2002, Beasley et al, 2006, Tosic et al, 2006].
Тем не менее, полученная информация о ферментах метаболизма Глу в мозге человека еще недостаточна, и в этом отношении представляют интерес прежде всего ключевые ферменты метаболизма Глу - глутаминсинтетаза (ГС) и глутаматдегидро-геназа (ГДГ).
Катализируемый ГС синтез глутамина из Глу глиальными клетками в мозге -важная реакция Глу/глутаминового цикла, впервые описанного Berl и Clark в 1969г. На рубеже веков были получены прямые доказательства существования этого цикла методом ядерного магнитного резонанса in vivo. ГС играет важную роль в азотном метаболизме практически у всех живых организмов. Этот мультимерный фермент, регуляция активности которого подчинена сложному механизму, практически не
изученному у млекопитающих, катализирует реакцию превращения Глу и аммония в глутамин за счет энергии гидролиза АТФ. Поскольку в мозге млекопитающих ГС играет важную роль в регуляции пула нейромедиатора-Глу и защите нейронов от повышенных концентраций Глу, в прекращении передачи нейромедиаторного сигнала Глу, ассимиляции и обезвреживании аммония, очевидна важность изучения молекулярной структуры ГС, а также факторов, влияющих на ее активность. Изучение структуры ГС актуально не только для понимания механизма ее функционирования, но и для разработок способов определения ее количества. ГС всех живых организмов имеют гомоолигомерную структуру с различной степенью олигомериза-ции (октамеры, додекамеры), но о ГС млекопитающих вообще и о ГС мозга человека в частности в этом аспекте информации было сравнительно мало, а вопрос о четвертичной структуре ГС мозга человека оставался открытым.
Другой ключевой фермент метаболизма Глу - ГДГ. Это один из многофункциональных ферментов, связывающих азотный и углеродный метаболизм: ГДГ катализирует обратимое окислительное дезаминирование L-Глу с образованием а-кетоглутаровой кислоты (ос-КГ), используя в качестве коферментов НАД/НАДФ. В мозге млекопитающих открыты различные изоформы ГДГ, которые адресуются в разные клеточные структуры, различаются силой ассоциации с мембранами и функциями, однако, способов очистки ГДГ мозга человека ранее опубликовано не было. Хотя благодаря молекулярно-биологическим иследованиям в геноме человека обнаружены гомологичные последовательности, которые могут кодировать разные изоформы ГДГ, лишь немногие работы посвящены белковым продуктам этих генов [Shashidharan et al., 1997, Plaitakis et al., 2000, 2003]. Эти авторы выдвинули гипотезу о том, что одна изоформа ГДГ играет роль в «базовом метаболизме», а вторая - специфическая для нервной ткани - задействована в поддержании пула нейромедиаторного Глу.
Если локализация ГС в глиальных элементах в ткани мозга здоровых лиц не вызывала сомнений (ГС обнаружена в астроцитах и олигодендроцитах), то данные о ГДГ в этом отношении противоречивы: есть сведения о том, что ГДГ - преимущественно глиальный фермент, хотя были получены также данные о локализации ГДГ не только в глии, но и в нейронах.
Что касается нейрональных ферментов - активируемой фосфатом глутамина-зы, локализованной в нейронах и участвующей в синтезе нейромедиаторного Глу, а также глутаматдекарбоксилазы - из литературы известны работы, в которых обнаружено изменение интенсивности экспрессии генов, кодирующих эти ферменты, при шизофрении [McCullumsmith et al. 2002, Braneau et al., 2005], однако, информация о ГС и ГДГ в мозге человека очень скудна, структура и биохимические свойства
этих ферментов не исследованы, а при патологии нервной системы об этих ферментах сведений еще меньше. В известных из литературы отдельных ранних работах, посвященных ГС и ГДГ, внимание уделялось окислительной инактивации ГС и количественным изменениям ГС и ГДГ при нейродегенеративных процессах. Изменение количества этих ферментов в ткани мозга, их повреждение или изменение распределения оценивалось по ферментативной активности, а также иммунохимиче-скими методами с использованием в качестве зондов антител, полученных к антигенам из мозга млекопитающих (ввиду отсутствия препаративных способов выделения ферментов из мозга человека) [Plaitakis et al., 1984, Hussain et al., 1989, Le Prince etal, 1995].
В связи со сказанным выше, актуальной является разработка способов выделения нативных ферментов ГС и ГДГ из ткани мозга человека и изучение их свойств.
Недавно в литературе появились работы, посвященные изучению отдельных ферментов метаболизма Глу в мозге при шизофрении. Результаты свидетельствуют об измении количества отдельных ферментов метаболизма Глу [Tsai, 2005, Beasley et al., 2006], однако эти исследования пока разрознены, и данные требуют подтверждения. Поскольку существуют теснейшие нейронально-глиальные метаболические связи, в том числе и через метаболизм Глу, необходимы комплексные исследования метаболизирующих Глу ферментов и глиальных белков. Развитие новых технологий, особенно количественных методов анализа белков/ферментов, позволяет реализовать такие комплексные системные нейрохимические исследования.
Известно, что патологический процесс при шизофрении затрагивает многие структуры мозга, при этом нарушение функций префронтальной коры (ПФК, поле 10 по Бродману) рассматривается как центральное событие в клинической манифестации и патогенезе заболевания. Помимо ПФК затрагиваются и лимбическая кора, базальные ганглии (хвостатое ядро), мозжечок [Manoach et al., 2000, Bottmer et al., 2005, Daskalakis et al., 2005]. Поэтому при проведении комплексных исследований мозга при шизофрении важно обследовать параллельно несколько структур, что пока редко встречается в нейрохимических работах, известных из литературы.
Нейрохимические исследования аутопсийного мозга помогают понять патогенез шизофрении. Но важно было бы также найти в периферической крови биохимические изменения, сопряженные с клиническими симптомами шизофрении. Это помогло бы правильному выбору и прогнозу эффективности антипсихотической терапии. В этом случае особое внимание обращают на себя тромбоциты крови, которые являются, по данным ряда авторов [Bosetti et al., 2002, Брусов и др. 2005], биохимической моделью, отражающей происходящие в нервной ткани процессы. В тромбо-
цитах найден ряд компонентов глутаматной системы - рецепторы и переносчики Глу (Глу-зависимые ионные каналы), зарегистрирована также глутаминазная ферментативная активность. Более того, в тромбоцитах больных шизофренией обнаружены «аномалии» работы глутаматергической системы - сверхчувствительность глутаматных рецепторов к Глу [Berk et al., 1999, 2000]. Представляется важным найти в тромбоцитах периферической крови и другие ферменты глутаматного обмена и оценить их в качестве «периферических маркеров» состояния метаболизма Глу с целью поиска и выделения таких подгрупп больных шизофренией, для которых лечение препаратами, воздействующими на глутаматергическую систему, окажется наиболее эффективным.
Таким образом, дальнейшее исследование функции глутаматергической системы мозга и особенно метаболизма Глу и его изменений при психической патологии, в частности при шизофрении, является одним из важных направлений биологической психиатрии, которое может способствовать как выяснению механизма развития шизофрении, так и разработке путей ее лечения.
Целью настоящей работы являлась характеристика ключевых ферментов метаболизма Глу в мозге и периферической крови человека в норме и при шизофрении на основе решения соответствующих методических вопросов по препаративному выделению ферментов, изучению их структуры, биохимических свойств и количественной оценки. ЗАДАЧИ работы включали:
-
разработку препаративных способов выделения и очистки ключевых ферментов метаболизма Глу - ГС и ГДГ - из аутопсийного мозга психически здоровых лиц;
-
изучение биохимических свойств и структуры этих ферментов;
-
разработку способов количественной оценки ГС и ГДГ в экстрактах мозга;
-
проведение сравнительных количественных исследований концентраций изучаемых ферментов в различных структурах мозга здоровых людей и больных шизофренией;
-
обнаружение ферментов метаболизма Глу (ГС и ГДГ) в элементах периферической крови человека и разработку способов их количественной оценки;
6) установление связи количества ГС и ГДГ в крови с выраженностью психопатологических проявлений шизофрении с использованием влияния антипсихотических средств.
Впервые выделены в электрофоретически гомогенном виде и охарактеризованы ключевые ферменты метаболизма Глу - ГС и три изоформы ГДГ мозга человека; определена первичная структура ГС мозга человека и охарактеризована её четвертичная структура; впервые обнаружен и изучен белок (фермент), по свойствам подобный ГС мозга человека - ГСПБ.
Впервые в тромбоцитах человека иммунохимическим методом обнаружены ферменты метаболизма Глу - ГСПБ и ГДГ и определена L-глутамин : гидроксила-мин трансферазная ферментативная активность, за которую отвечает ГСПБ. Разработаны и представлены соответствующие методы определения перечисленных показателей.
Получены новые экспериментальные данные о корреляциях, связывающих друг с другом концентрации ключевых ферментов метаболизма Глу в мозге психически здоровых лиц (предполагается, что это может отражать взаимосвязи экспрессии соответствующих генов, или их согласованную регуляцию). Установлены различия в корреляциях между концентрациями ключевых глиальных ферментов метаболизма Глу и ряда белков глии у психически здоровых лиц и больных шизофренией, указывающие на рассогласованность синтеза ферментов метаболизма Глу и глиальных белков при шизофрении.
Обнаруженные корреляции количества метаболизирующего Глу тромбоци-тарного фермента - ГСПБ - с выраженностью клинической патологии при шизофрении, а также с длительностью лечения до достижения положительного эффекта терапии могут служить предиктором ее эффективности в целом.
Впервые установлено изменение количества ГСПБ и ГДГ в тромбоцитах больных хронической шизофренией в процессе антипсихотического лечения, что
позволяет предполагать участие глутаматергической системы не только в патогенезе заболевания, но и в реализации терапевтического эффекта.
Показана перспективность системного (метаболомного) подхода к изучению биохимических процессов в мозге лиц, не страдающих психической патологией, и больных шизофренией для выявления особенностей метаболизма Глу при шизофрении.
Проведенное исследование позволило расширить и дополнить новыми сведениями об участии ферментов метаболизма Глу в патогенезе шизофрении современную глутаматергическую гипотезу шизофрении.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ
Открытие нескольких изоформ ГДГ, описание нового белка ГСПБ и свойств высокоочищенных ГДГ и ГС мозга человека и изучение структуры ГС расширяет представление о метаболизме Глу в мозге человека.
Соответствующие методы, разработанные в настоящем иследовании, могут быть использованы в повседневной работе других научных и практических учреждений.
Данные о том, что количества ключевых ферментов метаболизма Глу - ГС, ГСПБ и ГДГ - изменяются в различных областях мозга при шизофрении, а изменения взаимосвязаны, расширяют и дополняют «глутаматергическую» гипотезу патогенеза этого заболевания. Эти данные наряду с обнаружением связи между количественными изменениями ферментов метаболизма Глу и других глиальных белков подтверждают наличие аномалий в метаболических циклах с участием Глу между нейронами и глией в мозге больных шизофренией.
Данные об изменениях метаболизма Глу при шизофрении открывают новые перспективы в выработке подходов к лечению этого заболевания, в том числе поиск модуляторов активности ферментов метаболизма Глу и в дальнейшем, возможно, регуляторов экспрессии генов, кодирующих эти ферменты.
Подтверждено, что биохимические изменения (количества ферментов метаболизма Глу) в крови до некоторой степени отражают нейрохимические процессы в мозге при шизофрении.
Обнаружен один из возможных биохимических «предикторов» эффективности фармакологического воздействия на психопатологическую симптоматику шизофрении - это количество ГСПБ, определенное в тромбоцитах крови, взятой до начала лечения: чем оно больше, тем быстрее достигается положительный эффект терапевтического вмешательства.
Предполагается, что изучение метаболизма Глу окажется продуктивным в дальнейшем изучении не только шизофрении, но и других расстройств (аутизма, се-нильной деменции, болезни Альцгеймера, эпилепсии и т.д.), в патогенезе которых, по современным представлениям, важная роль отводится глутаматной системе.
