Введение к работе
Актуальность,проблемы. В последние годы,благодаря рязнооб -разию своих биологических свойств, фибронектин етап предметом многочисленных экспериментальных и клинических исследование. Являясь полифункциональнш гликопротеином, он вовлекается ро многие физиологические и патологические процессы.
Одної* иэ наиболее важных функции фибронектина является его способность медиировать фагоцитарные реакции моноцитов, макрофагов, неРтрофилов (Poraaler С. 1984, Toroi J. 1986, Cude-}
vric» t. 1987, Com«U« J. 19Є8, Yang К. 1988 ' c 'зыва-ясь с коллагеном, агрегатами фибрина, иммунными комплексами, различными микроорганизмами, фибронектин способствует их выведению из кровеносного русла клетками системы мононуклеарнмх фагоцитов ( ВаЪа Т. 1969, Blumenetock Р., 1982, Comette J. 1988 ).
Несмотря на многочисленные публикации, посвященные изучению роли фибронектина в фагоцитарных реакциях, механизмы его функционирования до сих пор остаются не выясненными. Недоста -точно данных о взаимодействии фибронектина с другими опсонина-ми, в частности с антителами.
Всё вышеизложенное свидетельствует о перспективности проведения комплексных исследование, по изучению функции фибронек -тина, его участия в патогенезеразличных заболевание, а также по созданию лечебных препаратов фибронектина для заместитель -Hot1 терапии. Одним из условий, необходимых для проведения та -ких исследование, является наличие точных и пригодных для клинического применения экспресс-методов определения уровня плазменного фибронектина.
В исследовательское практике широкое применение получили методы, основанные на определении фибронектина как антигена: тт,г\'нонефело^етрия, иучуно-знзимдаР метод, ракетны? иммуноэ.чек-
- 'с -
трофорез.
Между тем, существуют литературные данные о том, что при такте патологических состояниях, как ревматоидной артрит у людей, экспериментальная злокачественная опухоль у животных, наблюдаются значительные расхождения между биологической актив -ностыо фибронектина и его концентрацией как антигена ( ВаЬь т. 1980 ). Одной из причин такого расхождения может быть циркуляция в кроЕИ функционально неполноценного фибронектина, его фрагментов или комплексов, которые, однако, сохраняют иммуно -химическую реактивность.
Одновременное определение уровня фибронектина как анти -гена и его биологической активности должно позволить более правильно оценивать его участие в патогенезе различных заболеваний, обеспечивая обьективную клиническую интерпретацию полученных результатов для выбора правильной тактики лечения. Но до настоящего времени не имеется простых в исполнении, хорошо воспроизводимых методов количественной оценки отологической активности фибронектина.
Цель работы - отобрать объективные критерии биологической активности, фибронектина и на этой основе создать экспрессчме-тод определения концентрации биологически активной формы это -го белка.
Основные задачи исследования:
-
Изучить воздействие нативного и денатурированного фибронектина на полиморфонуклеарные лейкоциты в реакции люминол-зави-симой хемилюминесценции.
-
Разработать метод определения концентрации биологически активного фибронектина.
-
Изучить возможности метода определения концентрации биологически активного йгбгонектина р эксперименте и медицинское . проктите.
- :* -
Научная новизна работы. Впервые показано, что нативный фибронектин способеїгдозо-зависимо усиливать кис.чородішР метаболизм полимгрфпнуклеарныу леРкоют^оп только после і'.го взаимодействия с объектом фагоцитоза. Дпя фибронектин-опосредорянной активации клоточ необходимы ионы чальция; реализация действия кальция осуществляется при участии к.чльцневьтх канн лов.
При изолированной черепно-мозговой травме у гаросльгх и заболеваниях органов дыхания у детей концентрация биологически активного фибронектина в плазме изменяется параллельно имчуно-реактивному. При чврепно-чозгово? тшвмй, сочетанчой с повреждением опошо-дяигателъного аппарата, а также при внутривенном введении ппепаратов «елотиноля происходит значительное снижение .уровня биологически активного фибронектина при незначительном падении г го концентрации как антигене.
Практическая ценность. Разработал способ получения устойчивых ппи длитечьном хранении желатини?ированных микрочасгии для определения концентрапии биологически актипного фибронектина. Предлочентае критерии нативности фибронектина позполчли раз работать технологи*) получения пастеризованного препарата этого белка с сохраненном биологической активности.
Параллельное определение уровня фибронектина в тесте агрегации желатинизированннх ликротестяц и одним из иммунохимичес -ких методов позволило рекомендовать хирургам отказаться от применения желатиноля для гнутривенннх инфузий как агента, блоки -ручіщего фупкциональнуо активность фибронектина.
Полонення, вчносимке на защиту:
I. 5ибглнекг<аг при в-чаимодеРетвии с золотистым ст-тфигоко-' гком и желатинизировантми микгочастигчшя проявляет опсоничес-иуп активность, вызывая 'тимулячко кислород-злвнсимого уетабо-
- 4 -лизма полиморфонуклеарных лейкоцитов.
2. Агрегация желатинизированных микрочастиц под действи -ем фибронектина специфична и количественно отражает содержание биологически активного белка.
Апробация работы. Результаты работы докладывались иа научно-практической конференции "Современные методы диагностики и лечения в условиях многопрофильной больницы" ( Казань, 1987 ), на конференции молодых учёных ( НИИЭМ им.Пастера, Ленинград, 1988 ), на II Всесоюзном семинаре по фибронектину (Москва.1989), на XII Всесоюзном съезде детских врачей ( Москва, 1989 ).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.
Внедрение результатов исследования. На I изобретение получено положительное решение, на I изобретение - авторское свидетельство ( М 1775907 ). Разработаны: экспериментально-производственный регламент, временная фармакопейная статья и инструкция по применение фибронектина на препарат "Фибронектин. Глазные ' капли". Документация утверждена йармкомитеточ России ( протокол заседания № II от 25.06.92 ).
Разработаны: экспериментально-производственный регламент и временная фармакопейная статья на получение лекарственной формы фибронектина из отходов производства преааратов крови. Докумен-чация утверждена на учёном Совете КНИИЭМ ( протокол 9 8 от 9.II. 90 ).
Оформлены временная фармакопейная статья, инструкция по применен'.!» к регламент на производство диагносгикумв. "Жела^иниэированные микрочастицы". Документация рассмотрена на заседчиии учёного Совета КНИИЭМ ( протокол № 4 от 31.04.89 )'. Представлены ь-Зарч-'. ксмитет га России. 1990. Сформлзіи методические рекомендация " Диагностика гило- v ги -
- 5 -перфибронектинемии", рассмотрены на учёном Совете КНКИЭМ (протокол .* 10 от I.I0.90 ), представлены в Государственный комитет санитарно-зпидемиологичі. ікого надзора для утверждения ( январь 1992 ).
Структура и объём диссертации. Диссертация состояит из введения, обзора литературы, изложения методов исследования, собственных исследование, обсуждения полученных резульатов, списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на // страницах, приведено 20 рисунков, 10 таблиц.
МЕТОДЕ! ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение полиморфонуклеаонкх лейкоцитов (ПМНЛ). ПМНЛ выделяли по Боям (1968) в нашей модификации. В качестве источника лейкоцитов использовали свежую кровь- здоровых доноров. Кровб брали из срединной локтевой вены в пластиковую пробирку, Стабилизированную цитратом натрия кровь смешивали с б$ раствором декстрана Т-500 и оставляли под углом 45 при комнатной температуре на 40-45 минут. После осаждения эритроцитов надосадоч-нуп взвесь, богагуп лейкоцитами, отсасывали и дважды промывали физиологическим раствором.
Получение У?іир*ронекгина. Фибронектин выделяли из свежеполу-ченной или свежеразмороженной плазмы здоровых доноров на желатиновом сорбенте ( Зинкевич О.Д.', 1992 ).
Определение концентрации фибронектина. Концентрацию фибронектина в плазме крови определяли ракетным иммуноэлектрофоре -зом ( Аксельсен Н., 1977 ). Для проведения иммуноэлектрофореза использовали гипериммуннуи антисыворотку против фибронектина человека. В качестве контроля использовали разведения стандартного раствора фибронектина с известным его содержанием. Концентрация очищенного препарата фибронектина определяли спектрофо-
тометрически'с использованием коэффициента йк'ггинкции 1.28 ( 0,1$ ) при длине волны 280 нм ( Моввяаоп Ы.1975 )
Идентификация и определение чистоты фибронектина. Идентификацию фибронектина проводили с помощью электрофореза в поли-акриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия без восстановления и с восстановлением f, -меркаптозігнолом ( laem -cut 1970 ).
Получения тоньргата пнтител к фибронертину (Ермолин Г.А.и др. 1986 ). Ан^исыворотку к фибронекгину получала иммунизацией беспородных к ноликов растворами фибронектина "еловекп. в полном адьюванте $ре»кда. Коньогат антител с пероксидазой хрена гото-лили путём окисления пероксидазы периодатом натрия. Полученный коньюгат хранили в фосфатном буфере при -Г;0С.
Люминол-зависимая хомилшинесценция лейкоцитов ( Дуглас С.Д, 1983 ). Активацию лейкоцитов оценивали в реалии лшинол-эави-симой хемилюминесцекции с помощью модифицированного нами счётчика /-частиц. В качестве среды инкубации использовали раствор Хенкса с добавлением 15?'альбумина человека. Зпмер хемилшинес-ценции производили с интервалом в одну минуту до достижения пика. Концентрация используемых в опыте ПМШІ составляла 4 хЮэкл./ мл.
Статистическая обработка данных. Использовали метод вариационной статистики с расчётом средних показателей, их ошибок. Оценку достоверности проводили по критерию Стьпдента.
