Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор
1.1. Фенилпропаноиды 7
1.2. Гликозиды родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) 12
1.3. Терпеноиды растений. Классификация, распространенность в природе, биологическая активность 19
1.4. Экднстероиды 24
1.5. Методы синтеза О-гликозидов 28
1.5.1. Синтез олигосахаридов 36
1.5.2, Наращивание олигосахаридной цепи 38
1.6. Заключение 40
Глава П. Обсуждение результатов 41
2.1. Выделение гликозидов Rhodiola rosea L 41
2.2. Обрагценнофазовая хроматография экстракта Rhodiola rosea L 44
2.3. Анализ полученных фракций гликозидов Rhodiola rosea L 45
2.4. Калибровка при количественном определении салидрозида и розавина методом ВЭЖХ 51
2.5. Анализ экстрактов выделенных из Rhodiola rosea L. разных годов жизни и места произрастания 52
2.6. Синтез салидрозида (31) 53
2.7. Синтез розина (6) 56
2.8. Синтез розавина (7) 57
2.9. Синтез гликозидов монотерпеноидов 64
2.10. Синтез гликозидов тритерпеноидов и экдистероидов 67
2.10.1, Гликозид бетулина (85) 67
2.10.2. Гликозиды стероидов 68
2.10.2.1. Гликозид Р-ситостерина (87) 69
2.9.2.2. а-Экдизон (88) 70
2.11. Исследования биологической эффективности синтетического розина... 72
2.11.1. Тест на лабораторных мышах 72
2.11.2. Тест на дрозофиле 76
2.11.2.1. Обработка розином 76
2.11.2.2. Тест на дрозофиле (продолжительность жизни) 77
2.11.2.3. Тест на дрозофиле (острое гамма-облучение) 79
2.11.2.4. Оценка двигательной активности имаго 79
Глава III, Экспериментальная часть 81
3.1. Приборы и реактивы 81
3.1.1. Очистка растворителей 81
3.1.2. Очистка и синтез реактивов 81
3.1.3. Приборы и оборудование 83
3.1.4. Хроматографическое исследование гликозидов 83
3.2. Экстракция корней с корневищами Rhodiola rosea L., обращеннофазовая хроматография экстрактивной смеси 84
3.2.1. Хроматография экстрактракта родиолы розовой 86
3.2.2. Анализ фракций экстркта Rhodiola rosea L 87
3.2.3. Калибровка хроматографа "Милихром 2" по розавину
и салидрозиду 87
3.3. Синтез гликозидов 88
3.3.1. Пента-0-ацетил-|3-0-глюкопираноза 88
3.3.2. 2,3,4,6-тетра-0-ацетил-а-Б-глюкопиранозилбромид (64) 88
3.3.3. Синтез салидрозида(ЗІ) В9
33Л. Синтез розина(б) 90
3.3.5. 2,3,4-три-0-ацетил-а~Ь-арабинопиранозил-(2,3,4~три-0-ацетил-a-D-глюкопиранозилбромид) (71) 90
3.3.6. Синтез трансциннамил-0-(6'-0-а-Ь-2,3,4-три-0-ацетил-арабинопиранозил-Р-В-2,3,4-три-0-ацетил-глюкопиранозида) (72)....91
3.3.7. Получение 1,2,3,4-тетра-0-ацетил-6-0-трифенилметил-|3-В-глюкопиранозы (73) 91
3.3.8. 1,2Д4-тетра-0-ацетил-рШ-глюкопираноза(67) 92
3.3.9. Тетра-0-ацетил-Р-В-глюкопиранозил-6'-1-три-0-ацетил-а-Ь-арабинопираноза (69) 92
3.3.10. Синтез трансциннамил-рТ>6-0-трифенилметил-2,3,4-три-О-ацетилглюкопиранозы (74) 93
3.3.11. Синтезтрансциннамил-Р-Б-2,354-три-0-ацетил-глюкопиранозы (75) 93
3.3.12. Синтез ацетатарозавина (72) 93
3.3.13. Гликозилирование Сахаров хлористым титаном 94
3.3.14. 2,3,4}6-тетра-0-ацетил-р-метил-1-тио-0-глюкопиранозид (70) 94
3.3.15. 2.3,4:16-тетра-0--ацетил-Р-фенил-1-тио-В-глюкопйранозид 95
3.3.16. Синтез гликозидов с применением тиосахаров 95
3.3.17. Синтез гликозидов монотерпеноидов (80-83) 96
3.3.18. Синтез гликозида р-ситостерина (87) 96
3.3.19. Синтез гликозида а-экдизона (91) 97
3.3.20. Гидролиз ацетатных защитных групп в гликозидах 98
4. ВЫВОДЫ 99
5. ЛИТЕРАТУРА 100
Приложения 115
Введение к работе
Родиола розовая (Rhodiola rosea L.) с давних пор применяется в народной и традиционной медицине как стимулирующее, общеукрепляющее, тонизирующее средство. В настоящее время возник особый интерес к лекарственным средствам растительного происхождения, обладающим адаптогенным эффектом. Родиола розовая в этом смысле обладает уникальными свойствами. Основными действующими веществами этого растения являются фенилпропаноиды - гликозиды коричного спирта (розин, розавин, розарии) и салидрозид. В связи с тем, что растительное сырьё R. rosea L, в различных климатических условиях имеет различное содержание мажорных компонентов, встает проблема установления его качества, что повлекло за собой поиск методов получения стандартных веществ из растительного сырья, либо путей их синтеза.
Кроме того, известны соединения терпеновой природы, проявляющие эффекты, сходные с фенилпропаноидами родиолы розовой. Однако их использование в качестве лекарственных средств затруднено - частично из-за плохой растворимости в воде и физиологических жидкостях. Для повышения их растворимости и улучшения проницаемости в клетку терпеноиды переводят в гликозидную форму.
Механизмы синтеза гликозидов в большинстве случаев известны, их разнообразие заключается в использовании различных катализаторов. Однако в большинстве случаев высокая стереоспецифичность реакций гликозилирования достигается редко, практически всегда получается смесь изомеров.
Целью настоящей работы являлось выделение и синтез физиологически активных О-гликозидов фенилпропаноидов (на примере гликозидов R. rosea L.), О-гликозидов терпеноидной и стероидной природы.
Для разрешения данной проблемы поставлены следующие задачи:
1. получение стандартных веществ (розавина и салидрозида) из экстрактов корней с корневищами R rosea L. и калибровка аналитической У аппаратуры по полученным стандартным веществам;
2. разработка методик стереоспецифичного синтеза гликозидов R rosea L.\ исследование синтетических аналогов гликозидов родиолы розовой на физиологическую активность;
3. синтез гликозидов монотерпеноидов, тритерпеноидов и экди- стероидов; исследование их строения и реакционной способности в реакциях гликозилирования.
Науная новизна: синтезированы гликозиды R. rosea - салидрозид (2-[4- ;. оксифенил]-этанол-1-Р-В-глюкопиранозид), розин (шрйнс-циннамил-0-p-D-глюкопиранозид), розавин (шранс-циниамил-0-[6'-0-а-Ь-арабинопиранозил-P-D-глюкопиранозид]).
Синтезированы некоторые гликозиды монотерпеноидов методом Кеннигса-Кнорра (борнеола, вербенола, 4-(1 -гидроксиэтил)карен-2, мирте нол а).
Как показали эксперименты по синтезу стероидных гликозидов, наибольшую химическую активность проявляют гидроксильные группы при С3 и С22 положениях.
Впервые установлено, что синтетический розин при внутрибрюшинном введении лабораторным животным в концентрации 0.05 мг/кг проявляет адаптогенные свойства.
Впервые установлено, что синтетический Розин способен увеличивать продолжительность жизни биологической модели - Drosophila melanogaster, при введении в рацион в малых дозах (0.05 мг/кг).
Практическая значимость: отработаны экстрактивные и синтетические методы получения нативных гликозидов R. rosea, что позволит расширить перечень Государственных стандартных образцов химически чистых веществ. Синтетические гликозиды могут применяться для обогащения экстрактов Я rosea с целью увеличения их биологической ценности.
Основные гликозиды R. rosea - салидрозид и розавин, впервые выделены с помощью обращеннофазовой хроматографии низкого давления без применения токсичных реагентов, что более приемлемо при получении лекарственных средств из растительного сырья.
Разработаны методы анализа и с их помощью установлено, что при интродукции R. rosea на Европейсом Северо-Востоке, накапливает гликозиды (салидрозид и розавин) в количествах (более 1% от а.с.с.), удовлетворяющих требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации, к третьему году вегетации. Растения произрастающие в горных районах Северного Урала, накапливают гликозидов на 23% больше, чем в культурных растениях.
Фенилпропаноиды
Фенилпропаиоиды широко распространены в растительном мире. В последнее время данная группа соединений стала предметом пристального внимания исследователей в плане поиска перспективных биологически активных соединений и создания на их основе эффективных лекарственных средств. Интенсивные исследования в данном направлении привели к выделению большого количества новых соединений, однако до настоящего времени отсутствует общепринятая классификация данной группы веществ. Разнообразие фенилпропановых гликозидов обусловлено строением фрагмента Сб-Сг, углеводной части, а также других структурных единиц, входящих в молекулу. В связи с этим фенилпропаиоиды целесообразно рассматривать как большой класс природных соединений, состоящий из следующих групи [1]:
1. простые фенилпропаиоиды
а) коричные кислоты и их производные (сложные эфиры, гликозиды и другие производные), например коричная кислота (1), кофейная кислота (2), 4-0-Р-В-глюкопиранозид да/?а-кумаровой кислоты (3);
Основными источниками фенилпропаноидов растительного происхождения являются растения семейств сложноцветных (Asteraceae), толстянковых (Crassulaceae), аралиевых (Araliaceae), норичниковых (Scrophulariaceae), ивовых (Saliaeae) подорожниковых (Thymelaeaceae) и маслинных (Oleceae).
Среди простых фенилпропаноидов наибольший интерес в плане биологической активности и структурного анализа представляют гликозиды коричных спиртов и производные коричных кислот [1]. В последнее время появились сообщения о выделении ряда новых гликозидов, представляющих интерес с точки зрения хемосистематики, структурного анализа, биологической активности [2-6].
Способы выделения.
Выделение и очистка фенилпропаноидных соединений стала возможной благодаря применению препаративных методов выделения, в том числе и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Следует отметить, что многие фенилпропановые гликозиды выделены исследователями именно с помощью препаративной ВЭЖХ [7-12]. Кроме того, для получения в нативном виде фенилпропаноидов целесообразно использовать щадящие условия экстракции, способов упаривания и других технологических операций. В некоторых случаях процесс выделения фенилпропаноидов настолько затруднителен, что их изоляция возможна лишь через стадию химической модификации, в частности, ацилирования [13].
Для разделения экстрактивных веществ чаще всего используют силикагель, целлюлозу, полиамид или сефадекс LH-20, причем с помощью последнего сорбента осуществлена очистка большинства фенилпропаноидов. Интересно, что выделение некристаллизующихся циннамилгликозидов родиолы розовой (розарина (8) и розина (6)) стало возможным лишь в случае использования для их разделения и очистки сефадекса LH-20 [14].
Выделение гликозидов Rhodiola rosea L
Целью данной части работы являлось получение гликозидов из растения R. rosea L., выделение препаративно чистых веществ (розавина (7) и салидрозида (31)) для калибровки аналитической аппаратуры по двум веществам, и последующей оценки качества сырья родиолы розовой, произрастающей на территории Европейского Северо-востока, а также частичный встречный синтез салидрозида и гликозидов коричного спирта. Кроме того, испытание синтетических аналогов гликозидов на биологическую активность.
При извлечении гликозидов из растительного сырья, одной из ключевых проблем является автоферментация материала при сушке и хранении, что сопровождается гидролизом гликозидов до агликонов и углеводных компонент. Сушкой сырья при температуре 40С преимущественно сохраняется салидрозид (31). При температуре сушки 70С, в сырье остаются циннамилгликозиды, розавин (7) и розарии (8) [55]. Таким образом, данный метод сушки сырья родиолы розовой не позволяет сохранить все находящиеся в растении гликозиды.
Для сравнения методов высушивания сырья родиолы розовой были отобраны корни с корневищами 4-го года жизни. Сушку сырья проводили при комнатной температуре (20С), при 40С и 70С. Как видно из таблицы 1 при высушивании корней с корневищами при комнатной температуре из сырья теряется примерно 25% гликозидов. Использование температуры 40СС позволяет сохранять салидрозид той же концентрации, что и в исходном сырье; уменьшается лишь количество гликозидов коричного спирта. Данный факт можно обьяснить действием фермента вицианозидазы, которая вызывает разрушение гликозидов (7) и (8) при температуре 40-50С [39, 55].
Очистка растворителей
Ацетон - марки "ч", по ГОСТ 3603-79 дополнительно очищали перегонкой с перманганатом калия, после чего сушили над хлористым кальцием и снова перегоняли.
Ацетонитрил - марки "ч", ТУ 6-09-3534-87, для очистки перегоняли над фосфорным ангидридом.
Бутанол - марки "чда", по ГОСТ 6006-78, использовали без предварительной очистки.
Гексан - марки "ч", ТУ 6-09-3661-79 очищали перегонкой при температуре кипения растворителя.
Диэтиловый эфир - марки "чда", по ГОСТ 5212-86, осушали над безводным гидроксидом натрия и перегоняли над металлическим натрием.
Метанол - марки "ч", кипятили два часа с йодистым магнием и перегоняли.
Толуол - марки "чда", по ГОСТ 5789-78, осушали кипячением с фосфорным ангидридом и перегоняли.
Хлористый метилен - марки "ч", ТУ 2631-44493179-98, дважды перегоняли над фосфорным ангидридом,
Хлороформ - марки "хч", пропускали через колонку, заполненную оксидом алюминия и дважды перегоняли над фосфорным ангидридом.
Этанол - перегоняли над 2,4-динитрофенилгидразином, подкисленным серной кислотой.
Этилацетат - марки "хч", по ГОСТ 22300-76, дважды перегоняли над фосфорным ангидридом.
3.1.2. Очистка и синтез реактивов
Алюминия окись - марки "чда", ТУ 6-09-426-75, использовали без предварительной очистки.
Бром - марки "хч", использовали без предварительной очистки.
p-D-глюкоза - марки "фармакопейная", ФС 424-52-41-93 высушивали в сушильном шкафу при температуре 60-120 С. Аналогично сушили остальные сахара.
Карбонат серебра - получали перемешиванием нитрата или сульфата серебра с насыщенным раствором карбоната натрия. Перемешивание проводили без доступа света. Полученный желтый осадок отфильтровывали под вакуумом, промывали водой, а затем этиловым спиртом и диэтиловым эфиром. Безводный продукт сразуже использовали в реакциях синтеза гликозидов.
Коричный спирт - получали восстановлением коричной кислоты марки "чда" алюмогидритом лития в среде абсолютного диэтилового эфира [148, 149]. Полученное вещество дважды перекристаллизовывали из толуола. Белоснежные кристаллы вещества использовали при синтезе гликозидов ТШ1.36С,ТКИП.139С[150].
Натрий металлический - марки "ч", МРТУ 6-09-356-70, перед введением в реакцию поверхность зачищали до металлического блеска.
Натрий углекислый - марки "чда", ГОСТ 83-79, использовали без предварительной очистки.
Оксалат меди - получали взаимодействием медного купороса, растворенного в воде, с щавелевой кислотой. Образующийся голубовато-зеленый осадок декантировали и промывали безводным ацетоном, для удаления избытка воды, при этом кристаллизовался осадок. Полученные кристаллы оксалата досушивали в эксикаторе над фосфорным ангидридом.
Пиридин - марки "чда", очищали перегонкой при температуре кипения.
Сульфат меди - марки "чда", осушали термообработкой кристаллогидрата до удаления кристаллизационной воды в сушильном шкафу при температуре 100-120 С.
Сульфат натрия - марки "чда", ГОСТ 4166-76, осушали в сушильном шкафу при 150С.
Силикагель - марки "Л" 100/400 для хроматографии, предварительно просеивали, отбирая фракции 100/250, которые использовали в работе.
Уксусная кислота (ледяная) - марки "хч", ГОСТ 61-75, очищали вымораживанием.
Уксусный ангидрид - марки "ч", ГОСТ 5815-77, дополнительно очищали перегонкой.
Фосфор красный - технический, ГОСТ 8655-75, использовали без предварительной очистки.
Перхлорат серебра - получали перемешиванием карбоната серебра с хлорной кислотой, без доступа света. Осадок отфильтровывали и промывали водой, затем спиртом и диэтиловым эфиром. Полученный продукт использовали сразу же в реакции.
Хлористый кальций - марки "ф", ФС 42-2567-88, осушали в сушильном шкафу при 120С.
Четыреххлористый титан - марки "ч", очищали перегонкой в среде аргона.
Эфират трехфтористого бора - марки "ч", осторожно перегоняли в среде аргона.
