Введение к работе
Актуальность проблемы. Сокращение и расслабление гладких мышц (Ш) лежит в основе функционирования желудочно-кишечного тракта, матки, кровеносных и лимфатических сосудов, мочевого пу~ ' зыря, мочеточников, сфинктера зрачка глаза, протоков желез внешней и внутренней секреции. Ионам кальция принадлежит существенное значение в активации сокращения гладко-мышечных клеток (ШК). В Ш Саг* является эффектором специфических белков (кальмодулнна, леи-отошша), ігадуцирувдих контрактильный ответ /Яопошига , вьозм , 1980; Marstea , 1982; Данилова, 1985/. Доказано, что при возбуждении гладкомышечной ткани увеличение концентрации Са в миоци-тах происходит преимущественно за счет внеклеточного пула катиона. С помощью элактрофизиологических подходов получена важная информация о путях и механизмах поступления Са в ШК, закономерностях слектро- и фармакомеханического сопряжения в Ш /Bolton ,-1979; Щуба, 1981; Шуба, Бурчи, 1984; Loutzenhiser et al., 1985/.
ІЛеяду тем» к началу выполнения диссертационной работы (1979 г.) сведения о биохишческях механизмах, регулируыцих уровень внутриклеточной концентрации Са в гладкомышечной ткаїга, практически отсутствовали. Впоследствии появились неоднозначіше данные, указшэавдие на возможную роль сарколеммы различных ГМ в реализации АТР- и Яа+-зааисимого переноса Са из миоцитов в межклеточное пространство /Астапова, Попкова, 1980; Grover at al, , 1981; Daniel at al. , 1982; Grover at al. , 1984, 1935; Po-pescu at al., 1986; Sakal at al. , I98S/. Что же касается сарко-плазматического ретикулума (СР), митохондрий (MX) и ядер, то в литературе нет единого мнения о значении этих внутриклеточных структур в кальциевом обмене в ГМ /Popescu at al. , 1974; Ra-eymaekers at al. , 1977; Carsten, Miller , 1980; Batra , I982;Carstca, Miller , 1985/. В целом зке существущие предота-вления о оиотемах активного транспорта Са в Ш, свойствах этих систем, их участии в поддержании кальциевого і^меоотаза в мио-плазме весьма противоречивы. Не проведена количественная оценка вклада отдельных механизмов трансмембранного переноса Са в обеспечение сокращения и расслабления ГМК. Это является существенным препятствием в поисках эффективных регуляторов уровня Са * в клетках гладкомышечной ткани. Поэтому назрела настоятельная потребность систематического изучения механизмов энергозависимой
транслокации Са в IM, идентификации вклада Са -транспортирующих систем в регуляцию концентрации этого катиона в ШК.
Среди Ш особое положение занимает миометрий, что обусловлено, в частности, той особой функцией, которую матка выполняет в организма. В соответствии с данными световой и электронной микроскопии миометрий - один из наиболее подходящих объектов, который можно использовать для выделения фракций субклеточных структур .III : содержание собственно гладкошшечной ткани в нем весьма высоко (более 90) /Daniel et el. , I977;Janie et al. , 1977; Matlib et al. , I979;Grover et al. , 1980/.
Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в выяснении биохимических механизмов регуляции внутриклеточной концентрация кальция в ПІ матки. Решались следуодие задачи.
-
Поиск систем активного и пассивного транспорта Са во фракциях субклеточных структур миометрия.
-
Изучение свойств этих систем.
-
Исследование вклада Са -транспортирующих систем в регуляцию концентрации этого катиона в клетках миометрия.
Научная новизна раб-тн. Впервые проведено систематическое исследование биохимических механизмов, лежащих в основе кальциевого гомеостаза в Ш, идентифицирован вклад отдельных Са -транспортирующих систем в регуляцию концентрации катиона в ШК матки.
Основными внутриклеточными депо кальция в миометрии являются ядра и MX. В ІЇЛ матки существует три пула кальция, различающиеся значением характеристических времен обмена, что свидетельствует о множественности механизмов, вовлеченных в обеспечение
кальциевого гомеостаза в миоцитах.
2+ Бо фракции Ш ШК идентифицирована система Мдг ,АТР-зависи-
мого транспорта Са , обладающая высоким сродством к субстрату переноса (Km = 0,3 - 0,5 мкМ). Подробно изучены кинетические свойства MOj ,Са +-АТРазы и Са -транспортирующей системы сарколеммы. Окситоцин, сигетнн, ионы двухвалентных металлов - факторы, способствуйте усилению сократительной активности миометрия, ин~ гибировали кальциевый насоо Ш ІМК. Этот насос вполне способен скомпенсировать входящий в невозбувденные ШК медленный диффузионный базальний поток.Са + и стационарно поддерживать концентрацию катиона в миоплазме на физиологическом уровне (10 - 10 М). Система Mq "^-независимого АТР-зависимого транспорта Са2+ в cap-
колемме ыиометрия отсутствует. Оксалат нэ стимулировал Ма2+,АТР-зависимое накопление Са в интегральной фракции ыикросом (ІЛС), кофеші не влиял на кальциевый обмен в этой фракции. АТР-зависимая аккумуляция Са во фракции ядер шометрия не виявлена.
В Ш клеток мпометрия существует система На - Са"'*' обмана, характеризующаяся обратимостью, насыщаемостью по субстратам переноса, низким сродством к Са2+ (Km = AD - ВО мнШ. Активность об-менника не регулируется мембранным потенциалом (система "К+~нали-номхщип"). Обмошшк обеспечивает вывод Са + из мпоцитов при боль-пнх концентрациях катиона в миоплазме (^1б" М), предотвращая нарушение кальциевого гомеостаза в ПЖ при возбуждении.
Найдено, что MX ыдометрая обладают способностью аккумулиро-вать Са + в экергозависимом процессе (величина Кт по Са + -4-6 wi&). В расчете на I г массы влажной ткани максимальная ак-тавность Са-транспортирующей системи MX в 30 раз больше, чем кальциевого насоса Ш. На+ - Са + обмен в MX миометрпя отсутствует. Активный и пассивный транспорт Са в MX Ш регулируется величиной рН среды инкубации.
Установлено, что в основе траксмембранного выхода свободного кальция из везикул Ш ПЖ лежит его простая диффузия, тоздествзн-ная медленному базальному входу этого катиона в невозбудденные мисцпты. Проведенный анализ указывает на то, что в реальных условиях этот вход Са непосредственно не вовлечен в оперативный контроль сократительной активности ПЖ, но он мопет вносить вклак в обеспечение базального тонуса ІТ.1-.
В Ш клеток мяометрия вдентифшдировапа такке система электровозбудимой кальциевой проницаемости. Деполяризация Ш стимулирует выход Са из везикул сарколеммы. Концентрационная зависимость потенцяалочувствительной компоненты пассивного транспорта Са^+ описывается кривой, характеризующейся насыщением по субстрату переноса (Кт я 0,5 1-М). Эта компонента подавляется Д-600, Со , Мп*+. Кинетический анализ свидетельствует о том, что она тождественна стационарной (неинактипирунцейся) составляющей входящего в ШК при деполяризации Ш кальциевого тока, обеспечивающей активацию тонического сокращения ІЇ.1.
Изучен механизм регуляции концентрации Са в миоцитах матки.' Кинетический анализ механизма приводит к физиологически значимой величине времени снижения концентрации Са2+ в Бсзбудцешшх
ГМК (~18 сек).
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований являются основой для разработки методов коррекции патологий контрактильной активности миометрия, причина которых кроется в нарушении внутриклеточного гомеостазе Са . Полученные данные служат обоснованием использования препаратов"окситоцдна, сигетина, а также ионов двухвалентных металлов в акушерско-гпне-кологической практике как факторов усиления сократительной активности матки. Результаты, касавдиеся динамических закономерностей кальциевого обмена в ГМ, использовались автором при чтешш курса лекций "Биохимическая кинетика" на кафедре биохимии Киевского государственного университета им.Т.Г.Шевченко (1979-1985 гг.). По материалам исследований в 1987 г. опубликована в соавторстве монография "Регуляция внутриклеточной концентрации кальция в мышцах", Киев, изд-во "Наукова думка", 144 с.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на У Всесоюзном биохимическом съезде, I Всесоюзном биофизическом съезде, ІУ и У Всесоюзных конференциях по биохимии мышц, I'll Всесоюзном симпозиуме по биофизике и биохимии мышечного сокращения, ІХ-ПІ Всесоюзных совещаниях по транспортным АТРазам, I Региональной школе республик Средней Азии и Казахстана по биологическим мембранам, ІУ Украинском биохимическом съезде, Республиканской научной конференции "Биохимия-медицине", УІІ объединенном симпозиуме биохимических обществ ГДР и ССОР (Лейпциг, 1983), III и ІУ международных симпозиумах по физиологии и фармакологии гладких мышц (Варна, 1982, 1985), научном семинаре отдела биохимии мышц и нервной системы Института экспериментальной биологии им. М.Ненпкого (Варшава, 1985), совместной конференции научных работников ГДР и СССР - выпускников кафедры биофизики Киевского г
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы" (3 главы), "Экспериментальная часть" (7 глав), "Заключение", "Выводы", а также списка использо-
