Введение к работе
Актуальность проблемы. Управление процессом фотосинтеза представляет собой одну из центральных задач, стоящих перед биологической наукой, для решения которой в первую очередь необходимо всестороннее знание организации фотосинтетического аппарата. Наряду с исключительно важной ролью, которую играют хлоропласти в фотосинтезе, они осуществляют также синтез белка, аминокислот, биосинтез жирных кислот и фосфолипидов, конечные стадии ассимиляции азота и серы.
Хлоропласта имеют собственную генетическую систему и способны мутировать. Как следствие, пластидные мутации могут определять различные структурно-функциональные изменения аппарата пластид и в целом клетки. Поэтому пластидные.мутации являются прекрасными моделями для исследования структуры и функции генома хлоропластов, различных сторон пластидно-ядерных взаимоотношений /Hagemann, 1980; Белецкий, 1989/. Нельзя недооценивать роль пластидных мутаций в решении задач генетики фотосинтеза и устойчивости растений к абиотическим факторам внешней среды.
Долгое время четких и воспроизводимых способов искусственного получения мутаций пластид у высших растений не существовало, несмотря на неоднократные попытки, предпринимавшиеся в этом направлении. Следует отметить, что у водорослей, например у Chlamydomonas, индукция пластидных мутаций не вызывает особых затруднений /A.D. Blowers et al., 1989/. Сложившаяся сигуация тормозила развитие теоретических исследований в области генетики высших растений и делала невозможным широкое использование в практике пластидных мутантов с повышенными фотрсиитетической активностью и устойчивостью к экстремальным воздействиям.
В течение ряда лет в отделе генетики Научно-исследовательского института биологии Ростовского университета под руководством Ю.Д. Белецкого проводились исследования'индуцированной изменчивости хлоропластов у подсолнечника. Впервые в мире была доказана возможность индукции мутаций пластид при помощи Ы-нитрозо-М-мегилмочевииы. Эти работы получили высокую оценку в мировой науке /Белецкий, 1989/. В дальнейшем способность НММ реагировать с наследственным материалом хлоропластов была подтверждена рядом исследователей /Pohlheim, 1974/. В нашей стране работы по индукции и биохимической
- г -
характеристике пластидных мутаций ведутся в единичных лабораториях.
В настоящее время в отделе генетики имеется коллекция пластом-ных мутантов подсолнечника, с помощью которой изучаются механизмы образования пластомных мутаций. Индуцированные пластидные мутанты подсолнечника используются для решения многих теоретических проблем, в частности, такой важной, как проблемы пластидно-ядерных взаимоотношений, и в практических целях, например, для повышения устойчивости растений к стрессовым факторам (засоление, засуха, химические соединения и т.д.).
К началу наших исследований для ряда мутантов подсолнечника, в Юм числе использованных нами, была доказана с помощью гибридологического анализа и других методов пластомная природа мутаций. Было установлено, чго пластиды оказывают влияние на функциональную активность ядерных генов. В то же время биохимические и ультраструктурі'ые исследования пластид оставались фрагментарными. Не был изучен лолипептидный состав тилакоидных мембран пластид подсолнечника, который, как нам казалось, мог дать объяснение обнаруженным резким ультраструктурным изменениям пластид у бесхлорофилльных пластомных мутантов подсолнечника.
Цчль и задачи исследования. Перед нами была поставлена задача -исследовать биохимические и ультраструктурные особенности пластид ряда жизнеспособных и летальных мутантов подсолнечника, попытаться выявить те изменения структуры и функций пластид, которые определяются непосредственно изменением в хпДНК. Подобная работа на коллекции пластомных мутантов подсолнечника была проведена впервые.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие
экспериментальные задачи: "
определить содержание хлорофиллов и параметры фотосинтетиче-ской активності} у пластомных мутантов подсолнечника;-
изучить ультраструктуру мутантных пластид пластомных мутантов подсолнечника;
определить коэффициент седиментации рибосом в гомогенатах листьев пластомных мутантов подсолнечника;
исследовать высокомолекулярную рРНК из 70S и 80S рибосом пластомных пестролистных линий подсолнечника методом диск-электрофореза;
определить удельную активность РБФКО у пластомных пестролистных мутантов подсолнечника;
- исследовать полипептидный состав тилакоидных мембран пластид пластомных мутантов подсолнечника "методом диск-электрофореза в присутствии ДДС-Na.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено сравнительное биохимическое исследование ряда жизнеспособных и летальных пластомных мутантов подсолнечника. Показано, что жизнеспособные мутанты Chlorina по ряду изученных биохимических показателей сходны. То же самое справедливо и для изученных пестролистных мутантов. Таким образом, биохимические данные подтверждают классификацию мутантов на типы Chlorina и пестролистные, основанную на фенотипических и генетических признаках.
Показано, что наряду с резким нарушением уровня накопления зеленых пигментов, у пластомных мутантов значительно нарушена, по сравнению с контролем, ультраструктура пластид. Тем не менее, пластиды содержат физиологически активные рибосомы, о чем можно судить по удельной активности РБФКО в мутантных пластидах листьев подсолнечника, поскольку известно, что большая субъединица РБФКО кодируется хпДНК и синтезируется на 70S рибосомах.
Впервые изучен состав белков 70S рибосом подсолнечника. Показано, что пластомные мутации подсолнечника могут подавлять экспрессию рнбосомных генов и вызывать изменения в структуре аппарата трансляции (рибосом).
Показано, что мутация в пластидном геноме, являющаяся причиной хлорофиллыгого дефекта, не вызывает изменений в составе, полипептидов органельного происхождения. Однако, вызванное мутацией нарушение структуры и функций хлоропласта, по-видимому, блокирует синтез пластидных факторов, участвующих в регуляции активности ядерных генов, кодирующих полипептиды светособнрающего Хл alв-белкового комплекса.
Сравнительное биохимическое исследование коллекции пластомных мутантов позволяет глубже понять сложные взаимосвязи, имеющие мес-' то в биогенезе и функционировании хлоропластов. Среди исследуемых и других мутантов коллекции подсолнечника, имеющейся в отделе генетики НИБИ РГУ, есть формы, обладающие хозяйственно-ценными признаками. Так, например, мутант'en-chlorina-5 является засухоустойчивым, а мутант en-chlorina-3 и en-chlorina-1 - солеустойчивым. Сравнительный биохимический анализ мутантов позволяет дать характеристику состояния их пластидного аппарата, что является ценным при выяснении
в дальнейшем причин, по которым эти мутанты имеют хозяйственное значение.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на "IV Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров им. Н.И, Вавилова" /г.Кишинев, 1982/, на "IV Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии клетки" /г. Тбилиси, 1985/, на Всесоюзной конференции "Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций - новые направления в мутагенезе растений" /г. Вильнюс, 1986/.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит і таблиц и /э рисунков. Список цитируемой литературы включает / наименований, из которых -fSS^ иностранных языках.
