Введение к работе
Актуальность темы
Исследование молекулярной природы наследственных заболеваний человека является одной из актуальных задач современной биологии. Важное значение эти исследования приобрели в последнее время, в связи с внедрением в широкую медицинскую практику методов молекулярной биологии для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.
Фенилкетонурия (PKU) - одно из распространенных аутосомно-рецессивных наследственных заболеваний человека, обусловленное нарушением метаболизма фенилаланина, которое вызвано недостаточной активностью фермента фенилаланингидроксилазы (РАН). Из-за высокой частоты встречаемости в России (1 на 10000 новорожденных в год) фенилкетонурия представляет собой важную медико-социальную проблему. Заболевание в большинстве случаев поддается диетотерапии в случае своевременной (пренаталыюй и постнатальной) диагностики. При отсутствии своевременной терапии токсические метаболиты фенилалаїгина оказывают деструктивное воздействие на центральную нервную систему, в результате чего развивается умственная отсталость.
Исследования причин PKU на молекулярном уровне показали, что в подавляющем большинстве случаев заболевание связано с мутациями в структуре гена фенилаланингидроксилазы (РАН). Спектр мутаций и их распространенность имеют выраженные региональные и этнические особенности. Изучение спектра мутаций гена РАН в разных регионах показали, что PKU - крайне гетерогенное наследственное заболевание. В настоящее время известно более 400 мутаций гена РАН, большинство из которых являются точковыми заменами. Несмотря на высокую гетерогенность спектра мутаций, несколько мутаций обычно являются превалирующими в той или иной популяции.
Идентификации мутаций у больных PKU является достаточно сложной задачей, учитывая значительную длину гена РАН (105000 п.н), и большое количество выявленных мутаций (более 400). Знание региональных особенностей спектра мутаций позволяет увеличить эффективность такой идентификации (в первую очередь за счет первоначального скрининга наиболее частых мутаций в регионе). Идентификация мутации важна для применения дифференцированного подхода к лечению заболевания, поскольку различные мутации в разной степени снижают активность РАН. Изучение спектра мутаций разных регионов может помочь более точно исследовать процессы возникновения и распространения мутаций, обуславливающих PKU. Поскольку заболевание в подавляющем большинстве случаев связано с нарушением одного гена, модель PKU является
перспективной для развития корректирующих генетические дефекты методов лечения, таких как соматическая генная терапия.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы было определение спектра мутаций гена фенилаланингидроксилазы в группе больных фенилкетонурией, проживающих на территории Новосибирской области, путем анализа нуклеотидных последовательностей зкзонов и поиск новых полиморфных сайтов в нитронах гена. На основании полученных данных планировалось подобрать эффективные методы детекции наиболее распространенных мутаций.
В ходе работы планировалось решить следующие задачи:
изучить спектр мутаций в экзонах (3, 5, б, 7, 10, 11, 12) гена РАН, кодирующих функционально важные участки фермента,
определить неизвесткую ранее нуклеотидную последовательность интрона 7 гена РАН человека,
осуществить поиск в интронах гена РАН потенциальных полиморфных сайтов,
подобрать эффективные методы детекции выявленных мутаций гена РАН.
Научная новизна работы
Впервые определен спектр мутаций гена РАН у больных фенилкетонурией Новосибирской области.
Определена неизвестная ранее нуклеотидная последовательность интрона 7 гена РАН человека.
Выявлены неизвестные ранее полиморфные сайты в интронах гена РАН человека, которые могут быть рекомендованы как генетические маркеры для идентификации аллелей.
Научно-практическая ценность работы
Выявленный спектр мутаций позволил предложить эффективные методы детекции наиболее распространенных из них, внедрение которых в медицинскую практику может повысить эффективность диагностики PKU. Выявленные в структуре гена РАН полиморфные сайты могут быть использованы как генетические маркеры для оценки носительства и идентификации аллелей. В процессе работы создан набор молекулярных зондов (фрагментов генов, продуктов ПЦР и олигонуклеотидов - праймеров для ПЦР) для различных
областей гена РАН человека, а также набор ДНК фрагментов гена РАН, содержащих охарактеризованные мутации.
Публикации її апробация работы
Результаты работы были представлены в виде устных докладов на конференции "Геномика- медицине" (Москва, 1999) и международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" (Гурзуф, Украина, 2000), а также в виде стендового сообщения на международной конференции "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии" (BDENE-2000, Новосибирск, 2000). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 20 рисунков, 16 таблиц; список цитируемой литературы включает 263 ссылки. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, обсуждения результатов и выводов.
