Введение к работе
Актуальность проблемы. Синтез АТР в митохондриях осуществляется сложным полипептидным комплексом F,-F0 АТРазой (Н+-АТРсинтетазой). Источником энергии для образования ^"ФсФангиДРиДнои связи в АТР служит градиент концентрации протонов (Д^|+) по разные стороны внутренней мембраны митохондрий, - создаваемый при функционировании дыхательной цепи. Реакция Лри+-зависимого синтеза АТР уникальна, так как в результате её осуществляется сопряжение векторного процесса переноса заряженной частицы и скалярной реакции синтеза кова-лентной связи. Механизм сопряжения этих процессов не установлен. Для F,-F0 АТРазы характерно наличие гистерезисного поведения, связанного с процессами медленной деактивации/активации. Группой А.Д. Виноградова было показано, что гистерезисное поведение Fj-F0 АТРазы обусловлено связыванием (в присутствии ионов магния) продукта реакции гидролиза АТР - аденозиндифосфата в центре с высоким сродством (Kd=2*10"8 М) [Fitin A.F. et al., 1979; Vasilyeva E.A. et al., 1982]. Было также показано, что для проявления торможения АТРазной активности аденозиндифосфатом необходимо насыщение Мд2+-связывающего центра [Bulygin V.V., Vinogradov A.D., 1992]. К настоящему времени в изучении F4-АТРазы сложилась парадоксальная ситуация: недавно стала известной трехмерная структура фермента с молекулярной массой _3б0 кДа [Abrahams 3.Р. et al., 1994], тогда как природа субстрата реакции (АТР, или Мд:АТР, или АТР и Мд2* ) остаётся невыясненной, а выводы, опубликованные в десятках работ на эту тему, выполненных в разных лабораториях, часто прямо противоречат друг другу. Большинство авторов, исследовавших кинетический механизм реакции гидролиза АТР, не учитывали возможность искажения кинетических данных из-за гистерезисных эффектов [напр., В.К. Акименко и соавт., 1972; Fleury В. et al., 1980]. К настоящему времени возникла необходимость заново исследовать кинетический механизм взаимодействия F( -F0 АТРазы с нуклеотидами и ионом магния в ходе каталитического цикла с учетом накопленных знаний о гистерезисном поведении фермента. Это и было осуществлено в настоящей работе. Детальный кинетический анализ реакции гидролиза АТР, на наш взгляд, служит минимальной предпосылкой, необходимой для решения вопроса о механизме сопряжения процессов гидролиза АТР с трансмембранным переносом протонов.
Принцип микрообратимосги ферментативных реакций является общеп-
ринятым. Однако подробное изучение гистерезисного поведения АТРазь в нашей группе привело к возникновению гипотезы о неидентичності путей синтеза и гидролиза АТР [А.Д. Виноградов, 1980] . Сравнительный анализ кинетики реакций гидролиза и синтеза АТР в идентичны} условиях (с точностью до-природы субсграта-нуклеотида), по нашем> мнению, позволит доказать или опровергнуть эту гипотезу.
Цель работы состояла в кинетическом анализе системы ( F,-F0 АТ-Раза (в составе субмитохондриальных частиц) /АТР/Мд2+} с учетом накопленного фактического материала по механизму Mgz +-зависимого ин-гибирования АТРазной реакции ее продуктом, ADP. Для было необходимо: 1) установить природу равновесной формы АТР, являющейся истинным субстратом АТРазы; 2) установить кинетический механизм реакции гидролиза АТР; 3) выяснить, ингибируют ли первую, азид-нечувствительную фазу, реакции (и каков механизм торможения) свободный Mg2+, свободный АТР и продукт реакции гидролиза - ADP; 4) выяснить способна ли Ft-F0 АТРаза, стабилизированная в неактивном состоянии, катализировать синтез АТР.
Научная новизна работы. Показано, что помимо истинного субстрата - комплекса Мд:АТР, для осуществления реакции гидролиза АТР, катализируемой митохондриальной Fj-F0 АТРазой, необходим активатор -свободный ион магния. Кт по Mgz* составляет 10 мкМ ( рН=7.4; 25С; ионная сила - 0.1 мМ). Установлено, что взаимодействие F,-F0 АТРазь. с субстратом - комплексом Мд:АТР и активатором - свободным Мд * описывается кинетически упорядоченным механизмом би-би, пинг-понг, в котором свободный Mgz+ вступает в реакцию в качестве активатора после освобождения одного из продуктов гидролиза (скорее всего, неорганического фосфата). Обнаружена сильная рН-зависимость скорости гидролиза АТР Fj-F0 АТРазой с кажущейся рКа около 7.4 в условиях, когда Мд2+-связывающий центр не насыщен катионом-активатором. Эта зависимость обусловлена конкуренцией протона и иона Мд * за Me2+-связывающий центр. Показано, что свободный ADP тормозит начальные скорости АТРазной реакции по конкурентному механизму. Впервые показано, что стабилизированная азидом неактивная АТРаза способна катализировать синтез АТР. Предложена гипотеза о сопряжении реакции гидролиза АТР и начальных стадий векторного переноса протона, где ключевая роль отводится взаимодействию Fj-F0 АТРазы со свободным ионом магния.
Практическая значимость работы. Полученные в работе экспериментальные данные о кинетическом механизме реакции гидролиза АТР необходимы для решения основного вопроса биоэнергетики - механизма сопряжения процессов векторного переноса заряженной частицы (протона) и скалярной реакции образования фосфоангидридной связи в молекуле АТР. Полученные результаты расширяют фундаментальные представления о механизме катализа реакций гистерезисными ферментами. Результаты работы используются в лекциях для студентов биологического факультета и на занятиях по ферментативной кинетике со студентами-биохимиками .
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на заседаниях кафедры биохимии биологического факультета МГУ в 1993 и 1994 годах , на российско-германском симпозиуме по мембранной биологии (1994 г., Оснабрюк, ФРГ) и на международной конференции по мембранной биоэнергетике (1995 г., Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы.
объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на ... стр. машинописного текста, включая 20 рис. и 3 схемы. Библиография включает 2.. наименований .
В качестве препарата F, -F0 АТРазы использовали субмитохондри-альные частицы (AS-СМЧ), полученные по принятому в нашей лаборатории методу [Kotlyar А.В. and Vinogradov A.D., 1990].
Для регистрации начальных скоростей реакции (активация АТРазы) AS-СМЧ (5-10 мг/мл) перед началом всех опытов инкубировали в среде, содержащей (конечные концентрации): 0.25 М сахарозу; 100 мМ КС1; 10 мМ HEPES/K0H, рН=7.4; 5 мМ фосфат калия; 50 мкМ ЭДТА в течении 1 часа при комнатной температуре [Yalamova M.V. et al., 1982; Bulygin V.V. and Vinogradov A.D., 1991]. Для измерения скоростей "сопряженной" АТРазы или синтеза АТР среда преинкубации AS-СМЧ содержала дополнительно следующие компоненты: 1 мМ малонат (для активации сук-цинатдегидрогеназы), бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) и олиго-мицин (0.25 нмоль/мг белка СМЧ).
Измерение АТРазной активности AS-СМЧ. При высоких концентрация) иона Мд2+ (100 мкМ и выше) реакцию гидролиза регистрировали спект-рофогометрически по убыли концентрации NADH (Сзі0=6.22 mM'^cm-1), АТРазную активность определяли при t=25C. Стандартная среда содержала следующие компонентны: 0.25 М сахарозу; 100 мМ КС1; 10 Mf Hepes/KOH, рН=7.4; 1,5 мМ фосфоенолпируват; 200 мкМ NADH; МдС12; АТР; пируваткиназу (12 ФЕ/мл); лактатдегидрогеназу (10 ФЕ/мл); мкМ ротенон; 4 мкМ С1ССР. Реакцию начинали добавлением AS-СМЧ (15 -25 мкг/мл). При концентрации свободного Мдг+ в среде менее 100 пкі АТРазную активность измеряли по выделению "стехиометрического" протона [Chance В., Nishimura М., 1968] используя рН-индикатор феноловый красный [Е.А. Васильева и соавт., 1989]: Среда измерения активности содержала те же компоненты (+30 мкМ феноловый красный), чтс и в первом варианте, за исключением пируваткинаэы и лактагдегидро-геназы. Реакцию начинали добавлением AS-СМЧ (30 - 50 мкг/мл). Регистрировали уменьшение оптической плотности в двуволновом режиме, ^А557"АА620- Гидролиз АТР прекращали добавлением олигомицина (1; нМ). АТРазная активность во всех опытах была чувствительна к олиго-мицину более, чем на 90. Шкалу прибора титровали стандартным раствором НС1. В каждой пробе определяли коэффициент А[Н+]/A[ADP [Chance В., Nishimura М., 1968]. Для этого меняли режим измерения ( двуволнового на двулучевой (Х,=340 нм), в кювету вносили избыто! MgCl2, пируваткиназу и лактатдегидрогеназу. По убыли концентрациі NADH определяли концентрацию образовавшегося в пробе ADP.
Определение аналитических и равновесных концентраций ионов маг ния и АТР. Б работе оперировали величинами как аналитических кон центраций АТР и Mgz + ([ATP]t и [Mg2+]t) так и равновесных концент раций свободного Mg2 +([Мд2*]f), комплекса иона магния с ATI ([Мд:АТР]) и свободного АТР ([ATP]f), Используя значения анали тических концентраций компонентов и констант диссоциации комплексої Mg:ATP и Mg:ADP, рассчитывали равновесные концентрации всех компо нентов. Концентрацию исходного (концентрированного) раствора ATI определяли спектрофотометрически либо по поглощению при Хтах=25' нм, тах=15.4 мМ"'*см"', либо по количеству NADPH, образованного системе, содержащей 5 мМ глюкозу, 1.5 MM NADP*, 30 ФЕ/мл гексокина зы и 10 ФЕ/мл глюкозо-6-фосфагдегидрогеназы. Концентрацию раствор. МдС1г определяли методом комплексонометрического титрования в ще лочных условиях (рН>10) в присутствии мегаллохромного индикатора Эриохрома черного Т.
- 5 -Константу диссоциации комплекса Mg:ATP определяли в условиях, использованных для измерения АТРазной активности (температура, рН, ионная сила), с помощью Мд2*-специфичного металлохромного индикатора Эриохрома голубого (Плазмокорин В) [Scarpa А., 1974]. Полученная величина оказалась равной 1*10"4 М, что совпадает с данными других авторов, проводивших определение в сходных по ионной силе (0.1 мМ) и температуре (25С) условиях [Bock R.M., I960; Shikama R., 1971; Frey СМ. et al. , 1972] .
При проведении ряда опытов среда содержала помимо АТР второй комплексон для иона магния: ЭДТА или цитрат. Расчет равновесных концентраций в этом случае проводили на персональном компьютере, применяя численный метод решения уравнений (программа GIM, Version 2.0, copyright by A.Drachev):
K,3*x/([ATP]t-X) + X + [L]t/(1+ KL*([ATP]t-x)/(Kd*x)) - [Mg2t]t=0,
где x=[Mg:ATP], [L]t - аналитическая концентрация комплексона, a KL - константа диссоциации комплекса Mgz+ с данным лигандом. Значения констант диссоциации комплексов Мд2+ с ЭДТА и цитратом принимали равными (при рН=7.4) 0.0016 мМ и 0.25 мМ, соответственно [Р. Досон и соавт., 1991]. Описанный подход применяли и для расчета равновесных концентраций в системе, содержащей АТР, ADP и Mg2+. Константу диссоциации комплекса Mg:ADP принимали равной 1 нМ [Shikama R., 1971].
Удаление из реактивов примесных двухвалентных катионов. Очистку концентрированного раствора АТР и реакционной среды в тех экспериментах, когда отсутствовал ЭДТА- или цитратный буфер по Мд2*, проводили с помощью комплексообразующего катионообменника CHELEX-100. Смолу предварительно переводили в калиевую форму.
Концентрацию белка в препарате СМЧ определяли с биуретовым реактивом [Cornall et al., 1949], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
