Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Высшие водные растения 11
1.1.1. Роль высших водных растений в процессах самоочищения воды 12
1.1.2. Использование высших водных растений в технологиях очистки сточных вод и загрязненных объектов 19
1.2. Перифитон 22
1.2.1. Понятие перифитона 22
1.2.2. Этапы формирования перифитонного биоценоза 23
1.2.3. Количественный и качественный состав перифитона 25
1.2.4. Роль перифитона в процессах самоочищения воды 30
1.2.5. Механизмы взаимодействия высших водных растений с микроорганизмами перифитона 36
1.3. Характеристика водорастворимой фракции нефти 39
1.3.1. Качественный и количественный состав водорастворимой фракции нефти 40
1.3.2. Токсичность водорастворимой фракции нефти 42
Глава 2. Материалы и методы 44
Глава 3. Влияние нефти на растительно-микробную ассоциацию 55
3.1. Сырая нефть 55
3.1.1. Влияние сырой нефти на рост и развитие элодеи канадской 55
3.1.2. Влияние сырой нефти на микроорганизмы 58
3.2. Водорастворимая фракция нефти 61
3.2.1. Получение водорастворимой фракции нефти 61
3.2.2. Влияние водорастворимой фракции нефти на водные микроорганизмы 73
3.2.3. Влияние водорастворимой фракции нефти иа элодею 65
Глава 4. Деструктивная активность водной растительно-микробной ассоциации по отношению к углеводородам нефти
4.1. Деструкция сырой нефти 67
4.1.1. Изучение биологических свойств перифитонных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти
4.1.2. Деструкция сырой нефти перифитонными микроорганизмами 72
4.1.3. Влияние элодеи на деструкцию сырой нефти 74
4.1.4. Деструктивная активность растительно-микробной ассоциации 76
4.1.5. Фракционный анализ нефтепродуктов 78
4.2. Деструкция водорастворимой фракции нефти 82
4.2.1. Влияние элодеи на деструкцию водорастворимой фракции нефти 82
4.2.2. Спектр деструктивной активности выделенных штаммов 84
4.2.3. Биодеградация фенола 86
4.2.4. Биодеградация толуола 91
4.2.5. Биодеградация бензола 95
4.2.6. Биодеградация полициклических ароматических углеводородов 98 4.2.7..Биодеградация декалина 103
4.3. Активность ферментов элодеи, ответственных за окисление ароматических соединений 108
Глава 5. Экологические взаимодействия элодеи с микроорганизмами 111
5.1. Исследование антибактериальной активности элодеи 111
5.2. Определение ИУК-синтезирующей активности перифитонных микроорганизмов
5.3. Фиксация атмосферного азота перифитонными микроорганизмами 121
5.4. Хемотаксис перифитонных микроорганизмов 122
Заключение 125
Выводы 138
Список литературных источников 140
Приложение 180
- Использование высших водных растений в технологиях очистки сточных вод и загрязненных объектов
- Влияние сырой нефти на микроорганизмы
- Деструкция сырой нефти перифитонными микроорганизмами
- Определение ИУК-синтезирующей активности перифитонных микроорганизмов
Введение к работе
Существование всех форм жизни связано с водой, поэтому загрязнение водных источников несет в себе угрозу существованию живой природы и, в первую очередь, человеку. Парадокс заключается в том, что основной ущерб окружающей среде наносит именно человек. В настоящее время нефть - самый распространенный поллютант, загрязняющий природные воды. Только в Мировой океан ежегодно поступает 11-16 млн. тонн нефти.
Основной вклад в загрязнение водных объектов нефтепродуктами вносят залповые поступления нефти в результате аварий на трубопроводах и нефтеналивных судах, сброс нефтесодержащих сточных вод промышленными предприятиями, смыв нефтепродуктов с производственных площадок, улиц и нефтедобывающих районов. Те водоемы, которые не справляются с поступающим объемом загрязнений, деградируют. В них процессы самоочищения тормозятся или прекращаются из-за деградации очищающей биоты.
Под самоочищением природных вод принято понимать совокупность химико-биологических процессов, направленных на восстановление первоначальных свойств и состава воды /1/. Самоочищение не может устранять любое загрязнение; каждый водоем имеет определенный предел самоочищающей способности, зависящий от ряда физико-химических факторов: режима реки, содержания в воде кислорода, температуры, наличия токсических веществ и их концентрации, рН, видового состава /2, 3, 4/.
Поскольку в самоочищении воды участвуют бактерии, грибы, водоросли, высшие водные растения, простейшие и другие гидробиоыты, важную роль приобретают исследования каждого компонента в отдельности и их взаимосвязей.
Наиболее активно разрушают поллютанты микроорганизмы, в частности перифитон. Бактериальный перифитон легко адаптируется к особенностям окружающей среды, значительно лучше переносит неблагоприятные условия, в сравнении с другими гидробионтами, обладает потенциально высокой деструктивной активностью.
Участие высших водных растений, в том числе элодеи канадской (Elodea canadensis), в самоочищении водоемов хорошо известно /5-7/. Они поглощают тяжелые металлы и радионуклиды, биогенные элементы, ароматические соединения и цианиды. Основная роль высших водных растений раньше сводилась лишь к поглощению и накоплению токсикантов, а также функции механического и трофического субстрата для микроорганизмов. Затем появились сведения о фитотрансформации ксенобиотиков ферментными системами водных растений /8-12/.
Таким образом, при ведущей роли водных микроорганизмов и растений в процессах деградации ксенобиотиков имеет место нехватка сведений о реальных механизмах взаимоотношений. Последние могут иметь как фундаментальное значение, так и явиться основой для создания биотехнологичеких процессов очистки и восстановления водоемов.
Цель работы — исследование деструктивного и ассоциативного потенциала водного растительно-микробного сообщества, образованного элодеей канадской, для выявления его роли в процессах самоочищения водоемов от нефти.
В ходе достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Оценить взаимовлияние элодеи канадской, водных микроорганизмов и углеводородов нефти.
Выделить и исследовать перифитонные бактерии.
Определить деструктивный потенциал растительно-микробной ассоциации и ее отдельных компонентов по отношению к углеводородам нефти.
Определить вклад ферментных систем элодеи в деструкцию поллютантов.
5. Исследовать отдельные ассоциативные характеристики компонентов водного растительно-микробного сообщества, образованного элодеей канад ской.
Научная новизна
Впервые установлено взаимовлияние элодеи канадской, бактериального планктона, перифитона и водорастворимой фракции нефти (ВФН). Показано, что в присутствии поллютанта бактериальный перифитон несет защитную функцию, нейтрализуя воздействие токсиканта, в то же время, макрофит играет стабилизирующую роль в отношении бактериоперифитона, поддерживая высокую численность его популяций.
Выделены и идентифицированы новые перифитонные штаммы, изучены их деструктивные- характеристики: Acidovorax delafieldii El-1, Pseudomonas fluorescens El-2.1 и El-2.2, Pseudomonas sp. El-4.2, Brevundimonas diminuta El-3.1, Aquaspirillum fasciculus El-4.1, Koccuria rosea El-4.3.
Впервые проведено сравнительное исследование деструктивной активности водной растительно-бактериальной ассоциации и ее отдельных компонентов. Показана активная роль каждого участника при существенных преимуществах ассоциации в деструкции поллютантов.
Впервые установлено, что наряду с перифитонными микроорганизмами как нативная, так и стерилизованная элодея канадская способна подвергать деструкции углеводороды нефти. Эта активность проявляется в отношении сырой нефти, ее водорастворимой фракции и отдельных ароматических углеводородов (фенола, толуола, бензола и нафталина).
Показано, что ферменты, осуществляющие деструкцию исследованных соединений, присутствуют как в клетках растения, так и в его экссудатах. Впервые определена деструктивная активность экстрактов и экссудатов элодеи по отношению к углеводородам нефти. Показано, что экстракты элодеи обладают высокой тирозиназной, лакказной и пероксидазной активностью.
В деградации много кольцевых ПАУ (нафталина) и нафтенов (декалина) ведущая роль принадлежит перифитониым микроорганизмам.
Впервые установлено, что элодея канадская обладает избирательной антибактериальной активностью, подавляя рост коллекционных грамположитель-ных штаммов и стимулируя развитие всех перифитонных микроорганизмов. Выявлены отдельные показатели ассоциативных взаимоотношений бактериального перифитона с элодей канадской: ИУК-синтезирующая, азотфиксирую-щая и хемотаксическая активность.
Научно-практическая значимость работы
Выделено и исследовано 7 перифитонных штаммов, обладающих высокой деструктивной, ИУК-синтезирующей и азотфиксирующей активностью, которые могут явиться интродуцентами для ускорения деградации нефти в водоемах. Выявлен высокий деструктивный потенциал элодеи канадской как натив-ной, так и стерилизованной. Установлено ингибированне сырой нефтью (1 г/л) деструктивной активности элодеи. Результаты проведенных исследований демонстрируют функциональное значение водных организмов в процессах биодеградации нефтяного загрязнения воды, что необходимо для разработки приемов управления процессами самоочищения и для- рационального использования биологических и водных ресурсов. Полученные результаты могут служить теоретической основой для создания технологии фиторемедиации нефтезагрязнен-ных вод.
Результаты, характеризующие экологические взаимоотношения элодеи с перифитонными штаммами пополнили научные данные о выяснении механизмов ассоциативных взаимоотношений между водными растениями и бактериальным перифитоном.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на I Региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002); на Научной конференции молодых ученых, аспиран- тов и студентов, посвященной 115-летию академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2002); на 1 Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 2002, 2004); на Международном симпозиуме «Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants» (Саратов, 2003); на II Европейской конференции по биоремедиации (Second European Bioremediation Conference) (Chania, Greece, 2003); на Международном симпозиуме «Wastwater hygienisation in constructed wetlands, ponds and related systems» (Germany, Leipzig, 2003); на Научной конфереции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004); на 4 Международной конференции «Oils and Environment» (Gdansk, Poland, 2005); на 13 Международном симпозиуме по биоповреждениям и биодеградации («13th Bio-deterioration and Biodegradation») (Madrrid, Spain, 2005), иа Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН 31.10.2005 г., протокол №8.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 4 - в зарубежных изданиях.
Основные положения, выносимые на защиту
Выявленные эффекты влияния сырой нефти и ее водорастворимой фракции и отдельных углеводородов на водную растительно-микробную ассоциацию и ее компоненты.
Культурально-морфологические, биохимические и деструктивные характеристики выделенных перифитонных бактерий.
Деструктивная активность нативной и стерилизованной элодеи, ее экстрактов и экссудатов по отношению к сырой нефти, ее отдельным фракциям и индивидуальным углеводородам.
Ингибирующая и стимулирующая активность элодеи, ее экзо- и эн~ докомпонентов по отношению к водным микроорганизмам.
Характеристики перифитонных бактерий по ИУК-синтезирующей, азотфиксирующей и хемотаксической активности.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 190 стр. машинописного текста, включает 18 таблиц, 36 рисунков, состоит из введения, главы литературного обзора, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 422 источника, из них 134 - иностранные.
Работа выполнена в лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН в рамках плановой темы НИР «Исследование взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (№ гос. per. 01.9.90 003293), при поддержке грантов РФФИ (№ 03-04-58913з и 05-04-58605з), Президента РФ № НШ-1529.2003.4, Фонда «Интеграция».
Использование высших водных растений в технологиях очистки сточных вод и загрязненных объектов
Очистные сооружения с завершающей стадией биологической очистки удаляют из стоков лишь 37,5 % азота, 29,3 % фосфора, 18 % калия /109/. Это, безусловно, требует доочистки, которая успешно осуществляется при использовании ВВР.
Элодея канадская успешно использовалась для доочистки воды от тяжелых металлов (Ni, Cr), органических фосфатов, пестицидов, фитодеградации ДДТ в корневой системе и стебле /110-112/, а также для биоиндикации загрязнения тяжелыми металлами в нескольких польских реках /113, 114/.
Погруженные и плавающие листья валлиснерии спиральной, риччии плавающей, водяного индийского папоротника использовали в лабораторных условиях для очистки сточных вод /115/. Преимущество такой очистки по сравнению с очистными сооружениями заключается в низкой стоимости, так как не требует затрат на специальное оборудование.
Анализ работ по очистке сточных вод с помощью макрофитов в нашей стране и за рубежом 155, 109, 116, 117/ показывает, что на нескольких промышленных предприятий успешно применялись посад-ки тростника и других видов водной растительности для удаления из стоков биогенных элементов. Такие очистные сооружения называются «биоплато», «биопрудами» или «ботаническими площадками». В сооружениях такого типа очистка обеспечивается аккумуляцией биогенных и загрязняющих веществ ВВР и сообществом пе-рифитонных микроорганизмов, а также сорбцией и химическим окислением. Однако ботанические площадки отличаются от биоплато тем, что они не всегда искусственного происхождения.
Обычно биопруды располагаются сериями на разных уровнях. Образуется каскад, благодаря которому вода из верхнего пруда направляется в нижерасположенные, очищаясь по мере прохождения через заросли специально подобранных растений. Известные конструкции биопрудов представляют собой сложные инженерные сооружения, эксплуатационные работы на которых до настоящего времени не обеспечены средствами механизации. В отдельных случаях степень удаления органических примесей (в том числе и нефтепродуктов) с помощью макрофитов даже выше, чем при использовании промышленных методов биологической очистки /109/.
Установлено /118/, что в биопрудах с ВВР для доочистки сточных вод нефтеперерабатывающих заводов резко уменьшается токсическое действие на выживаемость и развитие поколений дафний, концентрация нефтепродуктов в воде снижается в 5-20 раз/109/, существенно ускоряются деструктивные процессы /119,120/.
Разработан способ очистки стоков нефтеперерабатывающего завода с помощью «фильтра» из зарослей рогоза и аира. Для очистки сточных вод шахт Подмосковного бассейна были созданы водоочистные ботанические площадки /121/.. Сточная в ода проходит по специальному искусственному каналу, засаженному рогозом широколистным, за 6-8 ч и вытекает полностью очищенной. Для очистки стоков Балхашского горно-металлургического комбината от ионов цветных металлов использовалось комбинированное воздействие тростника и активизируемых им микроорганизмов /109/. В г. Волжском Волгоградской области сточные воды химических предприятий пропускали по специальным каналам, засаженным водными макрофитами /49/.
Опыты с использованием ВВР в очистных прудах-накопителях и зарослях прибрежно-водных растений (тростник обыкновенный, рогоз узколистный, широколистный и Лаксмана, камыш озерный) проводились на шахтах Донбаса /122/. Наблюдения показали, что под влиянием зарослей и прудов взвешенные вещества сточных вод полностью задерживались, концентрация Са2+, HCCV, СГ, Na+, К+ уменьшилась на 18-3S %. В Ленинградской области в 1990 г. была построена конструкция каскада каналов-биопрудов с посадками рогоза узколистного, тростника обыкновенного, элодеи канадской и ряски /123/. Эти же растения использовались на ботанических площадках в штате Аризона (США) для удаления азота /124, 125/. Показано, что 4-11 % удаленного нитратного азота приходится на поглощение водной растительностью и 89-96 % - на денитрифи-кацию /46/.
В течение трех лет проводились наблюдения за протоками, соединяющими поля фильтрации с водотоками Иваньковского водохранилища /117/. На пути неочищенных сточных вод развивались, сменяя друг друга, рогоз и тростник. В процессе прохождения сточных вод улучшились такие показатели, как БІЖ5, насыщение кислородом, окисляемость, санитарно-бжшогические показатели.
Для ликвидации избытка биогенов в сточных водах НИИ биологии использовали водные растения ряску, рдест гребенчатый, рдест курчавый, уруть, ни-теллу, элодею, которые элиминировали нитраты, фосфаты, аммоний на 60-100 % за 2-7 сут. /6/.
Важную роль в очистке сточных вод имеет правильный подбор растений. Предпочтение отдается видам, которые хорошо растут и развиваются в различных сточных водах и при этом извлекают из них балластные вещества, в присутствии которых не накапливается целлюлозный ил, круглый год обеспечивается аэрация воды, уничтожаются болезнетворные бактерии. Камыш озерный наиболее полно отвечает этим требованиям /36, 62, 126, 127/,
Ряд опытов с разными водными растениями показал, что камыш способен произрастать как в промышленных, так и бытовых сточных водах с высокой концентрацией органических веществ и извлекать эти вещества из воды /36, 74, 126, 128/, выравнивать рН как в кислой, так и щелочной среде до нейтральной. Его способность аэрировать воду благодаря наличию большого числа устьиц в эпидермисе стебля, а также бактерицидные свойства позволили разработать эффективный метод промышленной очистки сточных вод /36, 62, 63, 127/, который стал использоваться во многих странах /129/. В водной среде большая часть бактериального населения находится на твердых поверхностях: камнях, искусственных сооружениях, высших водных растениях. Микробной слизью покрыта поверхность взвешенного детрита, где сосредоточено 30-50 % находящихся в воде бактерий /130, 131/. В морских водах бактериальный перифитон может составлять 8-9 % объема всего обрастания/132/.
Влияние сырой нефти на микроорганизмы
Признано, что состав микробного сообщества и уровень его развития являются одними из наиболее важных факторов, определяющих скорость разложения органического вещества /203/. В процессах его деструкции принимают участие микробные сообщества различных экологических групп, в частности бактериопланктон, населяющий толщу воды, и бактериоперифитон, покрывающий твердые поверхности, в том числе поверхность водных растений. В этой связи было исследовано влияние нефти на численность обеих групп микроорганизмов. Сырую нефть вносили асептически в количестве 1 г/л. Контролем служила среда без нефти. Эксперимент проводили в сосудах с отстоявшейся водопроводной нестерильной водой. Детальное описание см. в главе «Материалы и методы». Пересчет численности микроорганизмов вели в случае планктона на мл воды, в случае перифитона - на 1 г сырого веса элодеи.
Кривые роста планктонных микроорганизмов весьма интересны (рис. 1). В условиях нефтяного загрязнения без элодеи кривая имеет классическую форму: на 3-й сутки культура заканчивает логарифмическую фазу роста и выходит на стационар при численности КОЕ 3,2 х 106, незначительно увеличиваясь до 8,0 х 106к 10-м суткам. В присутствии элодеи планктонные микроорганизмы развиваются иначе: рост имеет двухфазный характер с пиками на 1-е и 6-е сутки. При этом численность к 6-м суткам практически совпадает с таковой в отсутствии элодеи, но затем начинает резко падать. Полученные результаты отчетливо свидетельствуют о существенном влиянии элодеи на бактериопланктон. В случае перифитона картина совершенно иная: в чистой среде численность микроорганизмов несколько снижается, в загрязненной -увеличивается.
Развитие планктона и перифитона в чистой среде взаимозависимо и находится в противофазе друг другу, что, вероятно, обусловлено процессами эмиграции прикрепленных бактерий. В начале эксперимента численность гетеротрофных перифитонных микроорганизмов на несколько порядков превышала таковую планктона. Однако в ходе опыта эта разница значительно сокращалась и к концу эксперимента меняла значение; от 1,07 х 10 до 1,19 х 106 кл./г сырого веса.
В присутствии нефти динамика развития перифитонных микроорганизмов существенно меняется. Сразу происходит некоторый всплеск численности до 2,4 х 10 с постепенным увеличением до 6,8 х 10 кл./г сырого веса к концу эксперимента, что на порядок больше планктона в аналогичных условиях.
Естественные водные объекты, как правило, содержат небольшое количество растворенного органического вещества. В связи с этим водные микроорганизмы в большинстве своем являются олиготрофами, то есть способными расти в обедненной органикой среде. Чтобы выявить численность этой группы микроорганизмов мы осуществляли посев из всех вариантов эксперимента на среду Горбенко /153/. Как и в предыдущем исследовании, присутствие элодеи оказывало существенное влияние на развитие микроорганизмов (рис. 2). В отсутствии растений, также как и в случае планктонных гетеротрофов, наблюдался классический экспоненциальный рост олиготроф-ных планктонных микроорганизмов, который через трое суток, достигнув максимума 9,5 х 10б кл./мл, переходил в стационар с постепенным снижением до 1,8 х 106 кл./мл. При внесении в среду элодеи, наоборот, вначале происходило некоторое снижение численности данной группы организмов;, особенно выраженное в условиях нефтяного загрязнения, с последующим плавным ростом, к концу эксперимента (10 сут.) выравнивающимся с вариантом без растения. В конце опыта численность планктонных олиготрофов была выше начальной в 4-8 раз.
В перифитоне элодеи преобладание олиготрофных микроорганизмов выражено более отчетливо (рис. 2). При этом присутствие нефти практически не сказывалось ни на характере роста олиготрофов, ни на их численности. Максимального количества данная группа достигла так же на третьи сутки, как в присутствии нефти, так и без нее - 6fi х 10 и 6,2 х 10 кл./г сырого веса соответственно, оставаясь практически на этом уровне до конца эксперимента.
Деструкция сырой нефти перифитонными микроорганизмами
Нефть - поликомпонентный субстрат. Количество углеводородов и их качественный состав в загрязненной воде определяют скорость и эффективность процесса микробной деструкции. Естественно, не все углеводороды разрушаются одинаково исследуемыми организмами. С целью определения подверженности отдельных групп углеводородов биоразрушению нами был проведен анализ фракционного состава остаточных нефтепродуктов после 10 сут. биодеструкции сырой нефти (0,5 г/л).
Показано, что сообщество элодеи с перифитонньши микроорганизмами принимало участие в деструкции всех фракций, однако наиболее активно -парафиновой (67 %). Штамм P. fluorescent Е1-2.1 разрушал нафтеновую, парафиновую фракции и ПАУ на 45, 22,5 и 17,5 % соответственно (рис. 12). Штамм Br. diminuta Е1-3.1 принимал участие в разрушении всех фракций, за исключением спирто-беизольных смол: парафины (20,3 %), нафтены (30,3 %), моно- и бициклическая ароматика (7,7 %), ПАУ (14,6 %). Содержание спирто-бензольных смол в присутствии данного штамма увеличивалось по сравнению с контролем на 9 %, что, вероятно, свидетельствует о накоплении продуктов окисления других фракций углеводородов.
Значительное разрушение парафино-кафтеновой фракции перифитонньши микроорганизмами, вероятно, связано с высокой эмульгирующей активностью этих штаммов, ранее выявленной с минеральным маслом (см. табл. 7), которое на 70 % состоит из нафтенов и на 22 - из парафинов /376/.
Стерилизованная элодея тоже разрушала эти фракции наиболее активно (31,7 и 30,6 % соответственно). Количество моно- и бициклической арома-тики в варианте со стерилизованной элодеей не изменялось относительно контроля, а в присутствии P. fluorescens Е1-2.1 увеличивалось на 0,6 %, вероятно, за счет некоторого количества фрагментов окисленных ПАУ. Таким образом, все исследованные организмы принимали участие в разрушении парафино-нафтеновой фракции и ПАУ. Однако сообщество элодеи с перифитонными микроорганизмами было более активным в этом процессе (67 %), чем стерильное растение (31,7 %) и чистые культуры выделенных микроорганизмов (20,3-22,5 %). Эффект синергизма наблюдался при разрушении смол, парафиновой и ароматической фракций, когда активность сообщества в 2-3 раза превышала таковую стерильного растения и перифитон-ных микроорганизмов.
Итак, в результате проведенных исследований выделены и идентифицированы 7 штаммов перифитонных микроорганизмов: Ac. delafieldii El-1, Р. fluorescens El-2.1 и El-2.2; P. sp. El-4.2, Br. diminuta El-3.1, Aq. fasciculus El-4.1 и К. rosea El-4.3. Наиболее активными деструкторами сырой нефти явились P. fluorescens El-2.1 и Br. diminuta El-3.1 (35,8 - 44,3 %), обладающие и эмульгирующей активностью в отношении минерального масла. Элодея также проявила высокую нефтеокисляющую активность. Снижение содержания нефти на 37,8 % стерилизованной элодеей наблюдалось уже на 3 сут, эксперимента, что позволяет говорить о равносильном вкладе растения и перифи-тонных микроорганизмов в процессы окисления нефти. Элодея, в свою очередь, имеет экзо- и энд о ферменты, участвующие в этом процессе. При этом экзоферменты являются индуцибельными и окисляют нефть за 3 ч на 25,6 %. Активность ферментного экстракта элодеи составляет 60,2 % при рН 6,5, что свидетельствует о высокой активности внутриклеточных процессов окисления углеводородов нефти. Концентрация нефти 1 г/л ингибировала деструктивную активность как ферментов, участвующих в окислении нефти, так и нативного растения, однако, не подавляя его роста и развития. Максимальную деструктивную активность по отношению к сырой нефти проявила растительно-микробная ассоциация (55,6 %), разрушавшая все фракции нефтепродуктов. На активность сообщества значительно влияли аэрация и температура среды.
Для сообщества погруженных макрофитов биодеградация сырой нефти ограничена ее биодоступностью. Вероятно, более существенную роль погруженные макрофиты и их перифитонные микроорганизмы играют при деградации ВФН. Поэтому целью дальнейших исследований было изучить деструкцию как этой фракции в целом, так и ее отдельных компонентов.
Было исследовано влияние элодеи в различных фазах роста на ВФН. Растения инкубировали в климатокамере при постоянной температуре среды 22 С. Как видно из рис. 13, концентрация ВФН в контроле без водных растений в течение всего эксперимента оставалась на одном уровне с незначительными колебаниями в первые 13 сут., что совпадает с колебаниями численности УОМ за такой же период времени (см. главу 3.2.2).
При инкубировании элодеи с ВФН (17 мг/л) в течение месяца наблюдалось снижение концентрации данной фракции относительно исходного количества во всех вариантах с элодеей. Отмечено, что на 13-е сутки инкубации, когда наблюдался максимум численности УОМ в перифитоне элодеи, концентрация ВФН снизилась в 3 раза в варианте со взрослыми побегами и в 4 раза в варианте с молодыми побегами, содержащими почки.
Определение ИУК-синтезирующей активности перифитонных микроорганизмов
Вещества, выделяемые растениями в воду, играют значительную роль в их существовании в водных биоценозах. Вопрос об антибактериальной активности элодеи приобретает актуальность в связи с выяснением роли фитонцидов как одного из факторов биологического самоочищения водоемов.
Для определения фитонцидных свойств экскретируемых элодеей соединений мы использовали стерилизованные растения и водные микроорганизмы, полученные из коллекции ИБФРМ РАН. Исследования проводили на чашках Петри, помещая стерилизованную ветку элодеи на посеянную газоном культуру штаммов. Как видно на рисунке 8 А и Б Приложения, вокруг побегов элодеи имела место значительная зона подавления роста грамположительных микроорганизмов Bacillus licheniformis 36 и Micrococcus luteus В-109.
Показано, что рост P. putida В-1458 угнетался только в присутствии молодых побегов и почек элодеи (Приложение рис. 8 В), а зрелые растения никак не влияли на исследуемые микроорганизмы. По этому поводу в литературе есть данные, что различные части растения могут содержать разное количество фитонцидов, отличающихся и качественно /92/. Кроме того, фитонцидная активность тесно связана со стадией развития растений, их физиологическим состоянием, сезоном и местом произрастания.
Элодея вне зависимости от фазы роста не влияла на рост Escherichia colt К-12 (Приложение, рис. 8 Г). Таким образом, по размеру диаметра зон подавления роста установлено, что целые, неповрежденные растения элодеи проявляют антибактериальную активность в отношении грамположительных микроорганизмов, не влияя на грамотрицательные.
Поскольку с поверхности элодеи нами был выделен ряд штаммов, представляло интерес определить токсичность растения по отношению к этим бактериям. Как и ожидалось, нативная элодея не оказывала какого-либо отрицательного действия ни на один из этих штаммов (Приложение рис. 8 Д -Л). В то же время, рост коллекционных водных микроорганизмов той же видовой принадлежности отчетливо ингибировался (см. выше). Известно, что одним из факторов иммунитета растений является свойство фитонцидов вызывать отрицательный хемотаксис у подвижных форм микроорганизмов /398/, вследствие чего элодея, вероятно, регулирует колонизацию своей поверхности конкурентными бактериями. Перифитонные микроорганизмы, в свою очередь, находясь в ассоциации с элодеей, защищают ее от агрессивных факторов среды. Это подтверждают наблюдения за стерилизованной элодеей при инкубировании ее с такими токсичными ксенобиотиками, как бензол (Приложение рис. 5), нафталин (Приложение рис. 6), декалин (Приложение рис. 7).
Так как для стерилизации элодеи применялись сильнодействующие антибиотики (пенициллин, левомицетин, цефазолин, амфоторицин В и рифам-пицин), существовала вероятность подавления роста коллекционных микроорганизмов остаточным количеством этих веществ на поверхности элодеи. Для выяснения этого предположения была исследована антибиотикочувст-вительность водных микроорганизмов к пенициллину и левомицетииу методом дисков (табл. 16) и серийных разведений - для остальных (табл. 17).
При определении антибиотикочувствительности методом дисков к пенициллину оказались чувствительны только В. licheniformis 36, М. luteus В-109 и К. rosea Е1-4.3, а к левомицетииу - все исследуемые микроорганизмы (табл. 16).
При внесении антибиотиков в питательный бульон наблюдался значительный разброс чувствительности: к амфоторицину устойчивы все микроорганизмы, кроме Pseudomonas sp. El-4.2 и К rosea El-4.3; к цефазолину устойчивы только перифитонные микроорганизмы, кроме указанных. В среде с рифампицином (200 мг/л) на первые сутки подавлялся рост всех бактерий, а на вторые - оказались устойчивы только штаммы Br. diminuta Е1-3.1 и A. fascicidus Е1-4.1 (табл. 17). Штамм М. luteus В-109, рост которого ингибировала элодея, был устойчив к амфоторицину (100 мг/л).
Наиболее показательным оказался штамм К. rosea El-4.3, который проявил высокую чувствительность к антибиотикам даже в более низких по сравнению с используемыми концентрациях. Однако, как можно видеть на рисунке 8 Д (см. Приложение), вокруг стерилизованной элодеи отсутствует зона угнетения роста этого микроорганизма. Таким образом, проявленные элодеей антибиотические свойства по отношению к водным микроорганизмам являются следствием секреторной деятельности растения, а не присутствия антибиотиков на его поверхности.
Исходя из предположения, что выделенные с поверхности элодеи пе-рифитонные штаммы способны использовать экссудаты растения для своего метаболизма, мы исследовали рост этих микроорганизмов на водных ферментных экстрактах элодеи и ее экссудатах. Из семи выделенных культур рост и развитие шести из них стимулируют ферментные экстракты элодеи, а рост при внесении в среду экссудатов элодеи был равен контрольному (рис. 26). Для роста штамма К. rosea Е1-4.3 было достаточно экссудатов элодеи, выделенных растением за сутки инкубации. Вероятно, этот штамм является олиготрофом, что подтверждается его ростом на среде Горбенко и на агаризованной среде М9 без источников углерода. Ферментные экстракты элодеи оказывали на него легкое ингибирующее действие.
Данный микроорганизм можно отнести к экологической группе так называемой микрофлоры рассеивания, в которую входят бактерии, приспособленные к использованию мономеров, рассеиваемых из мест их образования /397/. Такие микроорганизмы сами не способны к деструкции сложных молекул, что подтвердили эксперименты по определению деструктивной активности данного штамма (см. гл. 4).
