Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1. Физико-химические свойства стильбеноидов 10
1.2. Жидкостная адсорбционная хроматография стильбеноидов 15
1.3. Механизмы удерживания в жидкостной адсорбционной хроматографии на силикагеле 20
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 31
2.1. Объекты исследования 31
2.2. Методы физико-химических исследований 34
2.2.1. Тонкослойная хроматография ; 34
2.2.2-. Препаративная колоночная хроматография ..:. 38
2.2.3. Нормально-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография... 38
2.2.4. Спектроскопические методы 39
ГЛАВА 3. Синтез гидрокси- и метоксипроизводных трансстильбена 41
3.1. Стратегия синтеза транс-гидроксистильбенов 45
3.2. Использование арен-трикарбонильных комплексов хрома (0) для синтеза стильбеноидов 47
3.3. Применение соединений Pd в синтезе стильбеноидов по реакции Хека... 50
3.4. Деметилирование метоксистильбенов и получение гидроксистильбенов. 52
3.5. Физико-химические свойства синтезированных веществ 56
ГЛАВА 4. Физико-химические закономерности удерживания гидроксистильбенов в условиях нормально-фазовой жидкостной хроматографии 60
4.1. Влияние состава подвижной фазы и природы модификатора на хроматографическое удерживание гидроксистильбенов 60
4.2. Влияние состава и строения фенольных соединений на их хроматографическое удерживание на силикагеле 65
4.3. Исследование механизма адсорбционного взаимодействия стильбеноидов с поверхностью Si02 методом ИК-фурье-спектроскопии 78
ГЛАВА 5. Моделирование динамики хроматографических процессов разделения смесей гидроксистильбенов на слоях адсорбента малой длины 89
5.1. Теория динамики адсорбции и описание хроматографических процессов на колонках малой длины 89
5.2. Моделирование движения гидроксистильбенов и оптимизация условий их разделения методом препаративной ТСХ 94
Выводы 108
Список литературы 110
Приложение 124
- Физико-химические свойства стильбеноидов
- Методы физико-химических исследований
- Стратегия синтеза транс-гидроксистильбенов
- Влияние состава подвижной фазы и природы модификатора на хроматографическое удерживание гидроксистильбенов
Введение к работе
Актуальность темы. Гидроксистильбены представляют собой сравнительно небольшую группу природных фенольных соединений ряда Сб-Сг-Сб, которые широко применяются в традиционной медицине. Антиоксидантное, антиканцерогенное, антивоспалительное и антивирусное действие этих веществ, содержащихся в красном вине, винограде, арахисе и коре хвойных деревьев, делает их высокоэффективными лекарственными препаратами без вредного побочного действия. Кроме уникального сочетания лечебных свойств, многие стильбенои-ды обладают особыми оптоэлектронными свойствами и используются в области электрофотографии, преобразования солнечной энергии, производстве лазерных красителей. Удовлетворить возрастающий спрос на эти соединения фармакологии, медицины и промышленности, а также сохранить растительные источники сырья можно только путем эффективного синтеза функциональных производных стильбена - полных аналогов растительных стильбеноидов - и последующего препаративного выделения целевых соединений из синтетических смесей. В соответствии с этим идентификация стильбеноидов, выявление закономерностей их хроматографического поведения в нормально-фазовом варианте жидкостной хроматографии, а также оптимизация процессов препаративного разделения синтетических смесей является задачей актуальной и практически важной.
Особый интерес представляет рассмотрение вопросов поведения гидрокси-стильбенов на границе раздела фаз в многокомпонентных хроматографических системах. Межфазные взаимодействия такого рода играют огромную роль во многих областях науки и техники, но вследствие сложного характера протекающих процессов и трудности интерпретации результатов эксперимента в настоящее время плохо изучены. Моделирование процесса удерживания гидро-ксистильбенов в жидкостной хроматографии на основе изучения механизма их взаимодействия с компонентами жидкой и твердой фазы является наиболее перспективным подходом, позволяющим прогнозировать свойства хроматографи-ческой системы и оптимизировать ее состав и условия разделения.
Цель работы - изучение хроматографического поведения, адсорбционных и физико-химических свойств стильбеноидов в нормально-фазовой жидкостной хроматографии на силикагеле, оптимизация условий препаративного разделения многокомпонентных смесей, а также препаративное выделение гидрокси-стильбенов из реакционных смесей, полученных в результате целенаправленного органического синтеза.
В соответствии с поставленной целью в задачу работы входило: разработка новых более эффективных методов синтеза гидрокси- и метоксипроизводных т/?янс-стильбена; исследование механизма взаимодействия стильбеноидов с си-ликагелем и компонентами бинарной подвижной фазы; изучение параметров удерживания стильбеноидов в нормально-фазовой тонкослойной и высокоэффективной хроматографии на силикагеле в зависимости от состава подвижной фазы, природы полярного модификатора и строения молекул стильбеноидов; оптимизация условий хроматографического разделения гидроксистильбенов и их выделение из реакционных смесей методом препаративной тонкослойной хроматографии. Научная новизна основных результатов работы заключается в следующем: разработаны новые высокоэффективные методы металлоорганического синтеза гидрокси- и метоксипроизводных т/%шостильбена - аналогов растительных стильбеноидов - и исследованы их физико-химические свойства; методом ИК-фурье-спектроскопии исследована адсорбция транс-стипьбеяа, его гидрокси- и метоксипроизводных на поверхности Si02, получены данные о характере взаимодействия стильбеноидов с компонентами подвижной фазы в жидкостной хроматографии; экспериментально установлены физико-химические особенности хроматографического поведения транс-изомеров гидроксистильбенов в нормально-фазовом варианте тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии на силикагеле, получены зависимости параметров удерживания от строения стильбеноидов, состава подвижной фазы и природы полярного модификатора; установлена зависимость между элюирующей силой полярного модификатора (этилацетата, этанола, изопропанола) и его протоноакцепторными свойствами при хроматографическом исследовании гидроксистильбенов в системе силикагель - н-гексан; обнаружена корреляция между коэффициентами емкости гидроксипроизвод-ных транс-стилъбепа и бензола, предложено моделировать хроматографиче-ское поведение гидроксистильбенов с помощью гидроксибензолов с аналогичным характером замещения и близкими донорно-акцепторными свойствами; впервые проведено численное моделирование процесса препаративного разделения смесей различных гидроксистильбенов на основе аналитических решений, предложенных для расчета выходных кривых в жидкостной хроматографии на слоях адсорбента малой длины; проведена оптимизация условий разделения реакционных смесей и препаративного выделения синтезированных транс-изомеров гидроксистильбенов методом препаративной тонкослойной хроматографии.
На защиту выносятся разработанные методы синтеза гидрокси- и метоксипроизводных транс-стильбена, а также экспериментальные результаты исследования физико-химических свойств стильбеноидов; результаты исследования механизма адсорбционного взаимодействия гидрокси- и метоксипроизводных транс-стильбена с поверхностью силикагеля и влияния УФ-света на адсорбированные стильбеноиды; экспериментальные данные о влиянии состава подвижной фазы и природы полярного модификатора на закономерности удерживания гидроксистильбенов на поверхности гидроксилированного силикагеля в нормально-фазовом варианте тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии; установленные зависимости между хроматографическим поведением и строением молекул гидроксистильбенов, между элюирующей силой полярных модификаторов и их протоноакцепторными свойствами; обнаруженная корреляция между хроматографическим поведением гидро-ксистильбенов и гидроксибензолов с аналогичным характером замещения и близкими донорно-акцепторными свойствами, а также возможность ее использования для прогнозирования параметров удерживания стильбеноидов; результаты моделирования процесса препаративного разделения смесей различных гидроксистильбенов на основе аналитических решений, предложенных для расчета выходных кривых в жидкостной хроматографии на слоях адсорбента малой длины; эффективность предложенного метода препаративного выделения гидроксистильбенов из реакционных синтетических смесей.
Практическая значимость: Разработаны новые высокоэффективные методы синтеза, позволяющие получать аналоги растительных транс-стшьбеноидов в препаративном масштабе. Полученные экспериментальные данные по параметрам удерживания стильбеноидов с различным количеством гидрокси- и меток-си- заместителей в нормально-фазовом варианте ВЭЖХ и установленные зависимости коэффициентов емкости гидроксистильбенов от природы и состава компонентов хроматографической системы могут быть использованы в качестве практических рекомендаций при оптимизации процессов препаративного выделения стильбеноидов из синтетических смесей, а также при их идентификации в объектах окружающей среды, растительном сырье и фармацевтических препаратах. Предложены аналитические зависимости, позволяющие прогнозировать хроматографическое поведение малоизученных стильбеноидов на основании результатов исследования аналогичных гидроксипроизводных бензола, что существенно сокращает объем экспериментальных исследований.
Тема диссертационной работы входит в план научных исследований Института физической химии, Российской Академии наук и поддержана грантом Президиума РАН по Программе «Направленный синтез веществ с заданными свойствами и создание функциональных материалов на их основе». Апробация работы и публикации
Материал диссертации докладывался на заседаниях Ученого Совета ИФХ РАН и его секций (2003 г.), на конференциях молодых ученых ИФХ РАН (2001-2002 гг.), на IXX и XX Международных симпозиумах ШРАС по металлоорга-нической химии (Шанхай, Китай, 2000; Корфу, Греция, 2002); на IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии (Москва, 2001), на III Международном симпозиуме по хроматографии «100 лет хроматографии» (Москва, 2003), на II Международной конференции «Silica» (Мульхаус, Франция, 2001), XX Международной конференции по фотохимии (Москва, 2001), Международной конференции ЮНЕСКО «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000), I Европейской конференции «Chemistry towards biology» (Портороз, Словения, 2002), на V и VI Всероссийских симпозиумах по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999, 2000), на конференции «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002).
Основные результаты исследований опубликованы в 8 статьях в научных журналах и рецензируемых сборниках трудов, а также в материалах конференций и симпозиумов.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав с подразделами, выводов, списка цитируемой литературы и приложения.
В первой главе дан обзор работ, посвященных изучению физико-химических свойств и хроматографического поведения стильбеноидов в тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Рассмотрены механизмы удерживания фенольных соединений в жидкостной адсорбционной хроматографии.
Во второй главе описаны объекты и методы исследования.
Физико-химические свойства стильбеноидов
Стильбеноидные соединения представляют собой сравнительно небольшую группу природных фенольных соединений - гидрокси- и метоксипроизводных 1,2-дифенилэтилена (рис.1). Стильбеноиды, а также другие ароматические низкомолекулярные соединения - флавоноиды, лигнаны, танниды, таннины, терпены и др., являются экстрактивными органическими компонентами растений и образуются на пути шикиматного метаболизма [1].
Резвератрол (3,4,5 -тригидроксистильбен), пиностильбен (3,5 дигидроксистильбен), птеростильбен (3,5-диметокси-4 -гидроксистильбен), ту-налбен (3,3 -дигидрокси-5-метоксистильбен), пицеатаннол (3,5,3 ,4 -тетрагидроксистильбен) и другие стильбеноиды были найдены в чемерице, пте-рокарпусе, в коре и лубе кедра, сосны, ели, эвкалипта, акации, а также в арахисе и винограде [1-3]. Кроме того, стильбеноиды вырабатываются иммунитетом растений при инфекционных и грибковых заболеваниях - их называют «растительными антибиотиками», или фитоалексинами. По данным [1, 3-5], количество резвератрола в коре и плодах виноградной лозы, переболевшей «серой гнилью» {Botrytis cinerea,), в несколько раз выше, чем у неболевшей лозы.
В клетках растений стильбены существуют в виде смеси цис- и транс- изомеров, причем в обычных условиях равновесие этих форм сильно сдвинуто в сторону накопления термодинамически более устойчивой транс-формы. Под действием солнечного и УФ света оно несколько сдвигается в сторону образования z/моформы [5-6]. В природе встречается множество олигомеров стильбеноидов.
Например, обнаружены разнообразные димеры, тримеры, и так далее вплоть до октамеров резвератрола [7-9].
До последнего времени стильбеноиды в основном использовались в традиционной медицине и гомеопатии. Но после опубликования в 1997 г. в журнале «Science» результатов исследования лечебных свойств трсшорезвератрола, выделенного из красного вина [10], интерес к стильбеноидам растительного происхождения резко увеличился [11-21]. Группой ученых из университетов США и Испании во главе с профессором М. Пецутто [ 10] впервые были обнаружены и изучены антиканцерогенные свойства резвератрола. В настоящее время установлено, что резвератрол и другие гидроксистильбены не только предотвращают развитие раковых клеток, но и дезактивируют их, ингибируют агрегацию и коагуляцию составляющих частей крови, действует на метаболизм липопротеи-нов [11-18]. Очень ценным качеством резвератрола является его способность связывать свободные радикалы, постоянно образующиеся в клетках в процессе окислительных биохимических реакций и под воздействием внешних факторов [16, 21-22]. Причем его свойства как антиоксиданта намного выше, чем у других полифенолов, а также у широко использующихся в этом качестве витаминов С, Е и мелатонина [21-24]. В [25-26] обнаружено, что гидроксистильбены способны разрушать клеточные мембраны и проникать в электронно-транспортную систему растений и организмов. Стильбеноиды активно взаимодействуют с белками за счет образования водородных связей, оказывают ингибирующее действие на активность многих ферментов [20-21]. Они проявляют также эстроген-ные свойства и могут использоваться как негормональные эстрогены [27-28].
Связь между структурой и биологическими свойствами некоторых стильбе-ноидов рассматривается в [25, 29-31]. Например, при изучении моно- ди- и три-гидроксистильбенов было установлено, что их антиканцерогенная активность усиливается с увеличением количества ОН групп в молекуле [17-19]. С увеличением числа ОН групп в гидроксистильбенах растет их антиоксидантная активность, которая к тому же зависит от положения заместителей. Дополнительное введение метоксигрупп уменьшает способность гидроксистильбенов к свя
зыванию свободных радикалов [31]. В то же время нематоцидная активность гидроксистильбенов, уменьшается с увеличением количества ОН групп в молекуле. Она максимальна у моногидроксистильбенов с ОН группой в положении С-2 или С-3. Из дигидроксистильбенов самый активный транс-3,5-дигидроксистильбен (пиностильбен), а 4,4"-дигидроксистильбен (стильбэстрол) совсем не активен. Метоксистильбены нематоцидную активность не проявляют, однако введение метоксигрупп в гидроксистильбены приводит к увеличению их активности [30]. В работе [14] было обнаружено, что на биохимические свойства стильбенов влияет не только количество ОН групп, но и симметрия молекул гидроксистильбенов. В частности, антивирусные свойства проявляют только молекулы несимметричных стильбеноидов типа резвератрола (3,4,5"-тригидроксистильбена), а эстрогенные свойства - симметричные гидроксистильбены типа стильбэстрола (4,4"-дигидроксистильбена).
Биохимические свойства геометрических изомеров стильбена до сих пор мало изучены, но поскольку цис- и транс-изомеры сильно отличаются друг от друга по физико-химическим свойствам [32], предполагается, что они могут отличаться и по физиологической активности [33]. Имеются сведения, что цис-стильбеноиды стимулируют рост клеток, в том числе и раковых, а транс-стильбеноиды его подавляют [1]. По данным [30], нематоцидная активность у г/ис-изомера пиностильбена, в отличие от транс-изомера., полностью отсутствует. Для других гидроксистильбенов активность геометрических изомеров сопоставима.
С химической точки зрения стильбеноиды - это ароматические соединения цепочечной структуры типа Аг-СН=СН-Аг", простейшие представители поли-енов, или каротиноидов. В стильбенах фенильная и этиленовая группы вносят примерно одинаковый вклад в общую тг-сопряженную систему, т.е. наблюдается изоэлектронность тг-системы молекул [34-36]. Эквивалентность л-сопряжения через фенильные кольца и мостики С=С сохраняется и в длинных цепях поли-енов
Методы физико-химических исследований
Хроматографическая подвижность веществ определялась методом восходящей ТСХ на пластинах Silica gel 60 F254 (Merck) толщиной 0,25 мм. Для хрома-тографирования образцов использовалась стандартная камера 20 х 20 х 8 см (Desaga), насыщенная парами подвижной фазы. В качестве подвижной фазы использовалась смесь этилацетата и н-гексана с различным соотношением компонентов. Фактор удерживания определялся как отношение длины пробега вещества к пробегу растворителя Rf=Le/ Lp. Для расчета Rf использовались результаты трех измерений. Для идентификации соединений пластинку с их пятнами облучали флуоресцентной лампой. Соединения обнаруживались по поглощению в УФ-свете (к= 254 нм) и различались по цвету пятен после опрыскивания цериевым реагентом, который получали растворением 2 г фосфорномолибдено-вой кислоты, 1 г сульфата церия (IV) и 10 мл концентрированной серной кислоты в 90 мл воды [68].
Метод ТСХ использовали при выборе оптимального состава элюента для препаративного разделения смесей. б) Препаративная центрифужная радиальная ТСХ
Для препаративного разделения смесей и выделения вещества в количестве, большем 10 мг, применяют препаративную ТСХ (ПТСХ), где используются более объемные слои силикагеля. Разделение смесей ускоряется в центрифуге под действием центробежной силы [69].
Методом центрифужной радиальной ПТСХ на приборе хроматотрон фирмы Harrison Research 7924 Т проводилось разделение синтетических смесей стиль бенов. Принципиальная схема хроматотрона представлена на рис. 2. Разделение веществ этим методом происходит за счёт разной скорости движения компонентов смеси по стеклянной пластинке с нанесенным слоем силикагеля под действием центробежной силы. Скорость вращения пластинки, закрепленной на центрифуге, составляет 500-700 об/мин. Подача растворителя происходит непрерывно и может регулироваться как автоматически, так и вручную.
В качестве сорбента был использован Silica gel 60 PF254 (Merck), смешанный с гипсом в соотношении 20:1. Смесь силикагеля с гипсом в н-гексане наносят ровным слоем на медленно вращающуюся в горизонтальном положении круглую стеклянную пластинку с защищенным краем. После затвердения гипса пластинку высушивают при температуре 100С в течение двух дней и затем шлифуют до необходимой толщины. По краям сорбента делают срез под углом 45 специальным инструментом.
Толщина адсорбционного слоя определяет разделительную емкость пластинки. Важным параметром для оптимизации процесса разделения является скорость подачи подвижной фазы. В табл. 4 приведены рекомендуемые фирмой изготовителем оптимальные параметры процесса разделения в зависимости от массы разделяемой смеси веществ.
Перед вводом пробы слой сорбента на пластинке промывается 2-3 мин растворителем. Пробы наносят с помощью шприца на расстоянии 2,5 см от центрального отверстия и с выбранной скоростью подают подвижную фазу, чтобы избежать перегрузки. В результате разделения смеси на пластинке образуются концентрические кольца разделяемых компонентов (рис.3).
Контроль за разделением смеси и движением ее компонентов для отбора фракций осуществляется визуально, если вещество окрашено, или с помощью УФ-детектора (лампы). При разделении легко окисляющихся на воздухе соединений хроматографирование проводится в инертной атмосфере азота. Разделение сложных многокомпонентных смесей проводят ступенчато путем неоднократной элюции промежуточных фракций малого объёма или путем градиентного элюирования. В общем случае можно использовать в качестве компонентов подвижной фазы растворители различной полярности. В работе для препаративного разделения гидроксистильбенов использовались смеси н-гексана и этилацетата.
Использование метода центрифужной радиальной ТСХ с применением хрома-тотрона позволяет эффективно проводить разделение смесей продуктов органического синтеза с минимальными затратами растворителя и сорбента и многоразовым использованием приготовленных пластинок (20-30 раз в зависимости от химической природы разделяемых веществ). В среднем, для выделения продукта из смеси при оптимальных условиях разделения требуется 30 мин. По сравнению с препаративной колоночной хроматографией, разделение смесей методом центрифужной радиальной ПТСХ намного экономичнее и значительно быстрее (примерно, в 5 раз). Однако препаративная колоночная хроматография позволяет производить разделение больших количеств веществ, а также разделять более сложные многокомпонентные смеси.
Стратегия синтеза транс-гидроксистильбенов
1,2-Дифенилэтиленовая структура молекулы стильбена предполагает два возможных варианта ее синтеза из более простых единиц. Традиционно гидрокси-стильбены получают из соответствующих метоксипроизводных (рис. 4). На этом основании были разработаны две металлоорганические стратегии синтеза стильбеноидов (А и В), которые приведены на рис. 8 в виде схемы ретросинтеза триметоксистильбена 2.
В).
Стратегия Первый вариант - создание двойной С=С связи олефина с использованием потенциала химии ареновых комплексов хрома (стратегии Аь А2). Второй вариант синтеза стильбена 2 - это реакция кросс-сочетания в присутствии катализатора Pd (0) (стратегия Ai предусматривает использование депротонированного в бензильном положении комплекса 5 в реакции альдольнои конденсации с анисовым альдегидом для получения спирта 8. Эта реакция будет проведена впервые, хотя в литературе имеются сведения о возможности применения депротонированных ареновых комплексов хрома в качестве нуклеофилов [127]. Спирт 8 может быть переведен в стильбен 2 в результате последовательных реакций десилилирова-ния, окисления и дегидратации.
Стратегия Аг предусматривает получение стильбена 9 в результате взаимодействия фосфоната 7 с анисовым альдегидом по реакции Виттига-Хорнера. Синтез комплексного фосфоната 7 может быть осуществлен путем депротони-рования в бензильном положении комплекса 5 и его последующей реакции с коммерчески доступным хлорфосфатом. После десилилирования и окисления комплексного стильбена 9 образуется триметоксистильбен 2.
В обоих вариантах стратегии А используется метилированный комплекс хрома 9, который может быть синтезирован по методике [129].
Метод В синтеза стильбена 2 основан на применении Pd (О) и его соединений в качестве катализаторов реакции кросс-сочетания. Эффективность такого типа реакций зависит от выбора катализатора, реагентов и условий проведения синтеза. Поэтому планируется исследовать взаимодействие пара-метоксистирола 11с различными реагентами: трифлатом 8, значительно более дешевым фосфатом 14 и хлоридом 15. Исходные трифлат 8 и фосфат 14 могут быть легко получены из доступного фенола 12 (рис. 9).
Ключевое соединение в стратегии А - комплексный диметиловый эфир резорцина 5 - был синтезирован по методике [129] в три стадии с общим выходом 60,9% (рис. 10). Промежуточный комплекс 4 был получен путем депротониро-вания 3 в позиции С-2 с помощью н-ВиЫ в ТГФ при -78С и последующей реакции с хлоридом триметилен ли л a (TMSC1). Для получения метилированного комлекса 5 ГМб -защищенный комплекс 4 был региоселективно депротонирован в позиции С-5 с помощью ЫТМР (2,2,6,6-тетраметилпиперидид лития) и затем обработан Mel при -50С.
По данным [129], комплекс 5 можно получить из 1,2-диметокси-5-метилбензола в одну стадию, однако это значительно дороже, чем его довольно простое получение из дешевого резорцина (рис. 10).
Депротонирование комплекса 5 с помощью н-ВиЫ в ТГФ при -40С (рис. 11, стратегия Ai) ведёт к образованию термодинамически стабильного переходного комплекса, который при добавлении анисового альдегида превращается в спирт 8. При этом цвет реакционной смеси изменяется от темно желтого до красного и опять до желтого.
Десилилирование комплекса хрома 8 осуществляется с помощью фторида тет-рабутиламмония H-BU4NF и следов воды. После этого раствор 8 в диэтиловом эфире для разрушения комплекса оставляют на свету на 2 дня, в результате чего образуется спирт 17 с общим выходом 97%.
Дегидратация спирта 17, проведенная тремя разными способами (нагревание раствора 17 в диметилсульфоксиде (DMS), кипячение смеси 17 в бензоле с фосфорной кислотой или с иара-толуолсульфоновой кислотой (nsOH), приводит к образованию триметоксистильбена 2 с выходом 60-61%.
При исследовании продуктов реакции методом ТСХ в реакционной смеси были обнаружены и идентифицированы флуоресцирующие вещества - цис-триметоксистильбен и продукт его фотоциклизации фенантрен [36-37].
В результате депротонирования комплекса 5 с помощью н-ВиЫ в ТГФ при -40С и последующего добавления дихлорфосфата при -40С был получен фосфат 7 (рис. 11, стратегия А2) с выходом 59%). После его депротонирования в бензильном положении (с помощью н-ВиЫ в ТГФ при -40С) была проведена реакция с анисовым альдегидом (альдегид добавили при -10С и затем нагрели смесь до 80С) и получен стильбен 9.
Десилилирование 9 проводилось с помощью H-BU4NF и следов воды (рис. 12). Попытка разрушить десилилированный комплекс 18 с помощью УФ-света (150 Ватт, 300 нм), как это делалось в [129], привела к образованию г/ис-изомера 19 (выход 54% ), который не удалось перевести в транс-изомер путем нагревания в толуоле или в присутствии nsOH. При УФ-разрушении комплекса 18, а так же при попытке перевести иис-изомер в транс-, в составе продуктов реакции был обнаружен флуоресцирующий фенантрен 20 [51].
Влияние состава подвижной фазы и природы модификатора на хроматографическое удерживание гидроксистильбенов
Использование полярных растворителей для регулирования свойств подвижной фазы в нормально-фазовом варианте хроматографии - естественный прием, который позволяет влиять на константу распределения вещества между жидкой и твердой фазами, а также управлять временем элюирования анализируемых соединений и селективностью разделения компонентов хроматографической системы. Выбор полярного растворителя для препаративного разделения смесей методами нормально-фазовой ТСХ и ЖХ обусловлен такими его физико-химическими свойствами, как дипольный момент ц, диэлектрическая проницаемость є, вязкость т, нетоксичность, невысокие температуры кипения Ткип, оптимальные значения давления насыщенного пара Р, возможность полной дегидратации, дешевизна, а также возможность смешения с неполярным компонентом в широких пределах и т.п. В табл. 7 приведены некоторые физико-химические характеристики полярных растворителей, используемых для разделения гидроксистильбенов в нормально-фазовом варианте хроматографии [39, 56, 63-67].
Элюирующая способность растворителей є0\ значения которой приведены в табл. 7, определяется совокупностью различных параметров, она зависит как от природы сорбента, так и от природы растворителя. Чем прочнее элюент адсорбируется на неподвижной фазе, тем больше его элюирующая сила. Это выражено в виде элюотропного ряда Снайдера, который хорошо выполняется в вытес-нительном режиме десорбции и отражает энергию взаимодействия элюент - си-ликагель [114]. Параметр «общей полярности» Р" растворителя [94], характеризует его способность выступать в качестве донора и акцептора протонов. Сопоставление данных, приведенных в табл. 7, позволяет отметить, что наибольшая элюирующая сила и «общая полярность» характерна для спиртов, которые адсорбируются на поверхности силикагеля, образуя модифицирующий слой [93]. Для препаративного разделения смесей, исходя из критериев, приведенных выше, оптимальными качествами обладают этилацетат, этанол и изопропанол.
Было проведено исследование влияния состава подвижной фазы и природы модификатора на хроматографическое удерживание тригидроксистильбена (транс-резвератрола) в системе Силасорб-600 - н-гексан - модификатор. На рис. 19 приведены зависимости логарифма емкостного фактора резвератрола lg& oT lg (р (где (р - объемная доля полярного модификатора в н-гексане). Обнаружено, что значение емкостного фактора А: транс-резвератрола уменьшается от 9 до -0,15 при увеличении содержания изопропанола в «-гексане от 7 до 20 об. %, а этилацетата - от 40 до 65 об. %. При использовании этанола емкостной фактор к имел небольшие значения, которые изменялись от 0,2 до 1 при уменьшении содержания спирта в подвижной фазе от 75 до 45 об. %. Полученные для транс-резвератрола в бинарных смесях растворителей линейные зависимости lgfc oT \g(p могут быть описаны уравнением: \gk = A-B-\gq , где А и В - эмпирические коэффициенты, зависящие от природы элюата и элюента [95]. В ряду этилацетат - этанол - изопропанол коэффициент В уменьшается от 3,45 до 2,70 и 2,49. В этой же последовательности увеличивается элюирующая сила модификаторов в исследуемой хроматографи-ческой системе, что не совпадает с элюотропным рядом Снайдера для силикаге-ля {So ) И последовательностью увеличения значения параметра полярности Р\ которые приведены в табл.7.
В модели Снайдера-Сочевиньского [96, 99], для описания зависимости удерживания вещества от мольной доли Хт полярного компонента элюента предложено уравнение lg к = а - п lg Хт, где коэффициент п трактуется как число молекул подвижной фазы, вытесняемых с активных поверхностных центров сорбента при адсорбции одной молекулы хроматографируемого вещества. Экспериментальные зависимости емкостного фактора от концентрации полярного модификатора также были представлены в координатах 1/к = f(Xm), где Хт -мольная доля полярного компонента бинарной смеси (рис. 20).
Как видно на рис. 20, при увеличении концентрации полярного модификатора в системе наблюдается отклонение экспериментальных кривых от линейной зависимости Скотта-Кучеры: 1/к = а + Ъ Хт [95]. По отклонению от линейности, можно качественно оценить наличие эффектов межмолекулярной ассоциации в подвижной фазе, как было предложено в [109]. Поскольку наблюдается отклонение экспериментальных зависимостей в сторону оси ординат, то межмолекулярная ассоциация резвератрол - модификатор соизмерима со специфическим взаимодействием резвератрола с поверхностью силикагеля. При этом наиболее сильно гидроксистильбен взаимодействует со спиртами, особенно, с изопропи-ловым. Поскольку по всем параметрам, используемым в качестве меры полярности, изопропанол уступает этанолу, представляло интерес сопоставить значения коэффициента В уравнения Снайдера с физико-химическими свойствами используемых модификаторов, чтобы найти объяснение повышенной элюи-рующей силы изопропанола в исследуемой системе. В табл. 8 сопоставлены другие широко использующиеся параметы полярности растворителей. Наиболее полярным по индексу полярности Ет (30) является этанол. Но при этом необходимо учитывать, что параметр Ет (30), определяемый спектроскопически [43], отражает в основном специфическую кислотность (по Льюису) растворителей, взаимодействующих со стандартным красителем 44, и не реагирует на изменение их основности (по Льюису).
