Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Биологическая роль меди 10
1.2. Белки, участвующие в транспорте меди 13
1.3. Два типа метаболизма меди в организме млекопитающих 28
1.4. Животные модели, используемые для изучения метаболизма меди 33
1.5. Сравнение Cu(I) и Ag(I) 39
2. Материалы и методы 42
2.1. Оборудование 42
2.2. Материалы 43
2.3. Лабораторные животные 44
2.4. Экспериментальные методы 45
2.4.1. Методы выделения препаратов белков и нуклеиновых кислот 45
2.4.2. Методы исследования нуклеиновых кислот 48
2.4.3. Методы исследования белков 50
2.4.4. Аналитические методы 58
2.4.5. Методы гистологического анализа 59
2.4.6. Физиологические тесты 59
2.4.7. Статистическая обработка результатов 61
2.4.8. Компьютерные программы, использованные в работе 61
3. Результаты и их обсуждение 62
3.1. Влияние хлорида серебра на метаболизм меди у Ag-A30 крыс 63
3.2. Восстановление показателей статуса меди у Ag-A30 крыс 65
3.3. Исследование влияния хлорида серебра на метаболизм меди в течение постнатального периода развития 69
3.4. Онтогенез зависимое влияние ионов серебра на метаболизм меди 77
3.5. Влияние длительной Ag-диеты на метаболизм меди крыс 83
3.5.1. Показатели статуса меди у Ag-N180 крыс 84
3.5.2. Локализация ионов серебра в организме Ag-крыс 85
3.5.3. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, у Ag-N180 крыс 89
3.5.4. Внутриклеточное распределение серебра в печени Ag-крыс 91
3.5.5. Распределение серебра в сыворотке крови Ag-крыс
3.5.6. Сравнительная характеристика частично очищенных препаратов церулоплазмина из сыворотки крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс 98
3.5.7. Некоторые свойства ЦП, циркулирующего в кровотоке Ag-N180 крыс 102
3.5.8. Скорость секреции [14C]ЦП в кровоток Ag-N180 крыс 106
Заключение 110
Выводы 120
Список сокращений 121
Список литературы 122
- Два типа метаболизма меди в организме млекопитающих
- Методы выделения препаратов белков и нуклеиновых кислот
- Исследование влияния хлорида серебра на метаболизм меди в течение постнатального периода развития
- Сравнительная характеристика частично очищенных препаратов церулоплазмина из сыворотки крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс
Два типа метаболизма меди в организме млекопитающих
Медь является микроэлементом, необходимым для нормального роста и развития организма. Во время беременности необходимое развивающемуся плоду количество меди обеспечивается ее переносом из материнского кровотока. Увеличение потребности в меди организма матери коррелирует с увеличением содержания меди в сыворотке крови. Дефицит меди в течение беременности может привести к ранней эмбриональной смерти плода или большим структурным патологиям, включая скелетные, легочные и сердечно сосудистые дефекты (Keen et al., 1998). Было показано, что в плацентарном транспорте меди важную роль играет CTR1. Он локализован на базальной мембране, где предположительно служит для транспортировки меди в синцитиотрофобласты (Hardman et al., 2006). Такая локализация CTR1 является несколько неожиданной, поскольку предполагает транспорт меди от плода в плаценту. Тем не менее, уровень меди в крови матери намного выше (примерно в 5 раз), чем в пуповинной крови, что подтверждает базальную локализацию CTR1 и перенос избытка меди от плода к матери, а не в обратном направлении (Butler Walker et al., 2006). В соответствии с этим можно предположить, что уровень меди у плода должен очень тонко регулироваться из-за недостаточного развития медь-связывающих ферментов, транспортеров, защиты от окислительного стресса, а также меняющихся потребностей в меди в разные периоды постнатального периода. Кроме того, плацента является одной из немногих тканей в организме, в которых экспрессируются ATP7A и ATP7B. Однако они имеют разную локализацию. АTP7A расположена на базальной мембране и отвечает за транспорт меди от матери к плоду. В то время как ATP7B находится на микроворсинках и участвует в ее мобилизации в комплекс Гольджи для встраивания в медь-ассоциированные белки эмбриона (Hardman et al., 2011).
В первые дни после рождения у млекопитающих наблюдается накопление меди в печени (Allen et al., 2006). При этом в сыворотке крови концентрация меди и содержание ЦП в несколько раз ниже, чем у взрослых млекопитающих. На молекулярном уровне эти данные согласуются с высоким уровнем экспрессии генов CTR1 и ATP7A и низким уровнем экспрессии гена ATP7B (Kuo et al., 2006, Lenartowicz et al., 2010). Возможно, такая связь между содержанием меди и уровнем экспрессии генов связана с неоптимальными транспортными возможностями печени новорожденных, приводящими к ограниченной экскреции меди из печени или накоплению меди в печени для обеспечения растущих и развивающихся органов (Kuo et al., 2006, Evans et al., 1970). Такой тип метаболизма меди определяют как эмбриональный тип (ЭТММ). У млекопитающих с ЭТММ развита система регуляции поглощения меди. Было показано, что у крыс, получающих молоко с повышенным содержанием меди, происходит увеличение ее поглощения, однако уровень меди в сыворотке крови не меняется в результате того, что увеличивается ее удержание в кишечнике (Varada et al., 1993, Bauerly et al., 2005). Затем (у крыс на 13-й день жизни) происходит резкое перераспределение меди в организме: содержание меди и ЦП в крови повышается одновременно с ее снижением в печени. Кроме того, снижается уровень экспрессии CTR1 и ATP7A, и повышается уровень экспрессии ATP7B, участвующей в металлировании купроэнзимов в аппарате Гольджи и выведении меди через желчь. В этих изменениях состоит переход ЭТММ на взрослый тип. В настоящее время остаются неизвестными сигнал или сигналы, вызывающие переход от ЭТММ к взрослому. Можно думать, что таким сигналом может быть смена источника пищевой меди (Пучкова и др., 1997; Платонова и др., 2004; Платонова и др., 2005; Platonova, et al., 2007). У взрослых млекопитающих пищевая медь поглощается энтероцитами преимущественно через CTR1 в виде Cu2+ и экспортируется в систему воротной вены для последующего распределения по всему организму (Nyasae et al., 2007; Ravia et al., 2005) (Рисунок 1.4).
В дополнение к исследованиям роли CTR1 в транспорте меди в кишечнике, исследования in vitro продемонстрировали, что DMT1 (транспортер двухвалентных ионов металлов 1) и CTR2 могут способствовать поглощению пищевой меди, однако их вклад in vivo не вполне ясен (Arredondo et al., 2003). Исследования на молодых людях с использованием стабильного изотопа 65Cu показало, что ежедневное поглощение меди, достаточное для поддержания ее гомеостаза, составляет 0,8 мг (Turnlund, 1998). Поглощение меди зависит от нескольких факторов, включая возраст, пол, содержание меди в рационе (Johnson et al., 1992). После поглощения медь поступает в кровоток. Здесь она связывается с белками сыворотки крови 2-макроглобулином и альбумином, а у поверхности гепатоцитов переходит в комплекс с гистидином (Moriya et al., 2008). Медь, связанная с белками, находится в обменной форме, и этот пул из системы портальной вены поступает в печень через CTR1 (Hellman, Gitlin., 2002; Kuo et al., 2006). Мыши со сниженной экспрессией Ctr1 в печени демонстрируют уменьшение активности купроэнзимов, снижение уровня меди в печени и почках, уменьшение выведения меди через желчь (Kim et al., 2009). При этом содержание меди в других органах не меняется, что свидетельствует о существовании компенсаторного, независимого от CTR1 механизма, который облегчает поглощение и/или повышает доставку меди из печени в большой круг кровообращения, несмотря на сниженный запас меди в печени. Однако молекулярный механизм, с помощью которого это происходит, остается неизученным. Печень является основным органом аккумулирования меди и, следовательно, регуляции ее гомеостаза. В печени медь разделяется на три пула. Первый встраивается в новосинтезированный ЦП, второй включается в купроэнзимы или связывается в металлотионеином для хранения в гепатоцитах, третий выводится через желчь (Пучкова и др., 1993; Cousin, 1985; Kim et al., 2009). Из печени медь может транспортироваться в любой другой орган через кровоток. Около 65-90% меди, содержащейся в плазме крови, ассоциирована с церулоплазмином, мультимедной голубой оксидазой, которая, как описано выше, в основном синтезируется и экскретируется печенью (Linder et al., 1996; Hellman, Gitlin., 2002). Остальная медь в плазме крови, по-видимому, связана в обменной форме с 2-макроглобулином ( 12%), альбумином ( 18%), а также небольшими пептидами и аминокислотами, однако точный механизм транспорта меди в плазме, а также ее доставка к клеткам-мишеням остается в значительной степени неизученной. Кроме того, ЦП является ферроксидазой, что имеет значение для поглощения железа. Так как период полураспада ЦП в сыворотке составляет около 5 дней, на его биосинтез и кругооборот приходится значительная часть потока ионов меди. Биосинтез и распад холо-ЦП происходят преимущественно в печени. В кровотоке, в ходе выполнения своих функций ЦП разрушается, теряя остатки сиаловых кислот. Десиалированный ЦП связывается с асиалогликопротеиновыми рецепторами, расположенными на поверхности гепатоцитов и подвергается эндоцитозу (Omoto, Tavassoli, 1989; Пучкова и др. 1997). После деградации интернализованного ЦП лизосомами гепатоцитов, медь освобождается. При нормальном гомеостазе, таким образом, освобождается около 0,5 мг меди. Избыток меди ( 2,5 мг/день) выделяется через желчь. Желчный пул меди связан с солями желчных кислот, что иммобилизует медь и препятствует ее реабсорбции (Lewis, 1973).
Методы выделения препаратов белков и нуклеиновых кислот
Выделение тотальной РНК. Экстракцию РНК из исследуемых органов осуществляли с использованием реактива TRIzol Reagent (TriPure Isolation Reagent, Invitrogen), в полном соответствии с инструкцией производителя. Чистоту и нативность полученных препаратов РНК проверяли спектрофотометрически и электрофоретически. Препараты РНК (D260/28o=l,9) по данным электрофореза в 1% агарозном геле не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК.
Концентрацию РНК измеряли спектрофотометрически (спектрофотометр NanoDrop 2000с Thermo Scientific, США) при длинах волн 260 и 280 нм согласно стандартной методике. О степени чистоты препаратов РНК судили по соотношению оптических плотностей D26o/D28o и получаемым с помощью спектрофотометра спектрам. Получение субклеточных фракций печени. Субклеточные фракции из печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования. Образцы гомогенизировали на льду в 20 мM Tris-HСl (pH 7,4) буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 100 мМ КCl, 5 мM MgCl2, 2 мМ DTT, (буфер А). Для получения фракции митохондрий гомогенат последовательно центрифугировали 2 раза по 8 мин при 800хg и 20 мин при 12000хg. Полученный осадок ресуспендировали в буфере А и инкубировали в 1 % раствором Triton X-100 в течение 20 минут на льду, после чего центрифугировали при 6000хg в течение 10 минут. Для выделения цитозоля постмитохондриальный супернатант центрифугировали при 18000хg в течение 1 часа.
Разделение клеточных органелл методом равновесного центрифугирования. Гомогенат ткани получали, как описано выше. Ядра, обрывки клеточных мембран и не разрушенные фрагменты ткани удаляли центрифугированием 3000хg 10 мин. Супернатант наслаивали на ступенчатый градиент концентраций сахарозы 50-47-45-42-27 % (вес/вес), приготовленной на буфере 40 мМ Tris-HCl буфере, и центрифугировали при 24000 об/мин 3.5 ч в роторе SW27 ультрацентрифуги Optima LE-80K Ultracentrifuge, Beckman. Градиент фракционировали по 1 мл. Плотность сахарозы в отобранных фракциях измеряли на рефрактометре ИРФ-22 (Москва, СССР), она составляла для митохондрий, лизосом и пероксисом 1.2, 1.22 и 1.23 г/см3, соответственно. Все процедуры, связанные с выделением субклеточных фракций, проводили при 4оС, в работе использовали только стерильные инструменты и посуду.
Получение препарата растворимых белков цистернального пространства мембран аппарата Гольджи. Фракцию мембран аппарата Гольджи собирали после центрифугирования в градиенте сахарозы на границе 29% сахарозы. Собранную фракцию разводили буфером А, не содержащем сахарозу, до конечной концентрации сахарозы 0.25 М, и центрифугировали при 23000хg 40 мин. Осадок ресуспендировали в буфере А и обрабатывали ультразвуком, дважды по 15 сек и центрифугировали 1 ч при 100000хg в роторе Ti50 ультрацентрифуги Spinko L2-65B, Beckman. Супернатант (растворимые белки цистернального пространства аппарата Гольджи) собирали и анализировали методом двумерного иммуноэлектрофореза. В первом направлении в 1.5% агарозном геле фракционировали 100 мкг белков препарата, во втором направлении проводили иммуноэлектрофорез в 1% агарозном геле, содержащем в 1 мл 100 мкг IgG, выделенных из антисыворотки к ЦП крысы. После электрофореза гель освобождали от непрореагировавших антител, высушивали и окрашивали о-дианизидином.
Получение растворимого содержимого желудков и мочи новорожденных крыс. Мочевые пузыри аккуратно извлекали, помещали в пробирки типа Эппендорф, разрезали и центрифугировали в течение 5 мин. Мочу (супернатант) собирали для анализов. Для получения растворимого содержимого желудка новорожденных навеску, взятую из полных желудков, ресуспендировали в двух объемах PBS, после инкубации в течение 30 мин при 0оС смесь центрифугировали в течение 10 мин и собирали супернатант для анализов.
Выделение очищенного препарата церулоплазмина. Очищенный препарат ЦП из сыворотки крови контрольных и получавших с пищей хлорид серебра крыс выделяли методом ионообменной хроматографии в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5.5 (буфер В), на колонке с DEAE-сефарозой. Элюцию проводили ступенчатым градиентом NaCl, приготовленном на буфере В. Фракции идентифицировали по присутствию в них ЦП, который выявляли методом иммуноблотинга. ЦП-содержащие фракции сыворотки контрольных животных объединяли и подвергали дополнительной очистке преципитацией в смеси этанол/хлороформ, как описано Manolis и Cox (1980). Фракции, полученные из сыворотки Ag-крыс, этой процедуре дополнительной очистки не подвергали. Каждую фракцию анализировали индивидуально.
Гель-фильтрация. Гель-фильтрацию проводили на колонке (1.6 х 40 см) с Сефадексом G-75 (superfine; 10-40 мкм) в 20 мМ трис-НСl буфере, содержащем 5 мМ 2-меркаптоэтанол, рН 7,6. Скорость потока 0,5 мл/мин. Свободный объем колонки оценивали с помощью декстрана синего. Фракции, следовавшие за свободным объемом, собирали (1.5 мл) и измеряли в них оптическую плотность при длине волны 280 и 254 нм, концентрацию меди и/или серебра.
Обратная транскрипция, сопряжнная с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Синтез кДНК с помощью обратной транскрипции проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг тотальной РНК, 200 единиц M-MLV обратной транскриптазы, однократный буфер для обратной транскриптазы, эквимолярную смесь четырх dNTP по 500 мкМ каждого, 1 мкМ смеси случайных праймеров и 25 единиц ингибитора РНКаз. Перед добавлением в инкубационную смесь РНК со случайными праймерами (фирмы «Syntol», Москва) отжигали в течение 5 мин при 70C на амплификаторе MJMini BioRad (США), Реакцию проводили в течение 1 часа при 37C. ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 1 мкл синтезированной кДНК, 1,5 единицы Taq-полимеразы, однократный ПЦР-буфер для Taq-полимеразы, эквимолярную смесь четырх dNTP по 200 мкМ каждого, по 50 пМ каждого из пары специфических праймеров и каплю минерального масла. Подбор праймеров осуществляли по программе «Gene Runner 3.0», Primer-BLAST. Последовательности использованных праймеров приведены в таблице 2.1. Праймеры синтезированы коммерческой фирмой «Syntol» (Москва).
Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводили в 1,4%-м агарозном геле, приготовленном на TBE-буфере, pH 8.0, который окрашивали бромистым этидием (Sambrook et al., 1989). В качестве маркеров использовали набор из 10 фрагментов ДНК с шагом 100 н. п. от 100 до 1000 н. п. Просмотр геля осуществляли сразу же после электрофореза с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировали с помощью цифровой камеры (Рисунок 2.1). Для полуколичественной характеристики экспрессии исследуемых генов использовали соотношение между квазистационарным уровнем мРНК данного гена и мРНК -актина, который экспрессируется во всех тканях и органах организма так, что доля его мРНК в тотальной мРНК примерно одинакова (Marone et al., 2001). Для кДНК всех использованных генов определяли количество циклов насыщения при ПЦР и в дальнейших экспериментах проводили количество циклов, не достигающее насыщения . Измеренную программой Scion Image интенсивность электрофоретических зон -актина, полученных при электрофорезе в 1,4% агарозе и окрашенных бромистым этидием, брали в качестве нормировки для исследуемого гена.
Исследование влияния хлорида серебра на метаболизм меди в течение постнатального периода развития
Для формирования групп крыс, получавших серебро с пищей с первого дня жизни, было проверено, поступает ли серебро в молоко крыс, и изменяется ли у новорожденных статус меди. Исследование было проведено на 10-дневных крысах, вскармливаемых самками, в корм которых с первого дня лактации добавляли AgCl (Ag-N10-крысы). К 10-ому дню жизни Ag-N10 крысы не отличались по показателям физического развития (появление шерстного покрова, вставание, вращение хвостом, отлипание ушной раковины) от своих контрольных ровесников. Результаты, представленные на рисунке 3.9, показывают, что у Ag-N10 крыс серебро попадает в кровоток, аккумулируется преимущественно в печени и в незначительных количествах обнаруживается в мозге. При этом существенных изменений в концентрации меди не происходит. В это время серебро, как и медь, выводится с мочой. Содержание оксидазного ЦП в сыворотке крови Ag-N10-крыс снижается, при этом уровень иммунореактивного ЦП не меняется. У Ag-самок также развивается дефицит меди, ассоциированный с ЦП: уровень оксидазного ЦП в крови снижается, но в кровотоке обнаруживаются иммунореактивные полипептиды ЦП. Данные показывают, что новорожденные, вскормленные Ag-самками, получают ионы серебра.
На втором этапе были сформированы 4 группы крыс (Рисунок 3.1). Группа
1 включала крыс, которые родились в виварии НИИЭМ одновременно с крысами, взятыми в экспериментальные группы, их использовали в качестве контроля как крыс того же возраста, содержавшихся в тех же условиях. Группу
2 составили крысы, вскормленные самками, получавшими Ag-диету с первого дня лактации (Ag-самки); в возрасте 23 дней крысы были переведены на стандартный корм (дефицит ионов меди только в период молочного вскармливания до месячного возраста). Группа 3 была образована из крыс, которых перевели на Ag-диету после окончания периода молочного вскармливания (дефицит меди после снижения концентрации меди в печени). Группа 4 была создана из крыс, которых вскармливали Ag-самки и после этого их переводили на Ag-диету.
У животных всех четырех групп была прослежена динамика действия ионов серебра на оксидазную активность ЦП (Рисунок 3.10). Полученные данные показывают, что по отношению к контрольной группе оксидазная активность в сыворотке крови крыс групп 3 и 4 была примерно в два раза ниже.
Измерения концентрации меди в органах крыс показали, что после перехода на взрослый тип метаболизма меди, ее концентрация в печени у животных всех групп резко падает и остается на низком уровне (Рисунок 3.11). В мозге концентрация меди растет примерно до половозрелого возраста и одинакова у животных всех групп. Накопление серебра в течение всего эксперимента продолжается и в печени и в мозге. Однако концентрация серебра в мозге в 10 раз меньше, чем в печени. Ось абсцисс: возраст, дни; ось ординат: концентрация меди или серебра, мкг/г сырого веса ткани. – группа 1; – группа 2; – группа 3; - группа 4. :p 0.01 по сравнению с группой 1.
Визуальное наблюдение за поведением животных (подвижность, прием пищи, отношения внутри группы) также не обнаружило никаких особенностей. Случаи смерти и каннибализма не зафиксированы. Вес, а также индекс «масса тела/масса органов» у крыс групп 3 и 4, по сравнению с их ровесниками из групп 1 и 2, не отличается (Рисунок 3.12).
А - Вес тела, г. Б - Индекс масса тела к массе органов. По шкале отложено отношение массы тела к массе органа. Столбики: белые – группа 1, светло-серые – группа 2, темно-серые – группа 3, заштрихованные – группа 4.
Репродуктивная функция у Ag-N180 крыс проявляется в том же возрасте, что и в контрольной группе животных (60-70 дней жизни). Они производят жизнеспособное потомство, однако число особей в помете в среднем в 2-3 раза ниже, чем у контрольных крыс (Рисунок 3.13).
Важно, что согласно ранее полученным в нашем Отделе данным, содержание самок на Ag-диете в течение всего срока беременности приводит к развитию аномалий у эмбрионов, пренатальной смерти или к 100% смерти новорожденных животных в первые сутки жизни (Шавловский и др., 1995).
Психо-эмоциональное состояние исследуемых крыс оценивали с помощью физиологических тестов «Открытое поле» и «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ).
В тесте «открытое поле» существенных различий в психо-эмоциональном состоянии животных, получавших с пищей серебро, по сравнению с контролем, не отмечено (Рисунок 3.14). Отсутствие у Ag-животных дефекации свидетельствует о низком уровне тревожности.
Сравнительная характеристика частично очищенных препаратов церулоплазмина из сыворотки крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс
Из сыворотки крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс методом ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе были получены препараты частично очищенного ЦП. По данным нативного электрофореза ЦП является основной фракцией этих препаратов (Рисунок 3.37, А (а), Б (а)). Мажорная фракция ЦП из сыворотки Ag-A30 крыс элюировалась при концентрации NaCl 200 и 250 мМ. При этом, профиль элюции совпадал с таковым для холо-ЦП из сыворотки контрольных крыс (Рисунок 3.37, А (б)). Большая часть ЦП из сыворотки Ag-N180 крыс элюировалась 100 и 150 мМ NaCl (Рисунок 3.37, Б (б)). В обоих препаратах методом иммуноблотинга выявлены две формы ЦП, отличающиеся по электрофоретической подвижности (Рисунок 3.37, А (б), Б (б)), но имеющие одинаковую молекулярную массу (Рисунок 3.37, А (в), Б (в)). Материал из основных фракций препаратов проявлял оксидазную и ферроксидазную активности (Рисунок 3.37, А (г, д), Б (г, д)). ЦП обеих экспериментальных групп содержал медь и серебро. Общее содержание металла на молекулу ЦП составляло примерно 5 – 6 атомов. Однако содержание Ag в молекуле ЦП Ag-A30 было приблизительно в 3 раза выше, чем у Ag-N180 крыс (Рисунок 3.37, В и Г). Интересно, что через 15 дней Ag-диеты в ЦП можно насчитать до 7 атомов на молекулу ЦП, а после 30 дней Ag-диеты – 4-5. Этот эффект можно отнести к тому, что к 30 дню обработки серебром (Т1/2 ЦП крысы равна 5 дням), возможно, происходит регуляция его абсорбции в ЖКТ.
По результатам иммуноблотинга были отобраны пробы с самой высокой концентрацией церулоплазмина: фракция 3 (Рисунок 3.37, А (в)) и фракция 1 (Рисунок 3.37, Б (в)). Они были использованы для исследований с помощью спектроскопии поглощения и кругового дихроизма (КД) (Рисунок 3.37).
Пунктирными линиями приведены спектры аналогичных препаратов холо-ЦП. Спектры поглощения отнесены к поглощению равному единице при длине волны 280 нм.
Препараты ЦП, полученные из сыворотки обеих групп Ag-крыс характеризуются сильным снижением поглощения в полосе 610 нм и дублета в спектре КД в области 400-700 нм, характерных для меди спектрального типа I (голубой меди). Соотношение А610/А280 в препарате ЦП Ag-N180 крыс составило 10% от соответствующего значения (0.045) для высокоочищенного ЦП, тем не менее, полоса поглощения 610 нм видна четко и имеет ту же характерную форму, что и полоса холо-ЦП. Также достоверно регистрируется отрицательная полуволна дублета в спектре КД (450 нм), значение КД в этой полосе также составляет 10% от соответствующего значения КД для холо-ЦП. Соотношение А610/А280 для препарата ЦП Ag-A30 крыс низкое и соответствует 1-3% от этого значения для холо-ЦП. Более точное количественное определение А610 было в этом случае невозможно, поскольку поглощение в соответствующей полосе было очень слабым, форма полосы просматривалась недостаточно хорошо для однозначного разделения наблюдаемой оптической плотности в области 500-900 нм на рассеяние и поглощение. Круговой дихроизм этого образца в видимой области ниже предела обнаружения. Образцы ЦП из сыворотки Ag-крыс обладали увеличенным поглощением в области 310-330 нм, которое отсутствовало в спектре холо-ЦП и в спектрах возможных примесей (гемоглобин). В ЦП из Ag-A30 это поглощение было более выраженным. Спектр КД ЦП из Ag-A30 в ближней ультрафиолетовой области сильно отличается от спектров холо-ЦП и напоминает спектры частично-денатурированных состояний ЦП (Noyer & Putnam, 1981), с характерным положительным КД при 260 нм и отсутствием отрицательного пика при 280 нм. Спектр КД ЦП из Ag-N180 напоминал спектр белка из Ag-A30, однако слегка сдвинут в сторону спектра холо-ЦП. Тем не менее, не удалось смоделировать данный спектр линейной комбинацией спектров ЦП Ag-A30 и холо-ЦП, поэтому можно заключить, что ЦП из Ag-N180 крыс не является смесью ЦП Ag-A30 с дополнительным количеством холо-ЦП, а представляет собой спектрально-различный объект. Спектры КД в дальней ультрафиолетовой области также поддерживают это заключение. Предсказание вторичной структуры по спектрам КД в дальней ультрафиолетовой области осуществляли с помощью программы CDNN с расчетом удельного КД по общей концентрации белка. Тем не менее, поскольку большая часть белка соответствующих препаратов представлена ЦП, а наблюдаемые спектральные изменения достаточно велики, то они могли быть обусловлены только значительным изменением вторичной структуры ЦП. По вторичной структуре ЦП Ag-A30 существенно отличается от холо-ЦП. По данным КД он содержит 20% -спирали, 30% -структур, 50% неупорядоченных а.о. структур. Для сравнения, холо-ЦП содержит 12% , 57% , 33% неупорядоченных а.о. . Спектр КД ЦП Ag-N180 и предсказанное содержание элементов вторичной структуры (12% , 47% , 41% неупорядоченных а.о.) занимают промежуточное положение между соответствующими характеристиками ЦП Ag-A30 и холо-ЦП. Это означает, что образец ЦП Ag-N180 содержит больше молекул с -складчатой структурой, характерной для холо-ЦП. На основании спектров видимого диапазона, образец ЦП Ag-N180 условно можно было бы рассматривать как смесь «голубого» холо-ЦП и «бесцветного» ЦП Ag-A30 в соотношении 1:10 - 1:8. Однако спектры образца ЦП Ag-N180, полученные в ультрафиолетовой области, не поддерживают это упрощенное предположение, так как препарат ЦП Ag-N180 содержит значительно меньше неупорядоченной структуры, чем гипотетическая смесь 1:10. Поэтому, следует признать, что фракции ЦП сыворотки Ag-A30 и Ag-N180 крыс содержат молекулы ЦП разной конформации. Препарат ЦП Ag-N180, очевидно, содержит большее количество молекул ЦП с правильно сформированным сайтом связывания меди типа I, что согласуется с увеличением содержания меди, а также оксидазной и ферроксидазной активностей в сыворотках Ag-N180 крыс. Тем не менее, остальные молекулы ЦП (которые не поглощают при 610 нм, содержат атомы серебра и/или неполное количество атомов меди и, скорее всего, лишены ферментативной активности) у Ag-N180 и Ag-A30 крыс различны.
