Выделение и структурно-функциональные свойства сексстероидсвязывающего глобулина крови человека Сурвило Леонид Иосифович

Содержание к диссертации

Введение

1. Белки плаэлы крови млекопитащих, сшзыващие половые стероидные гоблоны 7-34

1.1. Основные свойства сексстероидсвязывающего глобулина (ССГ) в составе плазмы крови 7-13

1.2. Выделение и очистка ССГ 13-17

1.3. Физико-химические свойства ССГ 17-25

1.4. Краткие сведения о не специфических стероидсвязыващих белках сыворотки крови 25-28

1.5. Физиологическая роль ССГ 29-34

2. Деление и очистка ссг сыворотки крови человека. 35-61

2.1. Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на ДГТ-сефарозе 36-45

2.2. Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле 45-54

2.3. Очистка ССГ 54-61

3. Физико-химические свойства ССГ 62-86

3.1. Электрофоретические и гидродинамические свойства ССГ 62-70

3.2. Стероидсвязывающие свойства ССГ 70-78

3.3. Спектральные свойства ССГ 79

3.4. Химические свойства ССГ 79-86

4. Взаимодействие ССГ С плазматическими мембранами клеток дещщуальной ткани человека 87-106

5. Экспериментальная часть 101-131

ВыводЫ 132

• Выделение и очистка ССГ
• Физиологическая роль ССГ
• Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле
• Стероидсвязывающие свойства ССГ

Введение к работе

Важное место в процессах биорегуляции, обеспечивающих жизнедеятельность организма, принадлежит стероидным гормонам. В русле крови большая часть стероидов находится в связанном с белками состоянии. Стероидные гормоны связываются как специфическими, так и неспецифическими глобулинами плазмы крови млекопитающих. Связанные стероидные гормоны на пути к тканям-мишеням защищаются от действия ферментов, неспецифической адсорбции в крови и лимфатических узлах, чрезмерного метаболизма в печени и повышенной почечной экскреции. . Эти белки облегчают перенос гормонов от места их биосинтеза в ток крови. Считают, что связывающие глобулины выполняют в организме регуляторную функцию, ограничивая поступление гормонов в ткани-мишени. Однако, наряду с экспериментальными подтверждениями биологической инертности связанных стероидов, имеются факты, указывающие на возможную активную роль связывающих глобулинов крови. Так, в экспериментах с адреналэктамированными крысами было обнаружено повышение активности тирозинаминотрансферазы в печени и уменьшение концентрации лимфоцитов в периферической крови при инъекции как свободного кортизола, так и комплекса транскортин-кортизол. В нашей лаборатории было показано, что асиалотранскортин и нативный комплекс транскортин-кортизол специфически связываются плазматическими мембранами клеток печени человека - ткани-мишени для глюкокор-"тикоидных гормонов. Физиологическое значение этого явления может состоять в том, что в организме человека имеется специальный механизм регуляции уровня транскортина в крови, отличный от известного общего механизма десиалирования гликопротеинов в крови и катаболизма асиалогликопротеинов в печени. Кроме того, взаимодействие комплекса транскортин-кортизол с мембранами клеток печени может способствовать проникновению гормона в клетки-мишени, увеличивая ІП ІЛАЮ локальную концентрацию комплекса транскортин-гормон в ткани-мишени.

В плане систематического изучения в нашей лаборатории взаимодействий комплексов специфические связывающие глобулины крови -стероидные горюны с плазматическими мембранами клеток тканеїИли-шеней стероидных гормонов представляло интерес исследовать взаимодействие сексстероидсвязывающего глобулина (ССГ) крови человека в комплексе с эстрадиолом с плазматическими мембранами клеток де-цидуальной ткани человека - ткани^лишени эстрадиола. В этой связи было необходимо разработать эффективную методику выделения и очистки данного глобулина и детально изучить его физико-химические свойства, так как анализ литературных данных показал, что имеющиеся сведения о свойствах ССГ крайне противоречивы.

Целью настоящего исследования явилась разработка методики препаративного выделения и очистки ССГ из сыворотки крови человека, а также исследование структурно-функциональных свойств данного глобулина крови.

Настоящая работа выполнена в рамках научно-технической проблемы 0. 74. 05. "Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии и молекулярной генетики в народное хозяйство".

Приступая к исследованию ССГ человека мы располагали сведениями об уровнях этого глобулина в крови. Были предложены способы выделения и очистки глобулина, изучались его некоторые физико-химические свойства.

Научная новизна данной работы состоит в том, что впервые проведено структурно-функциональное изучение ССГ человека. В резуль- -5-тате выдвинуты и обоснованы следующие положения.

Разработана высокоэффективная методика препаративного выделения ССГ из сыворотки крови человека, включающая стадии аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле, сульфат-аммонийного фракционирования, гель-хроматографии и аффинной хроматографии на иммобилизованном конканавалине А. Методика позволяет из 2 л сыворотки ретроплацентарной крови человека выделить до 10 мг ССГ в чистом виде (выход белка составляет, примерно, 25%).

ССГ состоит из одной полипептидной цепи, содержит 10,5% углеводов и имеет молекулярную массу ~ 50 000. Этот белок имеет коэффициент седиментации 4,7 5 , из о электрическую точку при рН 5,75, коэффициент экстинкции (А;?зо т_см) 10,5, константы ассоциации ССГ с дигидротестостероном, тестостероном и эстрадиолом равны 4,5'Ю⁸ М"¹, 2,7Т0⁸ М"¹, 2,2Т0⁸ ЇГ¹, соответственно. Выяснено влияние ряда физико-химических факторов на комплексообразование ССГ со стероидами. Установлены аминокислотный и моносахаридный составы ССГ.

Показано, что комплекс ССГ-эстрадиол избирательно и с высоким сродством взаимодействует с плазматическими мембранами клеток де-цидуальной ткани человека - ткани-мишени эстрадиола. Определены следующие равновесные параметры данного взаимодействия: константа диссоциации равна (3,2 і 1,9) ТО""¹² М и максимальная связывающая ёмкость 5 фмоль/мг мембранного белка.

Найдено, что после солюбилизапии плазматических мембран с помощью 2%-еото холата натрия компоненты мембран в растворе сохраняют способность связывать комплекс ССГ-эстрадиол, что открывает принципиальную возможность выделения и изучения их физико-химических свойств.

Указанные положения выносятся на защиту.

Полученные данные о взаимодействии комплекса ССГ-эстрадиол с плазматическими мембранами клеток децидуальной ткани заставляют по-новому взглянуть на роль специфических связывающих глобулинов крови в механизме гормонального действия стероидов. Полученные результаты могут иметь практическое значение в области здравоохранения. В диагностических целях и при терапии заболеваний, связанных с нарушениями функционирования эндокринной системы, по-видимому, следует учитывать уровень ССГ в крови. Разработанный в ходе выполнения настоящей работы способ выделения ССГ из сыворотки крови человека признан Государственным Комитетом СССР по делам изобретений и открытий изобретением.

Г І А В A I

БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЛЖОПИТАКВДХ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ПОЛОВЫЕ СТЕРОИДНЫЕ ГОШОШ (Обзор литературы). I. I. Основные свойства сексстероидсвязывающего глобулина (ССГ) в составе плазмы крови.

Первое сообщение о наличии в плазме крови человека белка, специфически связывающего половые стероидные гормоны, относится к 1958 году. В этом году Дофадей /I/ методом равновесного диализа обнаружил, что фракция плазмы крови ІУ по Кону, содержащая в основном оС- и ^-глобулины, проявляет к тестостерону большее сродство, чем альбумин. В последующие годы это наблюдение подтвердили другие авторы, которые использовали равновесный диализ /2/, уль-трафильтранию /3/ и гель-хроматографию /4/. Первое более детальное исследование ССГ было проведено в 1966 году. В работе /5/ исследовалась фракция ^-глобулинов, полученная при электрофорезе на бумаге плазмы крови человека. Оказалось, что данная фракция связывает радиоактивный эстрадиол с высоким сродством и имеет низкую ёмкость. Эти же авторы показали, что специфический связывающий белок устойчив при диализе, многократном замораживании-размораживании плазмы, а при хранении в замороженном состоянии при -20 сохраняет в течение года стероидсвязывающие свойства. Однако, инкубация плазмы при 40 в течение часа приводила к его частичной инактивации, а при 60-65 наблюдалась полная потеря способности плазмы крови специфически связывать половые стероидные горюны.

Затем было показано /6/, что способность сыворотки крови человека связывать тестостерон оставалась практически постоянной при значениях рН 6-8. При значениях рН меньше 5 и больше 10 наблюдалось её резкое падение. В работе /7/ методом равновесного диали- за было показано, что уровень связывания тестостерона сывороткой крови человека резко возрастает при беременности, однако мало меняется при нормальном менструальном цикле. Авторами работы /8/ была проведена количественная оценка связывающей способности сыворотки крови человека в норіє и при беременности. В нормальном состоянии сыворотка крови способна связывать тестостерон в количестве 1-2 мкг/100 мл сыворотки. При беременности связывающая способность возрастает до 6 мкг/100 мл сыворотки. В этой же работе отмечено, что связывающая способность сыворотки крови человека значительно возрастает при эстрогенной терапии. Так, при приёме пациентами по 0,5 мг этинилэстрадиола ежедневно на протяжении 10 дней, связывающая способность сыворотки крови возрастала до 4,6-6 мкг/100 мл. На основании данных равновесного диализа и ультрафильтрации в работе /9/ был сделан вывод о том, что связывающая способность сыворотки крови мужчин в отношении половых стероидных гормонов, примерно, в 2 раза ниже, чем женщин. В работе /10/ для адсорбции из сыворотки крови человека комплекса ССГ с радиоактивным дигидротестостероном (ДЕТ) были использованы диски ДЕАЕ-целлюлозы. Полученные данные показывают, что связывающая способность сыворотки крови небеременных женщин в 4 раза ниже связывающей способности сыворотки беременных, но в свою очередь, примерно, в 2 раза превосходит связывающую способность сыворотки крови мужчин. Авторы работы /II/ обнаружили свойство ССГ сыворотки крови человека адсорбироваться на матрице, содержащей иммобилизованный конканавалин А. Используя такие матрицы, авторы работы /II/ определили связывающую способность сыворотки крови женщин равную в норле 2,6 мкг ДТТ/100 мл сыворотки, а при беременности - 6,05 мкг ДТТ/100 мл сыворотки. Используя данный подход, авторы работы /12/ определили концентрацию ССГ в плазме крови мужчин и женщин, которая составила 18,4 нмоль и 33,1 нмоль, соответственно. Вывод о возрастании связыващей способности сыворотки крови человека при беременности и эстрогенной терапии сделан также в работах /13-16/. В таблице I представлена совокупность данных по связыващей способности сыворотки крови человека при различных физиологических состояниях организма.

Таблица I

Связывающая способность сыворотки крови человека по отношению к половым стероидным гормонам при различных физиологических состояниях организма.

Данные о распределении ССГ у млекопитающих фрагментарны и в некоторых случаях противоречивы. Мурфи /17/ обнаружила тесто-стеронсвязывающие свойства у сыворотки крови коровы, но не обнаружила их у сывороток крови крысы, кролика и собаки. Вен /18/ -10-сообщил о наличии ССГ у обезьян HeSUS топ&Ш, коров, овец, слонов, собак, львов, кроликов, кенгуру. У свиней, верблвдов, ослов, крыс и мышей ССГ, по данным Вена, отсутствует. По данным работы /19/ ССГ отсутствует у крыс, морсішх свинок, хомяков, собак и котов. В крови коров, овец и кроликов ССГ присутствует. В работе /20/ было показано, что у крыс-самцов ССГ появляется только в шестинедельном возрасте. В крови крыс-самок ССГ отсутствует в возрасте 5-43 дня. Возможно, данный факт объясняет то, что некоторые исследователи /17-19/ не обнаружили ССГ в сыворотке крови крысы.

В ранних работах была изучена специфичность цельной плазмы крови человека и фракции ^0-глобулинов по отношению к половым стероидным гормонам. Стино /6/ нашел, что эстрон замещает тестостерон в связывающем центре белка, в то время как эстриол, добавленный в равных количествах в бесстероидную плазму крови человека не оказывает такого действия. В работе /21/ было показано, что кор-тизол, прогестерон, эпитестостерон и Д -андростерон не конкурировали с тестостероном за связывающий центр ССГ сыворотки крови человека. Напротив, 17 <к-метилтестостерон обладал таким же сродством к белку, как и тестостерон, а эстрадиол был лишь несколько менее конкурентноспособен, чем последний. Рознер /22/, используя плазму крови человека, показал, что эстрон, эстрадиол, дегидроэпи-андростерон, андростерон, 17 d -оксипрогестерон и 19-нортестосте-рон конкурируют с тестостероном за активный центр молекулы ССГ. Авторы работы /23/ использовали фракцию ІУ по Кону сыворотки крови человека после её хроматографии на DEhE -целлюлозе и сефадексе и -200. Методом равновесного диализа было установлено, что связывающий центр молекулы ССГ один и тот же для тестостерона и эстра-диола. Константы диссоциации (К_дис) при 4 для тестостерона и эстрадиола имели значения 0,6'Ю""⁹ М и 1,7*I0~⁹ М, соответ- ственно. Впоследствии эти же авторы /24/, также используя фракцию ІУ по Кону сыворотки крови человека, привели значения констант ассоциации (К_а) для тестостерона (1,2*ТО⁹ М"¹) и эстради- ола (0,5*10 М~^х). Другие авторы /25/ получили более низкие значения K_Q ССГ с данными гормонами (4,5*Ю⁸ М"¹ и 0,4*Ю⁸ М"¹ для тестостерона и эстрадиола, соответственно). В работе /26/ было показано, что тестостерон, 3fi ,11 fi -диокси-5оС-андростан, 3d Д7оС-диокси-5оС-андростан, 3fi _tI7j3 -диокси-андрост-5-ен, Т7оі -метил-І7у0-окси-андрост-І,4-диен-3-он связываются ССГ примерно одинаково сильно. Слабее связывались З^б-окси-бсС-андростан-^-он, и ЗсС -окси-5оС -андростан-17-он. Наконец, 17

Авторы работы /27/ показали, что с ростом температуры К_а ССГ с тестостероном заметно уменьшается. Так, при 4 K_a=3,I'I0⁹ М , при 25 К_а=1,2*Ю⁹ М""¹, при 37 К_а=0,7'10⁹ М"¹. Аналогичную закономерность обнаружили и другие исследователи /28/.

Используя цельную плазму и частично очищенные препараты ССГ человека и кролика отдельные группы исследователей /29-36/ изучили некоторые физико-химические свойства данных белков. Так, в работах /29-31/ гель-фильтрацией оценили кажущуюся молекулярную массу ССГ человека, которая оказалась равной 100 000-120 000. Корвел /32/ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) вычислил молекулярную массу ССГ человека, которая составила 98 000. Значение 52 000 было получено равновесным ультрацентрифугированием /24/. В последнем случае Рознер /28/ обнаружил ошибку в расчетах молекулярной массы и нашел, основываясь на дан-

Таблица 2

Стероидная специфичность ССЙ

Стероид

Относительное сродство стероида к ССГ, % /13/ : /16/ : /29/ ~.4fi -окси-5о( -андростан-3-он 300 > ск -метил-І7/ -окси-5о( -андростан-3-он

5 f>, 14fi -диокси-5о( -андростан 160 \<А Д7у6 -диокси-5о( -андростан 160

Тестостерон 100 >е( -метил-Г7/5 -окси-андрост-4-ен-З-он Jy8 ,17)8 -диокси-андрост-4-ен 93

Id ,17^ -диокси-андрост-5-ен

Эстрадиол 62 Tlfi -окси-андрост-1,4-диен-З-он \fi ,17$ -диокси-андрост-5-ен 50 '.7сі -метилтестостерон 38 \Ы -метил-Г7)8 -окси-андрост-4-ен-З-он \fo , IIfi -диокси-5/J -андростан 24 :9-нортестостерон 22 ^s Радиоактивномеченным стероидом был тестостерон. ных работы /24/, что её величина должна составить 104 000. Позд- о нее появились данные о радиусе Стокса ССГ (45-47 А), его коэффициенте седиментации ( 52^=5,3 ) и фрикционном отношении {(Ifо =1»48) /32-36/. ССГ сыворотки крови мужчин фокусировался в градиенте рН от 3 до 10 в виде одной полосы с pl=5,4 /33/. В более узком градиенте рН от 4 до 10 была обнаружена микрогетерогенность белка /34/. для ССГ кролика /35/ значения величин радиуса Стокса (44-43 о _п

А), коэффициента седиментации {Ь_г0ш=^Л ) и изоэлектрической точки (pl=5,2) были несколько ниже, чем для ССГ человека /35/. По данным гель-электрофореза в ПААГ была вычислена кажущаяся молекулярная масса ССГ кролика, равная 74 000-75 000 /35,36/. Этот белок более отрицательно заряжен, чем ССГ человека. При 0 комплекс ССГ кролика с ДГТ диссоциирует значительно быстрее ( іі/2=5,2 мин), чем комплекс этого стероида с ССГ человека (j/2=67 мин). Стероидная специфичность данных белков подобна и может быть представлена следующим образом: ДГТ > андростандиол> >тестостерон» прогестерон, 4-андростен-3,17-дион и кортизол. В работе /35/ была также вычислена К_а ССГ кролика с ДГТ, которая оказалась равной 1,9*10⁹ М"¹ при 0 и 1,240⁸ М""¹ при 37. Близкое значение К_а=І,4'Дг М"*¹ при 4 было получено ранее /37/. Сродство ССГ кролика к тестостерону (К_а=6,16*Ю М*~* при 4) было выяснено также в работе /35/.

I. 2. Выделение и очистка ССГ.

В ряде ранних работ были предприняты попытки получения ССГ в чистом виде /24,30,31,38,39/. Для этого сыворотку крови первоначально фракционировали сульфатом аммония /30,38/ или полиэти-ленгликолем /39/. В работе /24/ в качестве исходного материала была выбрана фракция ІУ по Кону. Дальнейшая очистка ССГ осуществлялась хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Заключительной стадией очистки была хроматография на сефадексе 6 -200 /24, 30, 38/. Другие исследователи после хроматографии фракции ІУ по Кону на ДЕАБ-целлюлозе, осуществляли сульфат-аммонийное фракционирование и хроматографию на сефадексе б -200,/31/. Конечный результат, достигнутый авторами этих работ, - получение частично очищенных препаратов ССГ, связывающая способность которых была значительно ниже, чем в исходной сыворотке крови.

Бурнштейн /40/ впервые предпринял попытку выделить ССГ сыворотки крови человека с помощью аффинной хроматографии. Аффинный сорбент был получен присоединением Зуб -амино-Г^З -окси-5оС -андрос-тана к сефарозе, активированной бромцианом. Инкубация сыворотки крови с аффинным сорбентом приводила к уменьшению стероидсвязыва-ющей активности сыворотки крови на 75$. Однако, в аффинном элюате удалось обнаружить только 0,4$ секстероидсвязывающей активности сыворотки. Авторы считают, что такой низкий выход связан с инактивацией ССГ в течение всего процесса выделения. Рознер /41/ показал, что добавление в сыворотку ионов кальция, глицерина, а также проведение процесса выделения при низких температурах, заметно уменьшает инактивацию ССГ. Было также найдено, что связывающая способность конечных препаратов ССГ выше, если процесс выделения проводить в трис-малеиновом буфере, а не в фосфатном, глицин-ацетатном и ими-дазольном буферах. После установления этих фактов Рознер /42/ применил аффинную хроматографию для выделения ССГ. Аффинный сорбент был приготовлен путём последовательного присоединения к сефарозе 4 В эпихлоргидрина, азодианилина и 3-гемисукцината андростандиола. Источником ССГ служила фракция ІУ по Кону сыворотки крови человека. Схема выделения включала фракционирование сульфатом аммония, аф- -15-финную хроматографию, гель-хроматографию на сефадексе б -150 и изоэлектрофокусирование в градиенте. рН 4-6. При данной схеме выделения из 280 г сырья было получено 6,5 мг конечного продукта, который хотя и сохранял стероидсвязывающую активность (2,3 мкг ДГТ/ мг белка), но содержал около 20$ примесей. Введя в данную схему выделения дополнительную хроматографию на сефадексе б -150 и дополнительное изоэлектрофокусирование эти же авторы /28/ получили ССГ в чистом виде с выходом около 1%, Гомогенность полученного препарата белка доказывалась электрофорезом в ЇЇААГ и электрофорезом в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (D5 ~Nll ). Дополнительным указанием на гомогенность служило обнаружение одного связывающего участка на молекулу белка.

В работе /43/ было исследовано несколько типов аффинных матриц, использованных для выделения ССГ из сыворотки крови человека. Сравнивались матрицы, содержащие связанный через различные гидрофобные пространственные вставки 17 ft -эстрадиол-3-0-гемисукцинат и 17^ -гемисушданатдигидротестостерон. Матрицы, содержащие иммобилизованный эстрадиол, оказались мало эффективными. Наиболее удачной оказалась 3-0-дигидротестостерон-3,3 -диаминодипропил-агароза. Схема выделения состояла из фракционирования сыворотки крови сульфатом аммония, аффинной хроматографии и препаративного гель-электрофореза. При использовании данной методики из I л сыворотки крови было выделено 0,5 мг гомогенного ССГ с выходом Ъ%, Низкий выход авторы объясняли инактивацией ССГ в процессе выделения. Позднее /44, 45/ эта группа исследователей модифицировала процедуру выделения и очистки ССГ. Был предложен новый аффинный сорбент - 5оС~ди-гидротестостерон-І7^ -гемисукциниламиноэтил-(1,4-бутандиол дигли-цидиловый эфир)-агароза. Используя прежнюю схему выделения, авторы из I л сыворотки крови получили 3,4 мг чистого ССГ с выхо- дом 34$. Такой положительный эффект, по мнению авторов, дало применение нового аффинного сорбента, снижение температуры элкщии белков с аффинной колонки с 25 до 4, а также применение прибора для электрофореза в ПААГ более совершенной конструкции. Наконец, Петра и Левис /46/ синтезировали аффинную матрицу, которая содержала иммобилизованный за I7ol -положение ДЕТ. По мнению авторов, для специфического связывания ДТТ с ССГ важны свободные 3-кето и Ylfi -оксигруппа стероида. Заменив в схеме выделения /44/ стадию сульфат-аммонийного фракционирования на ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, авторы работы /46/ из 2 л сыворотки крови человека получили 12,6 мг ССГ с выходом 63$. Игбел и Джонсон /47/ предложили свой способ выделения и очистки ССГ. Схема выделения включала аффинную хроматографию на андростандиол-сефарозе, хроматографию на сефарозе, содержащей иммобилизованный краситель кибакрон голубой и гель-хроматографию на сефадексе 6 -150. Такая схема выделения позволяла из 4 л сыворотки крови человека получать 5 мг ССГ с выходом около Ъ%, Группа французских исследователей /48/ предложила использовать следующую схему выделения и очистки ССГ: фракционирование сыворотки крови сульфатом аммония, аффинная хроматография на 1сЛ-карбоксшлетил-5оС-дигидротестостероне, коньюгированном с аминогексил-сефарозой, и препаративный гель-электрофорез. Данная схема выделения и очистки позволяла получать ССГ из сыворотки крови человека с выходом 28$. Группа исследователей из Швеции /49/ эбнаружила, что аффинная хроматография сыворотки крови на кортизол-зефарозе приводит к выделению двух специфических стероидсвязываю-цих белков - транскортина и ССГ. Разделение' последних осуществляюсь хроматографией на фенил-сефарозе. Выход чистого ССГ составил жоло 18$.

Наряду с изучением ССГ сыворотки крови человека были предпри- няты попытки выделения и очистки данного белка из сывороток крови млекопитающих. В работе Рознера /37/ ССГ кролика был частично очищен по следующей схеме: насыщение сыворотки крови 50$-ным сульфатом аммония, препаративный гель-электрофорез и гель-хроматография на сефадексе б -200. Петра /45/, использовав аффинный сорбент и методику, разработанную для выделения и очистки ССГ человека /44/, выделил ССГ кролика в чистом виде с выходом около 25$. Группа японских исследователей для выделения ССГ быка /50/, собаки /51/, крысы и кролика /20/ в качестве аффинного сорбента использовала тестостерон, модифицированный у C/j^ и коньюгировашшй с аминогексил-сефа-розой. Очистка белка осуществлялась на колонке с гидроксиапатитом. Выход ССГ из сыворотки крови быка, собаки, крысы и кролика составил, соответственно, 4,8$ /50/, 2,1$ /51/, 12$ /20/, 16$ /20/.

Оценивая описанные выше методики выделения и очистки ССГ крови человека и млекопитающих,следует отметить, что наилучшей с точки зрения выхода ССГ является методика, предложенная в работе /46/. [С недостаткам данной методики можно отнести использование в процессе очистки белка препаративного электрофореза в ПААГ, так как эти ке авторы /44/ отмечали неадекватность используемых систем для пре-іаративного гель-электрофореза.

I. 3. Физико-химические свойства ССГ.

Устойчивость природного комплекса ССГ-гормон понижается по пере очистки, а без стероида данный белок постепенно теряет свои звязывающие свойства даже в присутствии белков сыворотки /44/. Эта проблема ранее специально не изучалась, и первые попытки очистить 5СГ человека закончились неудачей /24, 30, 39, 40/. Позднее Рознер '41/ показал, что ионы кальция, трис-(оксиметил) аминометан и глицерин стабилизируют стероидсвязывающие свойства ССГ. В последующих работах, посвященных выделению и очистке ССГ, преимущественно использовали трис-//Г буферы, содержащие глицерин и (или) ионы кальция /28, 42-49/.В работе /43/ была изучена стероидсвязывающая активность ССГ во фракции, полученной при осаждении белков сыво -ротки крови человека сульфатом аммония.Было показано, что насыщающие концентрации ДТГ или высокие концентрации глицерина (10-50%) дают возможность в течение нескольких часов сохранять практически неизменными стероидсвязывающие свойства белка. Отделение стероида из чистого бинарного комплекса ССГ-гормон приводит к быстрой и необратимой инактивации белка в растворе /43/.

Основные физико-химические параметры чистого ССГ представлены в таблицах 3 и 4. Из этих данных следует, что значения молекулярной массы ССГ человека, рассчитанные разными авторами, варьируют в широких пределах. Они, в первую очередь, зависят от метода анализа, хотя существуют серьёзные расхождения в результатах, полученных с помощью одного и того же метода. По-видимому, это связано с тем, что ССГ содержит олигосахаридные цепи, а также необходимо принять во внимание склонность белка к агрегации /44/. В работе /44/ после проведения равновесного ультрацентрифугирования гомогенного ССГ в трубочках ПААГ было выявлено несколько белковых зон. Проведение электрофореза в ШАГ в присутствии uS-Na и fi -меркаптоэтанола выявило одну белковую зону. На основании данных экспериментов был сделан вывод о том, что происходит агрегация белка в процессе ультрацентрифугирования.

Аномально высокие значения кажущейся молекулярной массы ССГ (100 000 - 120 000), определённые гель-фильтрацией и высокие значения фрикционного отношения (табл. 3), вероятно, могут свидетельствовать о высокой степени гидратации белка и (или) ассиметрии белковой глобулы. Молекулярную массу ССГ крови беременных женщин не удалось определить равновесным ультрацентрифугированием в на-тивных условиях, так как белок агрегировал. Значение молекулярной массы ССГ, равное 36 335, было получено ультрацентрифугированием белка в 6 М гуанидинхлоргидрате (табл. 3). Сопоставляя эти результаты с данными гель-электрофореза, автор работы /45/ высказал предположение, что ССГ представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субьединиц. Игбел и Джонсон /47/ на оснований данных электрофореза в ПААГ в присутствии bS~Nci рассчитали молекулярную массу ССГ, которая оказалась равной 86 000. Однако, при добавлении в пробы перед электрофорезом 1% ,^-мер-каптоэтанола электрофоретическая подвижность белка соответствовала молекулярной массе 20 000. По мнению авторов, молекула ССГ состоит из четырех идентичных субьединиц. По данным Бона /52/, проведение электрофореза ССГ в ПААГ в присутствии bS~Nu с добавлением и без добавления fi -меркаптоэтанола свидетельствует о том, что молекула ССГ человека состоит из четырех субьединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу 16 000. Французские исследователи /48/ на основании данных электрофореза в денатурирующих условиях также склонны считать, что молекула ССГ состоит из субьединиц, однако количество последних не указывается. В то же время Рознер /28/ показал, что присутствие в денатурирующей среде ^б-меркаптоэтанола не влияет на электрофорети-ческую подвижность ССГ человека. Аналогичное наблюдение сделали авторы работы /44/. В литературе имеются также сведения о молекулярных массах (табл. 3) и строении ССГ бшш /50/, собаки /51/, крысы /20/ и кролика /45/. Молекула ССГ быка, по-видимому, состоит из трех субьединиц, а кролика из двух.

Изученные физико-химические свойства ССГ млекопитающих показывают, что эти белки имеют много общего. Так, молекулы этих бел- ков содержат олигосахаридные цепи, имеют близкие молекулярные массы (табл. 3) и характеризуются субьединичным составом. Для них характерно высокое содержание гидрофобных аминокислот (табл. 4). На основании выполненных аминокислотных анализов ССГ трудно сделать какие-либо другие выводы, так как для ССГ человека количественный состав аминокислот значительно различается в отдельных работах /28, 45, 48, 49/, а для ССГ других видов имеются только единичные сообщения /20, 45, 50, 51/. В работе /20/ было показано, что связывающие свойства ССГ крысы и кролика подобны: данные белки проявляют высокое сродство к тестостерону, ДТТ, ЗоС , 11 fi -диокси-5оС -ан-дростану и слабо взаимодействовали с эстрадиолом, прогестероном и кортизолом.

Однако между отдельными представителями ССГ млекопитающих имеются и существенные различия. Так, ССГ кролика имеет значительно более низкую K_Q с эстрадиолом, чем ССГ человека. ССГ кролика и человека проявляют более высокое сродство к ДТТ, чем к тестостерону. Обратная зависимость имеет место в случае ССГ быка (табл. 3). ССГ кролика заметно отличается по электрофоретической подвижности от ССГ других видов и его поведение в нативных условиях подобно оС-глобулинам. ССГ кролика более чувствителен к тиольным реагентам, чем ССГ человека. В свою очередь последний теряет активность в присутствии дитиотреита и после обработки глиоксалем и циклогек-сандиолом. Это предполагает, что дисульфидные связи, а также остатки аргинина и лизина важны для связывания стероидов /45/.

Содержание Сахаров в молекулах ССГ млекопитающих различается в широких пределах, причём самое низкое значение получено для ССГ собаки, а самое высокое - для ССГ кролика.

Выделение ССГ человека и кролика в чистом виде дало возможность получить к ним моноспецифические антитела /45/. Антитела, ::.. -

Физико-химические параметры ССГ млекопитающих.

Параметры :ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ чело-:ССГ быка:ССГ соба-:ССГ кро- :века /28/:века /45/:века /47/:века /48/:века /49/: /50/ :ки /51/ :лика /45/

8 : 9

4,6 5,3 5,0 см³/г 0,692 0,707 0,730 0,730 0,698 м

Молекулярная масса 36 335^й 28 400^й 76 000^й~ 36 478^й

94 000^ий 52 000^ий 20 000^ий 67 000^ий 52 000^ий 57 000^ий

88 GOO*** 94 ООО³⁹^ "

1,87 1,26 1,27 1,42 1,26

Радиус Стокса, X 55,5 37,4 38,0 ^А2І30,Ісм ⁵'^{5 І2,34 І0}»^{1 І2}'⁴⁶

Электрофоретическая подвижность pi 5,51 4,78 ІД-ІСГ ' 1,1-10'

2,4-Ю⁹

2,4*10'

0,6'ПГ 0,21-10"

Содержание углеводов, % К_а при 4, М"¹ с тестостероном

С дтт с эстраднолом

Число связывающих участков на молекулу один ІД-І0⁸ 5,58-Ю⁸ 3,0'ГО⁸ 1,43-Ю⁸ 1,2'Ю⁹

О,12-10

Молекулярная масса определена равновесным ультрацентрифугированием в денатурирующих условиях. -"'"Молекулярная масса определена электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях. ^ї9й^у1олекулярная масса определена электрофорезом в ПАЯ¹ в нативных условиях.

Таблица 4 Аминокислотный и углеводный состав ССГ млекопитающих.

Амино-: ССГ че-:ССГ че-: ССГ че-:ССГ че-: ССГ :ССГ кро-:ССГ со-кисло-: ловека :ловека : ловека :ловека : быка: лика : баки ты : /28/ : /45/ : /47/ . : /49/ :/50/ : /45/ :/51/ V"P7TO— v X «/Aw * воды :2: 3: 4:5: 6:7:8

1,1 5,3 1,1

31,6 6,5

33,0 5,2

12,9 30,0 7,0

7,7 30,7 2,0

Рис 2 2,2 14,6 Man 25 22,0

20,2 Gal 27 26,0 GlcUAc 45 19,8 34,0 NeuAc 35 15,4 29,2

Содержание отдельных аминокислот выражено в молях на моль белка, кроме работы /45/, в которой использовали молекулярную массу олигопептида, равную 29 795 (для ССГ человека) и 25 533 (для ССГ кролика). Содержание отдельных моносахаридов выражено в молях на моль белка. полученные к ССГ человека, не реагировали с чистым ССГ кролика и с сыворотками котов, собак, коров, овец, козлов и телят. В то же время эти антитела перекрёстно реагировали с сыворотками обезьян Macaco, nemestrtna и РарСо cynocephatus. моноспецифические антитела к ССГ кролика не давали перекрёстной реакции с сыворотками крови человека, обезьян, котов, собак, козлов, коров и телят.

I. 4. Краткие сведения о неспецифических стероидсвязывающих белках сыворотки крови.

Альбумин способен взаимодействовать с многочисленными веществами самой различной химической природы /53/. Этот белок легко получить в чистом виде /54/ и в настоящее время исследователи располагают многочисленными данными о его физико-химических свойствах /55/. Альбумин образует комплексы со всеми стероидными соединениями /53/. Величина К_а для альбумин-стероидных комплексов невели- о л т ка и составляет порядка IO-ICr М . Обобщение богатого экспериментального материала по связыванию альбумином 68 стероидов различной химической структуры позволило Вестфалю /53/ сформулировать "правило полярности". Согласно этому правилу, К_дис стероид-белковых комплексов находится в обратной зависимости от числа полярных групп в молекуле стероида. В соответствии с данным правилом, более гидрофобные метаболиты стероидных гормонов связываются альбумином с большей К_а, чем сами гормоны. Так как альбумин находится в плазме крови в высокой концентрации (концентрация альбумина в плазме крови человека составляет 42 г/л /55/) и каждая молекула имеет несколько участков связывания, то его связывающая способность очень высока. По данным работы /56/ с альбумином связано примерно 40% тестостерона, циркулирующего в плазме крови мужчин и 20% тестостерона плазмы крови женщин.

Стероидсвязываюшие характеристики альбумина зависят от содержания липидов в препарате /57/. Предварительное удаление сопутствующих жирных кислот органическими растворителями или активированным углем увеличивало K_Q комплекса альбумин-стероид в 4 раза. Ре-ассоциация альбумина с липидами приводила к ингибированию взаимодействия белка со стероидом. Повышение температуры в общем случае приводит к уменьшению сродства лигандов к альбумину /58/. Однако, при связывании стероидных гормонов этот эффект не наблюдается. Для системы бычий сывороточный альбумин-тестостерон было отмечено даже увеличение K_Q при возрастании температуры от 4 до 25 /53/.

Для альбумина характерна высокая температурная устойчивость. Так, в работе /59/ было показано, что при возрастании температуры до 60 К_а хотя и уменьшается, однако количество участков связывания остаётся постоянным. Уменьшение K_Q было полностью обратимым. В температурном интервале 60-80 наблюдалась лишь частичная обратимость K_Q, а выше 80 наступала полная денатурация альбумина. Способность альбумина сохранять стероидсвязывающие свойства при температурах, значительно превышающих физиологические, широко использовалась исследователями /60, 61/ для дифференциации вкладов специфического и неспецифического связывания гормонов белками крови.

Из литературных данных /62/ по влиянию концентрации ионов водорода на К_а комплексов альбумина со стероидами следует, что депротонизация альбумина при рН 11,0 разрушает эти комплексы. В работе /63/ показано, что максимальное значение К_а наблюдалось при рН 9,5, а при рН 2,3 сродство тестостерона к бычьему сывороточному альбумину составило только 10% от максимальной величины. Ком-плёксообразованию со стероидами благоприятствует увеличение ионной силы раствора. Так, К прогестерона с альбумином сыворотки крови человека возрастала вдвое, когда концентрацию NaCE повышали от О до 4 М /64/. Интересно отметить тот факт, что 0,25-1 М СаС1_гещё в большей степени стимулировал связывание сшшмеченного ДТТ /65/. Возможно, влияние LcxLtz носит более специфический характер, чем действие других солей, так как для ионов кальция имеется около 10 участков связывания на молекуле альбумина /65/.

Орозомукоид, или (^j-кислый гликопротеин был выделен из плазмы крови человека в 1950 году /66/, но лишь спустя десятилетие было открыто его свойство образовывать обратимые комплексы со стероидами /67/. Разработана методика /68/ выделения больших количеств орозомукоида из плазмы и в настоящее время

Для <Ь j -кислого гликопротеина также характерна способность образовывать комплексы со стероидными соединениями /53/. Орозомукоид обладает большой устойчивостью к нагреванию /68-69/. Этот белок выдерживал 24-часовую инкубацию при 60 без потери связывающей способности. Лишь более продолжительная инкубация (72 ч) при этой температуре несколько снижала концентрацию активных стероид связывающих участков. Даже кратковременное кипячение /69/ не приводило к полной потере орозомукоидом стероидсвязывающей активности.

Комплексы этого белка со стероидами устойчивы в широком интервале рН /68/. Уменьшение значения рН до 2,0, или увеличение до II приводило к частичной необратимой инактивации. Как и в случае альбумина, присутствие в препаратах орозомукоида неконтролируемых количеств эндогенных липидов явилось причиной расхождений в результатах определения параметров связывания стероидов /70/. Освобождение препаратов белка от липидов повышало величину К_а примерно в 8 раз. Реассоциация орозомукоида с липидами вновь снижала число связыва- ющих участков и K_Q /71/. Орозоглукоид образует комплексы с различными стероидными гормонами. Прочность комплексов, как и в случае альбумина, согласуется с "правилом полярности" /53/. Однако, <*_г-кислый гликопротеин обладает несколько большей избирательностью при взаимодействии со стероидами, чем альбумин. Сродство данного белка к различным стероидным гормонам, по данным работ /70,72/, можно представить следующим образом (табл. 5).

Таблица 5.

Параметры связывания некоторых стероидных горюнов etj-кислшл гликопротеином.

Стероид :К_а*Ю"⁵, М : ^й : К_а, Ю"⁵

Количество связывающих участков на молекулу белка.

В работах /70,72/ было показано, что ионы таких тяжелых металлов, как На²* Си оказывают ингибирующее влияние на комплексооб-разование между орозомукоидом и стероидными гормонами.

I. 5. Физиологическая роль ССГ.

В процессах биорегуляции, обеспечивающих жизнедеятельность организма, существенную роль играют половые стероидные гормоны. Важным этапом механизма действия стероидных гормонов является их взаимодействие со связывающими глобулинами крови - ССГ и альбумином. Комплексы с данными белками - естественное состояние гормонов в крови. Так, только около 2% тестостерона в плазме крови человека находится в свободном состоянии /56/. Считают /73/, что ССГ и альбумин транспортируют стероидные гормоны в биологически неактивной форме и ограничивают таким образом поступление гормонов в ткани. Когда биосинтез стероидов усиливается, доля свободного, активного стероида возрастает. Данные глобулины защищают гормоны от действия ферлентов и кислорода, препятствуют адсорбции стероидов на стенках кровеносных сосудов, торлозят их метаболизм и экскрецию, а также облегчают перенос гормонов с места их биосинтеза в ток крови. ССГ проявляет большее сродство к тестостерону, чем к эстрадиолу. Альбумин же образует более прочные комплексы с эстрадиолом. На основании этого авторы работы /74/ предположили, что предпочтительное связывание тестостерона или эстрадиола в плазме крови должно зависеть от концентраций ССГ и альбумина'. Для проверки данного предположения были измерены концентрации свободных, несвязанных белками гормонов в различных биологических источниках, которые заметно различались по содержанию в них ССГ. Данные, приведенные в таблице 6, показывают, что по мере увеличения в сыворотке крови концентрации ССГ доля свободного тестостерона понижается в большей степени, чем доля свободного эстрадиола. Таким образом, концентрация ССГ в крови может регулировать баланс свободных, несвязанных специфическим белком половых гормонов.

Таблица 6

Содержание свободных тестостерона и эстрадиола в сыворотке крови человека при различных физиологических состояниях.

Физиологический : Содержание свободного : Содержание свобод- источник : тестостерона, % : ного эстрадиола, %

Сыворотка крови: мужчин 2,41 2,84 женщин 1,69 2,54 беременных женщин 0,81 1,35

Показано /75/, что на биосинтез ССГ влияют долговременные физиологические изменения уровней в плазме крови эстрогенов и ан-дрогенов, которые происходят в начале периода половой зрелости и после менопаузы. В течение беременности ССГ может защищать некоторые органы от повышенных уровней андрогенов. Данный белок может регулировать эффективные концентрации андрогенов и эстрогенов в крови. Биосинтез ССГ не чувствителен к краткосрочным гормональным изменениям, таким как флуктуации уровня эстрадиола в течение менструального цикла. Это по мнению авторов работы /75/, свидетельствует в пользу того, что ССГ является буферным белком, который усредняет биологическую реакцию на резіше изменения в концентрации половых гормонов.

Согласно гипотезе, выдвинутой Сэндбергом и Слаунвайтом /76/, только небольшие количества свободных, несвязанных белками гормонов выполняют биологическую функцию. Доказательствами биологичес- кой инертности связанных гормонов послужили следующие факты. Так, несмотря на значительный рост концентрации тестостерона в плазме крови беременных женщин, большие концентрации ССГ в этом состоянии препятствуют вирилизации /77/. Скорости метаболизма тестостерона и 3d ,T7J5 -диокси-5о( -андростана /78/ в плазме крови человека пропорцианальны количеству гормонов, не связанных с ССГ. В работе /79/ эксплантаты брюшной простаты крысы инкубировали с Н-тестостероном и затем в паралельних опытах вводили в среду сыворотки крови крысы, лошади и теленка, а также сыворотки крови мужчин и беременных женщин. При одинаковых концентрациях сывороток поглощение тестостерона и 3d ,17,$ -диокси-5о( -андростана, а также количества образовавшихся 5оС-ДГТ и андростандиола, были значительно ниже в эксплантатах, которые инкубировались с сывороткой беременных женщин. В работе /80/ была изучена трансформация тестостерона микросомами плаценты человека. Уже в первые минуты реакции исследователи наблюдали уменьшение концентрации тестостерона и пропорциональное увеличение концентрации эстрадиола. Этот процесс замедлялся при связывании тестостерона "активной фракцией белков", полученной из сыворотки крови беременных женщин и высокими концентрациями альбумина. После предварительного прогревания "активной фракции белков" при 60 в течение 30 минут их тормозящее действие полностью исчезало. для выяснения вопроса, что же является лучшим параметром ан-дрогенности в ряде работ /81-83/ были определены общий тестостерон и концентрация свободного гормона в плазме крови здоровых и больных людей. Нашли, что уровень свободного тестостерона понижается с возрастом. Это особенно ощутимо в возрастной группе 50-70 лет. В то же время общий тестостерон плазмы остается на прежнем уровне. В период полового развития подростков концентрации общего -32-тестостерона и свободного горлона растут. Последний параметр достигает величины, характерной для взрослых людей, при полной половой зрелости. У мужчин с гипогонадизмом и гирсутных женщин более выражены, по сравнению с нормой, изменения концентраций свободного тестостерона. При беременности и у больных гиперти-реозом обоего пола, несмотря на увеличение уровня общего тестостерона в плазме крови, концентрация свободного гормона остается практически неизменной. На основании приведенных фактов, в работе /82/ был сделан вывод о том, что лучшим индексом андрогенности является концентрация свободного тестостерона в плазме крови.

Наряду с экспериментальными подтверждениями того, что только небольшие количества свободных, несвязанных белками горлонов выполняют биологическую функцию, накапливаются данные, которые не укладываются в общепринятые представления. Эти данные были получены в экспериментах, в которых использовались родственные ССГ по способности связывать в крови стероидные гормоны глобулины - тран-скортин и альбумин. Так, Рознер /84, 85/ в параллельных экспериментах ввел внутривенно адреналэктамированным крысам кортизол, транскортин вместе с кортизолом и контрольный физиологический раствор. Он обнаружил повышение активности тирозинтрансферазы в печени и уменьшение концентрации лимфоцитов в периферической крови в случае инъекции как свободного кортизола, так и комплекса транскортин-кортизол. Эти данные, возмолшо, сврщетельствуют о биологической активности связанного гормона. Данные, опубликованные в работе /86/ , также могут указывать на возможную биологическую активность связанного гормона. Было найдено, что асиало- транскортин и нативный комплекс транскортин-кортизол специфически связываются плазматическими мембранами клеток печени человека - ткани-мишени для глюкокортикоидных гормонов. Данное взаимодействие характеризуется высокой специфичностью. Так, меченый ^^-асиалотранскортин не вытеснялся из комплекса с мембранами родственными транскортину по своей способности связывать в крови низкомолекулярные гормоны ССГ и тироксинсвязывающим глобулином. Физиологическое значение обнаруженного явления, по мнению авторов, монет состоять в том, что в организме человека имеется специальный механизм регуляции уровня транскортина в крови, отличный от известного общего механизма десиалирования гликопротеинов в крови и катаболизма асиалогликопротеинов в печени. Кроме того, взаимодействие комплекса транскортин-кортизол с мембранами клеток печени может способствовать проникновению гормона в клетки-мишени, увеличивая Ш ШгО локальную концентрацию комплекса тран-скортин-гормон в ткани-мишени.

Авторы работы /87/ показали, что бычий сывороточный альбумин имеет на поверхности гепатоцитов один сайт высокого сродства (K_mxfl-{25 ± 7)* 10" М) и один сайт низкого сродства. Связанный J -меченый бычий сывороточный альбумин не вытеснялся овальбу-мином, бычьим /'-глобулином, трансферрином человека и пролакти-ном овцы (соотношение 1:10), тогда как немеченый альбумин и сывороточный альбумин крысы вытесняли меченый белок из его комплекса с мембранами. В работе /87/ был сделан вывод о том, что поверхность гепатоцитов содержит рецептор альбумина, катализирующий захват связанной с белком олеиновой кислоты и, возможно, других лигандов альбумина.

В работе /88/ исследовалась биологическая активность ксенобиотиков, связанных с сывороточным альбумином человека. Было най- дено, что чем больше К_а ксенобиотиков с альбумином, тем выше их биологическое действие.

Эти данные послужили основанием для систематического изучения в нашей лаборатории взаиглодеиствия комплексов связывающий глобулин-гормон с тканями-мишенями стероидных гормонов.

Г Л А В A II

ШДЕІЕНИЕ И ОЧИСТКА ССГ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.

Как следует из литературного обзора, для разработки методики выделения и очистки ССГ из сыворотки крови человека использовались как классические приемы белковой химии /24,30,31,38,39/, так и метод аффинной хроматографии /28,40,42-49/. Только при использовании аффинной хроматографии исследователям удалось получить ССГ в чистом виде. Источником для выделения ССГ человека служила сыворотка ретроплацентарной крови, так как она относительно обогащена данным глобулином (см. гл. I). Для выделения ССГ применяли аффинные сорбенты, полученные при коньюгировании с сефарозой лиган-дов ССГ - андростандиола /42,47/, ДТГ /43-46,48/, эстрадиола /43/.. Предложенные методики выделения и очистки ССГ различались по сложности и выходу целевого продукта. Полученные различными исследователями физико-химические параметры белка оказались противоречивыми /28,42-49/. Существенные расхождения в данных разных авторов указывали на то, что конечные препараты ССГ могли иметь белковые примеси. Поэтому большой интерес представлял синтез биоспецифических сорбентов, которые позволили бы в ходе аффинной хроматографии свести к минимуму неспецифическую адсорбцию на матрице белков крови.

При изучении связывания стероидных гормонов ССГ в составе сыворотки ретроплацентарной крови (см. гл. У) мы обнаружили, что этот глобулин, наряду с половыми стероидными гормонами, специфически связывает кортизол, хотя в последнем случае сродство стероида к белку заметно ниже. В нашей лаборатории накоплен большой опыт работы с аффинными матрицами на основе иммобилизованнного кор-тизола, которые использовались для выделения транскортина. В слу- чае применения таких матриц удается в существенной мере уменьшить неспецифическую сорбцию белков сыворотки крови на кортизол-сефаро-зе /89/.

В связи с вышеизложенным мы сочли возможным использовать кортизол-сефарозу, наряду с иммобилизованными лигандами ССГ, для разработки методики препаративного выделения и очистки данного глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови человека.

II. I. Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на ДГТ-сефарозе.

Важнейшим этапом биоспецифической хроматографии белков крови является синтез специфических аффинных сорбентов, стабильных в условиях выделения. В опубликованных работах исследователи ССГ при синтезе аффинных сорбентов, как правило, активировали сефаро-зу бромцианом /40,43-49/. Роль пространственной вставки выполняли азодианилин /28,42/, альбумин, поли-( L~tub ) /43/, диглицидило-вый эфир бутандиола-1,4 /44,45/, этилендиаминоакриламид /47/, 1,6-диаминогексан /48,49/. Предложенные в литературе схемы синтеза аффинных сорбентов были достаточно трудоемки, а химическая связь между пространственной вставкой и матрицей легко подвергалась гидролизу /90,91/.

Приступив к разработке методики выделения ССГ мы выбрали достаточно простую схему синтеза аффинных сорбентов. Активация се-фарозы производилась с помощью эпихлоргидрина. Этот способ активации позволяет избежать гидролиза химической связи между матрицей и пространственной вставкой /90/. К активированной сефарозе присоединяли 1,6-диаминогексан (матрица I) или аммиак (матрица II), а затем 17-гемисукцинат ДТГ. Результаты проведения отдельных стадий синтеза представлены в таблице 7.

Таблица 7

Количество активных групп, образующихся на разных этапах синтеза аффинных сорбентов. : Введённая активная : Количество активных Стадия синтеза : группа : групп, мкмоль/мл геля

Активация сефарозы -СН -CHg 50

Присоединение

I,6-диаминогексана (матрица I) ~^^н2 ²⁰""²⁵ - аммиака (матрица II) ~^% 40-45

Присоединение ДТТ (матрица I) ДТТ 6-8 (матрица II) ДТТ 12-16

Обе полученные аффинные матрицы были использованы для разработки методики выделения ССГ из сыворотки ретроплацентарной крови человека. Адсорбционные свойства ДГТ-сефароз мы оценивали по изменению концентрации ССГ в сыворотке крови до и после её инкубации с матрицами. Для этого сорбенты I и II инкубировали на холоду с сывороткой, из которой эндогенные стероиды были предварительно удалены углем, покрытым декстраном. Инкубация сыворотки с матрицей проводилась в трис-НС буфере при физиологических значениях рН, а для уменьшения неспецифической адсорбции белков в сыворотку добавляли хлористый натрий до 0,2 М концентрации. На рис. 1-2 и рис. 3-4 представлены зависимости величин адсорбции ССГ из сыворотки ретроплацентарной крови на ДГТ-сефаро-зах I и II от концентрации иммобилизованного ДГТ в суспензиях и продолжительности инкубации. Из полученных данных следовало, что эффективность адсорбции ССГ на матрицах I и II в значительной мере определяется количеством вносимого лиганда. При температуре 4 и продолжительности инкубации 6 ч (оптимальная продолжительность инкубации следует из рис. 2 и рис. 4) максимальные количества адсорбированного ССГ были получены при концентрации иммо-билизованного лиганда в суспензии 1*10 М. При этом уровень ССГ в сыворотке крови уменьшался в среднем на 85% при использовании матрицы І, а в случае применения матрицы II - на 50%.

После промывки аффинных матриц от балластных белков на фильтре холодным 0,05 М трис- НСС буфером рН 7,6, содержащим 0,2 М NaCl, биоспецифически адсорбированный ССГ элюировали 5* КГ⁶ М раствором ДГТ в этом же буфере. Элюцию проводили при 37. В аффинных элюатах, объем которых был сравним с объемами аффинных сор- . бентов,, обнаруживалось около 60% от адсорбированного на матрицах I и II количества ССГ. При проведении повторной процедуры элю-

Дцсорбция, %

100 .

0,001 0,01 0,1 I 10 100

Иммобилизованный ДГТ в суспензии, М 10' Рис. I. Влияние концентрации иммобилизованного ДГТ в суспензии на адсорбцию ССГ из сыворотки крови (матрица I).

Дцсорбция, %

0,001 0,01 0,1 I 10 100

Иммобилизованный ДГТ в суспензии, М 10 Рис. 2. Влияние концентрации иммобилизованного JUT в суспензии на адсорбцию ССГ из сыворотки крови (матрица II).

Дцсорбция, % *-!«-*

Время инкубации, час . Рис. 3. Влияние продолжительности инкубации ДГТ-сефарозы [матрица I) с сывороткой крови на адсорбцию ССГ.

Дцсорбция, %

Время инкубации, чао Рис. 4. Влияние продолжительности инкубации ДГТ-сефарозы (матрица II) с сывороткой крови на адсорбцию ССГ. ции в объединенных аффинных элюатах содержалось около Ш% ССГ.

Электрофорез аффинных элюатов, полученных с использованием матриц I и II, выявил ССГ, альбумин, а также небольшое количество у*-глобулинов (рис.5). При понижении температуры десорбции качественный состав белков аффинных элюатов не изменялся, в то время как выход ССГ падал и при 4 составил лишь 50% от первоначально адсорбированного матрицами глобулина. Очевидно, что матрица I более предпочтительна для выделения ССГ из сыворотки крови, чем матрица II. Возможно, это связано с более благоприятной пространственной локализацией иммобилизованного стероида.

В таблице 8 приведен количественный состав белков аффинного элюата, полученного с использованием ДТТ-сефарозы (матрица I).

Таблица 8

Количественный состав белков аффинного элюата.

Компоненты Содержание, % ^-глобулины 25

ССГ 15

Альбумин 60

Содержание белков определялось по данным денситограммы столбиков 7,5%-ного ПААГ (рис.5). Приведены данные типичного эксперимента.

Как видно из данных таблицы 8, аффинный элюат состоит более чем на половину из альбумина. Этот факт, по-видимому, можно объяснить тем, что согласно "правилу полярности" /53/, альбумин наибо- ^L570

1,0 .

Рис. 5. Денситограмма трубочки 7,5^-ного ПААГ после электрофоретического разделения белков аффинного элюата, ввделенного на ДГТ-сефарозе. Agr,Q - сплошная линия, радиоактивность связанного %-тестостерона - пунктирная. лее сильно взаимодействует с гидрофобными стероидами. Большие количества альбумина в аффинных элюатах, полученных с использованием иммобилизованного ДГТ, отмечены и другими исследователями /43-46,48/. Большое количество альбумина в аффинном элюате в дальнейшем сильно затрудняет очистку ССГ. Поэтому для уменьшения количества альбумина некоторые исследователи подвергали исходную сыворотку крови фракционированию перед стадией аффинной хроматографии /44-48/, либо после стадии аффинной хроматографии на иммобилизованном лиганде применяли хроматографию на сефарозе, содержащей иммобилизованный краситель /47/.

II. 2. Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле.

Обнаруженный нами факт специфического взаимодействия ССГ в составе сыворотки ретроплацентарной крови и кортизола (см. гл.5) дал-возможность применить для аффинной-хроматографии ССГ корти-зол-сефарозу. Для синтеза данного аффинного сорбента была использована аминосефароза, приготовленная, как и в случае ДТТ-сефарозы, коньюгированием 1,6-диаминогексана с эпихлоргидрин-сефарозой. На данной матрице был иммобилизован 21-гемисукцинат кортизола. Полученные аффинные сорбенты содержали 6-8 мкмоль кортизола на I мл геля. Затем они разбавлялись сефарозой 4В до концентрации иммобилизованного стероида I мкмоль на I мл геля.

Адсорбционные свойства кортизол-сефарозы оценивали также, как и свойства ДТТ-сефарозы (см. II. I.). На рис. 6 и рис. 7 приведены зависимости величин адсорбции ССГ из сыворотки ретроплацентарной крови на кортизол-сефарозе от концентрации иммобилизованного гормона и продолжительности инкубации сыворотки с матрицей. При температуре 4 наибольшие количества адсорбированного

Адсорбция, %

0,2 1,0 5,0 25 125

Иммобилизованный кортизол в суспензии, М*Ю Рис. 6. Влияние концентрации иммобилизованнэго кортизола в суспензии на адсорбцию ССГ из сыворотки крови.

Адсорбция, %

Время инкубации, час Рис. 7. Влияние продолжительности инкубации кортизол-сефарозы с сывороткой крови на адсорбцию ССГ. -48-ССГ ( ~ 75$) были получены при концентрации иммобилизованного лиганда 5*10 М и времени инкубации 6 ч. После отмывки кортизол-сефарозы от сопутствующих белков на фильтре холодным 0,05 М трис- НСІ буфером, рН 7,6, содержащим 0,2 М NctCi , биоспеци-фически адсорбированный ССГ элюировали при 37 5* КГ⁴ М раствором кортизола в этом же буфере. При этом в результате элюции объемом равным объему сорбента в растворе оказывалось около 80$ адсорбированного матрицей ССГ. Как и в случае ДТТ-сефарозы, понижение температуры десорбции приводило к заметному уменьшению выхода белка, который при 4 составил около 60%.

Анализ стероидсвязывающих свойств белков, обнаруженных в составе аффинного элюата, проводили с использованием ряда меченых тритием стероидов. Для этого перед проведением электрофореза к белковым пробам прибавляли следовые количества радиоактивномеченых стероидов. Меченые половые стероидные гормоны Н-ДТТ, 11-тесто-стерон и Н-эстрадиол мигрировали при электрофорезе в связанном с белком состоянии. При этом пик связанной радиоактивности совпадал с полосой fi-глобулина. Добавленные в пробу перед электрофорезом I 000-кратные избытки холодных стероидов (по отношению к радиоактивным гормонам) приводили к полной потере связанных %-ДТТ, %-тестостерона и %-эстрадиола. С целью количественной характеристики белковой системы, специфически связывающей половые стероидные гормоны, в отдельном эксперименте были определены стероидсвязывающие параметры полученного аффинного элюата. Графический анализ комплексообразования (рис. 8) показал, что аффинный элюат с высоким сродством связывает ДГТ, тестостерон и эстрадиол (К_а=4,5-Ю⁸ М""¹, К_а=2,7*10⁸ М""¹, К_а=2,2Т0⁸ М"¹, соответственно). Рассчитанная на основании данных равновесного диализа К„ чистого ССГ с кортизолом в растворе составила

_{ъ/li в-іо}⁸_,

Рис. 8. График Скэтчарда для связывания ДГГ (І), тестостерона (2) и эстрадиола (3) аффинным элюатом, выделенным аффинной хроматозтрафиеи на кортизол-сефарозе.

3,5*10 M""^x (см. III. 2.). Для ССГ в составе сыворотки ретропла-центарной крови и кортизола K_Q=3,9*I0⁶ М""¹ (см. У. I.)

Поскольку нельзя было исключить того, что сыворотка ретро-плацентарной крови содержит особый секстероидсвязывающий белок, отличный от известного в литературе ССГ (в частности, по сродству к кортизол-сефарозе), мы изучили хроматографическое поведение на иммобилизованном кортизоле других биологических источников, в которых специфическое связывание половых стероидных гормонов, по литературным данным /5-13/, обусловлено только ССГ. В таблице 9 представлены данные по К_а ССГ с ДГТ и содержанию ССГ в бесстероидных сыворотках нормальной крови доноров (отдельно мужчин и женщин), венозной крови при беременности (третий триместр), ретроплацентар-ной крови, а также указанных сывороток крови , насыщенных ДГТ (2*10 М), до и после инкубации с кортизол-сефарозой.

Как следует из данных таблицы 9, инкубация кортизол-сефаро-зы с различными биологическшли источниками ССГ приводит к существенному уменьшению их связывающей емкости без изменения сродства к ДГТ. Насыщение сывороток (в таблице показано на примере сыворотки ретроплацентарной крови) ДГТ (2 мкмоль) препятствует адсорбции ССГ на аффинной колонке.

Совокупность полученных данных дает основание говорить о том, что синтезированная аффинная матрица избирательно адсорбирует из бесстероидной сыворотки крови ССГ. В таблице 10 представлен количественный состав получаемого аффинного элюата (данные типичного эксперимента).

Таблица 9 K_Q с ДГТ и уровень ССГ в различных сыворотках крови до (А) и после (Б) инкубации с кортизол-сефарозой.

Тип крови

Параметр ССГ

Нормальная

Мужская : Женская

При беременности

Ретроплацентарная

Беестеро- + 2 мкмоль идная ДГТ

А : Б : А : Б : А

Б : А

СЮ⁷, М 4,5 1,2 6,0 1,6 32,2 6,6 37,0 7,4 37,0 35,5

К_а'10"⁸, _м-1 4,5 4,3 4,3 4,0 4,6 4,4 4,7 4,2 4,5 4,2

Концентрация (С) ССГ выражена в связывающей ёмкости (В_шкс) сыворотки крови по отношению к ДГТ. В таблице даны средние значения трех определений.

Таблица 10

Состав аффинного элюата, полученного аффинной хроматографией на иммобилизованном кортизоле.

Компоненты Содержание, % ^-глобулины ССГ

Транскортин Альбумин

Содержание белков определялось по данным денситограммы столбиков 7,5^-ного ПААГ (рис. 9). Приведены данные типичного эксперимента.

Таким образом, для выделения ССГ из сыворотки крови человека методом аффинной хроматографии имеются два возможных пути -использование в качестве аффинного сорбента иммобилизованного полового стероида (в частности ДГТ), или иммобилизованного кортизо-ла. При использовании одинаковых количеств обоих типов матриц с одинаковыми концентрациями иммобилизованных стероидов в суспензиях, ДТТ-сефароза обеспечивает несколько большую адсорбцию ССГ ( ~ 85$) из сыворотки ретроплацентарной крови, чем кортизол-сефа-роза ( ~ 75$). Оптимальные условия адсорбции ССГ (время инкубации и температура) были в обоих случаях одинаковыми. При десорбции белков с аффинной матрицы выход ССГ и в том, и в другом случае составлял, примерно, 80$. Однако, содержание ССГ а аффинном элюате, полученном на кортизол-сефарозе, выше, чем в элюате, выделенном на ДТТ-сефарозе. Так, доля ССГ в первом случае составляет имп./мин 10 ³

1,0 -

Рис. 9. Денситограілма трубочки 7,5%-ного ІІААГ после электрофоретического разделения белков аффинного элюата, выделенного на кортизол-сефарозе. A^q - сплошная линия, радиоактивность связанного *%-тестостерона - пунктирная.

20-25%, а в последнем - не превышает 15%. Важно отметить, что применение кортизол-сефарозы позволяет свести к минимуму неспецифическую сорбцию на матрице белков крови, показателем чего является низкое содержание альбумина (менее 10%) в аффинном элюате. В случае же применения ДГТ-сефарозы содержание альбумина в аффинном элюате достигает 60%. Использование аффинных элюатов, полученных с применением кортизол-сефарозы, облегчает дальнейшую очистку ССГ. Использование кортизол-сефарозы дает определенные практические преимущества при проведении дальнейшей процедуры очистки ССГ. Так, для того чтобы элюировать 80% адсорбированного ДГТ-се-фарозой ССГ необходимо процесс десорбции проводить дважды, в то время как в случае кортизол-сефарозы достаточно одной процедуры элюции. Вследствие этого аффинный элюат, полученный биоспецифической хроматографией на иммобилизованном кортизоле, более концентрирован, чем элюат с ДТТ-сефарозы. Более легкая элюция ССГ с кортизол-сефарозы, по-видимому, объясняется более низкой К_а ССГ с кортизолом (К_а=3,5'Ю⁶ М^-1), чем с ДТТ (К_а=4,5*Ю⁸ М^-1), а также более высокой растворимостью кортизола, что позволяет создать более высокую концентрацию стероида-элюента. Использование более концентрированных белковых растворов значительно ускоряет и облегчает практическое выполнение очистки ССГ.

Учитывая эти обстоятельства, в дальнейшей работе для выделения ССГ мы использовали только кортизол-сефарозу /92,93/.

II. 3. Очистка ССГ.

Аффинный элюат, полученный биоспецифической хроматографией сыворотки крови на кортизол-сефарозе, содержал, наряду с ССГ, небольшие количества альбумина, /"-глобулинов, а также транскортин (рис. 9). Из литературных данных /2/ известно, что проведение адсорбционной колоночной хроматографии в 0,005 М нат- рий-фоофатном буферном растворе (НФБ) на гидроксиапатите позволяет в одну стадию, количественно отделять транскортин от остальных белков аффинного элюата. ССГ при хроматографии на данном сорбенте элюировался 0,1 М НФБ рН 6,8 (рис. 10). Однако, применение данной стадии очистки приводило к частичной потере стероидсвязывающих участков ССГ (табл. II).

Таблица II

Количество связывающих участков ССГ после хроматографии на гидроксиапатите.

1, опыта. 13 4 5 7

Количество связыва ющих участков, % 83 76 78 80 75

Количество связывающих участков ССГ до хроматографии на гидроксиапатите принято за 100$. Представлены результаты выборочных опытов.

Потеря стероидсвязывающих участков ССГ при использовании гидроксиапатита обусловлена, по-видимому, применением НФБ. Аналогичные выводы были сделаны другими авторами /41-43/. Кроме того, данному подходу присущи и другие недостатки. Так, при применении колоночной хроматографии на гидроксиапатите предпочтительно использовать небольшие объёмы аффинного элюата, а белок, наносимый на колонку, должен быть в НФБ с низкой ионной силой (0,005 М). Так как после стадии аффинной хроматографии объём элюата в чщс-НС буфере, содержащем 0,2 М Nalt, составлял около 300 мл, то требо- имп./мин КГ³

2,0 -

1,5 -

1,0 -

0,5 -

10 20 30 40 у,мл-Рис. 10. Хроматография белков аффинного элюата на гидрокси-апатите. I - 0,005 М НФБ рН 6,8, II - 0,1 М НФБ рН 6,8. А₂₈₀ -сплошная линия, радиоактивность связанного %-тестостерона - пунктирная. валось концентрирование белкового раствора и смена буфера. Необходимо также учитывать, что гидроксиапатит обладает ограниченой ёмкостью, а методика его приготовления достаточна трудоёмка /94/. Значительно более эффективным и удобным оказалось фракционирование аффинного элюата сульфатом аммония. Ниже представлена схема разделения специфических стероидсвязывающих белков крови человека и получения ССГ в чистом виде.

Схема очистки ССГ.

Аффинный элюат

Транскортин и альбумин (супернатант) Хроматография на гидроксиапатите Чистый транскортин насыщение сульфатом аммония (280 г/л) ССГ и /"-глобулины (осадок)

Гель-хроматография на биогеле Р-300 Фракция, содержащая 90$ ССГ Хроматография на конка-I- навалин А-сефарозе Чистый ССГ

При насыщении раствора аффинного элюата сульфатом аммония до конечной концентрации 280 г/л около 90$ ССГ, а также /'-глобулины выпадали в осадок. При этом транскортин и альбумин практически нацело оставались в растворе. Количество связывающих участков ССГ в результате данной процедуры не изменялось.

Для дальнейшей очистки ССГ осадок, получаемый сульфат-аммонийным фракционированием белков аффинного элюата, после растворения, обессоливашш и концентрирования был нанесён на колонку с био- гелем Р-300, уравновешенную 0,05 М трис-//С буфером, рН 7,6, содержащим 0,1 М , 0,005 М СиС^ и Ъ% глицерина. Профиль гель-хроматографии и распределение по фракциягл радиоактивного ДТТ показаны на рис. II. Окончательной стадией очистки ССГ была аффинная хроматография на конканавалин А-сефарозе (рис. 12). При нанесении на колонку с конканавалин А-сефарозой, уравновешенной 0,02 М трис-//Г буфером рН 7,0, содержащим 0,15 М

Мпи_г (по 0,001 М) ССГ полностью удерживался аффинным сорбентом. Минорный белковый компонент, элюированный стартовым буфером, не проявлял сродства к ДТТ. Электрофоретическая подвижность данного белка (/?= 0,20 в 7,5%-ном ПААГ) была меньше, чем ССГ. Радиоактивность, обнаруженная в этом белковом пике, по-видимому, обусловлена свободным %-ДТТ, который диссоциировал из комплекса с ССГ, адсорбированным на аффинной матрице. Биоспецифическая элюция чистого ССГ достигалась добавлением 0,02 "М <К -метил-0 -глюкопиранози-да в стартовый буфер.

Предложенная методика выделения и очистки ССГ достаточно эффективна и позволяет получать около 10 мг чистого ССГ из двух литров сыворотки ретроплацентарной крови за достаточно короткий промежуток времени (5 дней). Конечный выход белка достигает 25$ (табл. 12). ^l280 ими./мин іб³

2,0 -

I.5l -

0,5 -

40 60 80 V, мл

Рис. II. Очистка ССГ на биогеле Р-300. A₂qq - сплошная линия, іадиоактивность связанного %-тестостерона - пунктирная.

имп./мин 10

10 20 30 V, мл

Рис. 12. Очистка ССГ на конканавалин А-сефарозе. A₂qq -сплошная линия, радиоактивность связанного ^-тестостерона - пунктирная. Стрелкой обозначено начало элюции 0,02 М оС-метил-fi-глю-копиранозидом.

Таблица 12

Очистка ССГ сыворотки крови человека.

Стадия очистки

Общий белок,

Связанный:Выход на :Удельная :Степень:Общий ДТГ, мкг:каждой :активность:очистки:выход, :стадии, $:мкг ДГГ/мг: : % : : белка : :

Бесстероид ная сыворот ка крови 120 000 208 Аффинная хро матография 150 156 /A/HJz SO,, -фрак ционирование 90 130 Гель-хроматогра фия на биогеле Р-300 12 58

Хроматография на конканавалин А-се- фарозе 10 52

100 1,73* КГ³ I 100

1,04 500

1,44 835

4,83 2792

5,2 3006

Данные таблицы приведены для случая выделения ССГ из сыворотки ретроплацентарной крови человека.

Выделение и очистка ССГ

В ряде ранних работ были предприняты попытки получения ССГ в чистом виде /24,30,31,38,39/. Для этого сыворотку крови первоначально фракционировали сульфатом аммония /30,38/ или полиэти-ленгликолем /39/. В работе /24/ в качестве исходного материала была выбрана фракция ІУ по Кону. Дальнейшая очистка ССГ осуществлялась хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Заключительной стадией очистки была хроматография на сефадексе 6 -200 /24, 30, 38/. Другие исследователи после хроматографии фракции ІУ по Кону на ДЕАБ-целлюлозе, осуществляли сульфат-аммонийное фракционирование и хроматографию на сефадексе б -200,/31/. Конечный результат, достигнутый авторами этих работ, - получение частично очищенных препаратов ССГ, связывающая способность которых была значительно ниже, чем в исходной сыворотке крови. Бурнштейн /40/ впервые предпринял попытку выделить ССГ сыворотки крови человека с помощью аффинной хроматографии. Аффинный сорбент был получен присоединением Зуб -амино-Г З -окси-5оС -андрос-тана к сефарозе, активированной бромцианом. Инкубация сыворотки крови с аффинным сорбентом приводила к уменьшению стероидсвязыва-ющей активности сыворотки крови на 75$. Однако, в аффинном элюате удалось обнаружить только 0,4$ секстероидсвязывающей активности сыворотки. Авторы считают, что такой низкий выход связан с инактивацией ССГ в течение всего процесса выделения. Рознер /41/ показал, что добавление в сыворотку ионов кальция, глицерина, а также проведение процесса выделения при низких температурах, заметно уменьшает инактивацию ССГ. Было также найдено, что связывающая способность конечных препаратов ССГ выше, если процесс выделения проводить в трис-малеиновом буфере, а не в фосфатном, глицин-ацетатном и ими-дазольном буферах. После установления этих фактов Рознер /42/ применил аффинную хроматографию для выделения ССГ. Аффинный сорбент был приготовлен путём последовательного присоединения к сефарозе 4 В эпихлоргидрина, азодианилина и 3-гемисукцината андростандиола. Источником ССГ служила фракция ІУ по Кону сыворотки крови человека. Схема выделения включала фракционирование сульфатом аммония, аф- финную хроматографию, гель-хроматографию на сефадексе б -150 и изоэлектрофокусирование в градиенте. рН 4-6. При данной схеме выделения из 280 г сырья было получено 6,5 мг конечного продукта, который хотя и сохранял стероидсвязывающую активность (2,3 мкг ДГТ/ мг белка), но содержал около 20$ примесей.

Введя в данную схему выделения дополнительную хроматографию на сефадексе б -150 и дополнительное изоэлектрофокусирование эти же авторы /28/ получили ССГ в чистом виде с выходом около 1%, Гомогенность полученного препарата белка доказывалась электрофорезом в ЇЇААГ и электрофорезом в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (D5 Nll ). Дополнительным указанием на гомогенность служило обнаружение одного связывающего участка на молекулу белка. В работе /43/ было исследовано несколько типов аффинных матриц, использованных для выделения ССГ из сыворотки крови человека. Сравнивались матрицы, содержащие связанный через различные гидрофобные пространственные вставки 17 ft -эстрадиол-3-0-гемисукцинат и 17 -гемисушданатдигидротестостерон. Матрицы, содержащие иммобилизованный эстрадиол, оказались мало эффективными. Наиболее удачной оказалась 3-0-дигидротестостерон-3,3 -диаминодипропил-агароза. Схема выделения состояла из фракционирования сыворотки крови сульфатом аммония, аффинной хроматографии и препаративного гель-электрофореза. При использовании данной методики из I л сыворотки крови было выделено 0,5 мг гомогенного ССГ с выходом Ъ%, Низкий выход авторы объясняли инактивацией ССГ в процессе выделения. Позднее /44, 45/ эта группа исследователей модифицировала процедуру выделения и очистки ССГ. Был предложен новый аффинный сорбент - 5оС ди-гидротестостерон-І7 -гемисукциниламиноэтил-(1,4-бутандиол дигли-цидиловый эфир)-агароза. Используя прежнюю схему выделения, авторы из I л сыворотки крови получили 3,4 мг чистого ССГ с выхо- дом 34$. Такой положительный эффект, по мнению авторов, дало применение нового аффинного сорбента, снижение температуры элкщии белков с аффинной колонки с 25 до 4, а также применение прибора для электрофореза в ПААГ более совершенной конструкции. Наконец, Петра и Левис /46/ синтезировали аффинную матрицу, которая содержала иммобилизованный за I7ol -положение ДЕТ. По мнению авторов, для специфического связывания ДТТ с ССГ важны свободные 3-кето и Ylfi -оксигруппа стероида. Заменив в схеме выделения /44/ стадию сульфат-аммонийного фракционирования на ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, авторы работы /46/ из 2 л сыворотки крови человека получили 12,6 мг ССГ с выходом 63$. Игбел и Джонсон /47/ предложили свой способ выделения и очистки ССГ. Схема выделения включала аффинную хроматографию на андростандиол-сефарозе, хроматографию на сефарозе, содержащей иммобилизованный краситель кибакрон голубой и гель-хроматографию на сефадексе 6 -150. Такая схема выделения позволяла из 4 л сыворотки крови человека получать 5 мг ССГ с выходом около Ъ%, Группа французских исследователей /48/ предложила использовать следующую схему выделения и очистки ССГ: фракционирование сыворотки крови сульфатом аммония, аффинная хроматография на 1сЛ-карбоксшлетил-5оС-дигидротестостероне, коньюгированном с аминогексил-сефарозой, и препаративный гель-электрофорез. Данная схема выделения и очистки позволяла получать ССГ из сыворотки крови человека с выходом 28$. Группа исследователей из Швеции /49/ эбнаружила, что аффинная хроматография сыворотки крови на кортизол-зефарозе приводит к выделению двух специфических стероидсвязываю-цих белков - транскортина и ССГ.

Разделение последних осуществляюсь хроматографией на фенил-сефарозе. Выход чистого ССГ составил жоло 18$. Наряду с изучением ССГ сыворотки крови человека были предпри- няты попытки выделения и очистки данного белка из сывороток крови млекопитающих. В работе Рознера /37/ ССГ кролика был частично очищен по следующей схеме: насыщение сыворотки крови 50$-ным сульфатом аммония, препаративный гель-электрофорез и гель-хроматография на сефадексе б -200. Петра /45/, использовав аффинный сорбент и методику, разработанную для выделения и очистки ССГ человека /44/, выделил ССГ кролика в чистом виде с выходом около 25$. Группа японских исследователей для выделения ССГ быка /50/, собаки /51/, крысы и кролика /20/ в качестве аффинного сорбента использовала тестостерон, модифицированный у C/j и коньюгировашшй с аминогексил-сефа-розой. Очистка белка осуществлялась на колонке с гидроксиапатитом. Выход ССГ из сыворотки крови быка, собаки, крысы и кролика составил, соответственно, 4,8$ /50/, 2,1$ /51/, 12$ /20/, 16$ /20/. Оценивая описанные выше методики выделения и очистки ССГ крови человека и млекопитающих,следует отметить, что наилучшей с точки зрения выхода ССГ является методика, предложенная в работе /46/. [С недостаткам данной методики можно отнести использование в процессе очистки белка препаративного электрофореза в ПААГ, так как эти ке авторы /44/ отмечали неадекватность используемых систем для пре-іаративного гель-электрофореза. I. 3. Физико-химические свойства ССГ. Устойчивость природного комплекса ССГ-гормон понижается по пере очистки, а без стероида данный белок постепенно теряет свои звязывающие свойства даже в присутствии белков сыворотки /44/. Эта проблема ранее специально не изучалась, и первые попытки очистить 5СГ человека закончились неудачей /24, 30, 39, 40/. Позднее Рознер 41/ показал, что ионы кальция, трис-(оксиметил) аминометан и глицерин стабилизируют стероидсвязывающие свойства ССГ. В последующих работах, посвященных выделению и очистке ССГ, преимущественно использовали трис-//Г буферы, содержащие глицерин и (или) ионы кальция /28, 42-49/.В работе /43/ была изучена стероидсвязывающая активность ССГ во фракции, полученной при осаждении белков сыво -ротки крови человека сульфатом аммония.Было показано, что насыщающие концентрации ДТГ или высокие концентрации глицерина (10-50%) дают возможность в течение нескольких часов сохранять практически неизменными стероидсвязывающие свойства белка.

Физиологическая роль ССГ

В процессах биорегуляции, обеспечивающих жизнедеятельность организма, существенную роль играют половые стероидные гормоны. Важным этапом механизма действия стероидных гормонов является их взаимодействие со связывающими глобулинами крови - ССГ и альбумином. Комплексы с данными белками - естественное состояние гормонов в крови. Так, только около 2% тестостерона в плазме крови человека находится в свободном состоянии /56/. Считают /73/, что ССГ и альбумин транспортируют стероидные гормоны в биологически неактивной форме и ограничивают таким образом поступление гормонов в ткани. Когда биосинтез стероидов усиливается, доля свободного, активного стероида возрастает. Данные глобулины защищают гормоны от действия ферлентов и кислорода, препятствуют адсорбции стероидов на стенках кровеносных сосудов, торлозят их метаболизм и экскрецию, а также облегчают перенос гормонов с места их биосинтеза в ток крови. ССГ проявляет большее сродство к тестостерону, чем к эстрадиолу. Альбумин же образует более прочные комплексы с эстрадиолом. На основании этого авторы работы /74/ предположили, что предпочтительное связывание тестостерона или эстрадиола в плазме крови должно зависеть от концентраций ССГ и альбумина . Для проверки данного предположения были измерены концентрации свободных, несвязанных белками гормонов в различных биологических источниках, которые заметно различались по содержанию в них ССГ. Данные, приведенные в таблице 6, показывают, что по мере увеличения в сыворотке крови концентрации ССГ доля свободного тестостерона понижается в большей степени, чем доля свободного эстрадиола. Таким образом, концентрация ССГ в крови может регулировать баланс свободных, несвязанных специфическим белком половых гормонов. Показано /75/, что на биосинтез ССГ влияют долговременные физиологические изменения уровней в плазме крови эстрогенов и ан-дрогенов, которые происходят в начале периода половой зрелости и после менопаузы. В течение беременности ССГ может защищать некоторые органы от повышенных уровней андрогенов. Данный белок может регулировать эффективные концентрации андрогенов и эстрогенов в крови. Биосинтез ССГ не чувствителен к краткосрочным гормональным изменениям, таким как флуктуации уровня эстрадиола в течение менструального цикла. Это по мнению авторов работы /75/, свидетельствует в пользу того, что ССГ является буферным белком, который усредняет биологическую реакцию на резіше изменения в концентрации половых гормонов. Согласно гипотезе, выдвинутой Сэндбергом и Слаунвайтом /76/, только небольшие количества свободных, несвязанных белками гормонов выполняют биологическую функцию. Доказательствами биологической инертности связанных гормонов послужили следующие факты.

Так, несмотря на значительный рост концентрации тестостерона в плазме крови беременных женщин, большие концентрации ССГ в этом состоянии препятствуют вирилизации /77/. Скорости метаболизма тестостерона и 3d ,T7J5 -диокси-5о( -андростана /78/ в плазме крови человека пропорцианальны количеству гормонов, не связанных с ССГ. В работе /79/ эксплантаты брюшной простаты крысы инкубировали с Н-тестостероном и затем в паралельних опытах вводили в среду сыворотки крови крысы, лошади и теленка, а также сыворотки крови мужчин и беременных женщин. При одинаковых концентрациях сывороток поглощение тестостерона и 3d ,17,$ -диокси-5о( -андростана, а также количества образовавшихся 5оС-ДГТ и андростандиола, были значительно ниже в эксплантатах, которые инкубировались с сывороткой беременных женщин. В работе /80/ была изучена трансформация тестостерона микросомами плаценты человека. Уже в первые минуты реакции исследователи наблюдали уменьшение концентрации тестостерона и пропорциональное увеличение концентрации эстрадиола. Этот процесс замедлялся при связывании тестостерона "активной фракцией белков", полученной из сыворотки крови беременных женщин и высокими концентрациями альбумина. После предварительного прогревания "активной фракции белков" при 60 в течение 30 минут их тормозящее действие полностью исчезало. для выяснения вопроса, что же является лучшим параметром ан-дрогенности в ряде работ /81-83/ были определены общий тестостерон и концентрация свободного гормона в плазме крови здоровых и больных людей. Нашли, что уровень свободного тестостерона понижается с возрастом. Это особенно ощутимо в возрастной группе 50-70 лет. В то же время общий тестостерон плазмы остается на прежнем уровне. В период полового развития подростков концентрации общего тестостерона и свободного горлона растут. Последний параметр достигает величины, характерной для взрослых людей, при полной половой зрелости. У мужчин с гипогонадизмом и гирсутных женщин более выражены, по сравнению с нормой, изменения концентраций свободного тестостерона. При беременности и у больных гиперти-реозом обоего пола, несмотря на увеличение уровня общего тестостерона в плазме крови, концентрация свободного гормона остается практически неизменной. На основании приведенных фактов, в работе /82/ был сделан вывод о том, что лучшим индексом андрогенности является концентрация свободного тестостерона в плазме крови.

Наряду с экспериментальными подтверждениями того, что только небольшие количества свободных, несвязанных белками горлонов выполняют биологическую функцию, накапливаются данные, которые не укладываются в общепринятые представления. Эти данные были получены в экспериментах, в которых использовались родственные ССГ по способности связывать в крови стероидные гормоны глобулины - тран-скортин и альбумин. Так, Рознер /84, 85/ в параллельных экспериментах ввел внутривенно адреналэктамированным крысам кортизол, транскортин вместе с кортизолом и контрольный физиологический раствор. Он обнаружил повышение активности тирозинтрансферазы в печени и уменьшение концентрации лимфоцитов в периферической крови в случае инъекции как свободного кортизола, так и комплекса транскортин-кортизол. Эти данные, возмолшо, сврщетельствуют о биологической активности связанного гормона. Данные, опубликованные в работе /86/ , также могут указывать на возможную биологическую активность связанного гормона. Было найдено, что асиалотранскортин и нативный комплекс транскортин-кортизол специфически связываются плазматическими мембранами клеток печени человека - ткани-мишени для глюкокортикоидных гормонов. Данное взаимодействие характеризуется высокой специфичностью. Так, меченый -асиалотранскортин не вытеснялся из комплекса с мембранами родственными транскортину по своей способности связывать в крови низкомолекулярные гормоны ССГ и тироксинсвязывающим глобулином. Физиологическое значение обнаруженного явления, по мнению авторов, монет состоять в том, что в организме человека имеется специальный механизм регуляции уровня транскортина в крови, отличный от известного общего механизма десиалирования гликопротеинов в крови и катаболизма асиалогликопротеинов в печени. Кроме того, взаимодействие комплекса транскортин-кортизол с мембранами клеток печени может способствовать проникновению гормона в клетки-мишени, увеличивая Ш ШгО локальную концентрацию комплекса тран-скортин-гормон в ткани-мишени. Авторы работы /87/ показали, что бычий сывороточный альбумин имеет на поверхности гепатоцитов один сайт высокого сродства (Kmxfl-{25 ± 7) 10" М) и один сайт низкого сродства. Связанный ДІЛО J -меченый бычий сывороточный альбумин не вытеснялся овальбу-мином, бычьим / -глобулином, трансферрином человека и пролакти-ном овцы (соотношение 1:10), тогда как немеченый альбумин и сывороточный альбумин крысы вытесняли меченый белок из его комплекса с мембранами. В работе /87/ был сделан вывод о том, что поверхность гепатоцитов содержит рецептор альбумина, катализирующий захват связанной с белком олеиновой кислоты и, возможно, других лигандов альбумина.

Выделение ССГ с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном кортизоле

Обнаруженный нами факт специфического взаимодействия ССГ в составе сыворотки ретроплацентарной крови и кортизола (см. гл.5) дал-возможность применить для аффинной-хроматографии ССГ корти-зол-сефарозу. Для синтеза данного аффинного сорбента была использована аминосефароза, приготовленная, как и в случае ДТТ-сефарозы, коньюгированием 1,6-диаминогексана с эпихлоргидрин-сефарозой. На данной матрице был иммобилизован 21-гемисукцинат кортизола. Полученные аффинные сорбенты содержали 6-8 мкмоль кортизола на I мл геля. Затем они разбавлялись сефарозой 4В до концентрации иммобилизованного стероида I мкмоль на I мл геля. Адсорбционные свойства кортизол-сефарозы оценивали также, как и свойства ДТТ-сефарозы (см. II. I.). На рис. 6 и рис. 7 приведены зависимости величин адсорбции ССГ из сыворотки ретроплацентарной крови на кортизол-сефарозе от концентрации иммобилизованного гормона и продолжительности инкубации сыворотки с матрицей. При температуре 4 наибольшие количества адсорбированного были получены при концентрации иммобилизованного лиганда 5 10 М и времени инкубации 6 ч. После отмывки кортизол-сефарозы от сопутствующих белков на фильтре холодным 0,05 М трис- НСІ буфером, рН 7,6, содержащим 0,2 М NctCi , биоспеци-фически адсорбированный ССГ элюировали при 37 5 КГ4 М раствором кортизола в этом же буфере. При этом в результате элюции объемом равным объему сорбента в растворе оказывалось около 80$ адсорбированного матрицей ССГ. Как и в случае ДТТ-сефарозы, понижение температуры десорбции приводило к заметному уменьшению выхода белка, который при 4 составил около 60%. Анализ стероидсвязывающих свойств белков, обнаруженных в составе аффинного элюата, проводили с использованием ряда меченых тритием стероидов. Для этого перед проведением электрофореза к белковым пробам прибавляли следовые количества радиоактивномеченых стероидов. Меченые половые стероидные гормоны Н-ДТТ, 11-тесто-стерон и Н-эстрадиол мигрировали при электрофорезе в связанном с белком состоянии. При этом пик связанной радиоактивности совпадал с полосой fi-глобулина. Добавленные в пробу перед электрофорезом I 000-кратные избытки холодных стероидов (по отношению к радиоактивным гормонам) приводили к полной потере связанных %-ДТТ, %-тестостерона и %-эстрадиола.

С целью количественной характеристики белковой системы, специфически связывающей половые стероидные гормоны, в отдельном эксперименте были определены стероидсвязывающие параметры полученного аффинного элюата. Графический анализ комплексообразования (рис. 8) показал, что аффинный элюат с высоким сродством связывает ДГТ, тестостерон и эстрадиол (Ка=4,5-Ю8 М""1, Ка=2,7 108 М""1, Ка=2,2Т08 М"1, соответственно). Рассчитанная на основании данных равновесного диализа К„ чистого ССГ с кортизолом в растворе составила 3,5 10 M""x (см. III. 2.). Для ССГ в составе сыворотки ретропла-центарной крови и кортизола KQ=3,9 I06 М""1 (см. У. I.) Поскольку нельзя было исключить того, что сыворотка ретро-плацентарной крови содержит особый секстероидсвязывающий белок, отличный от известного в литературе ССГ (в частности, по сродству к кортизол-сефарозе), мы изучили хроматографическое поведение на иммобилизованном кортизоле других биологических источников, в которых специфическое связывание половых стероидных гормонов, по литературным данным /5-13/, обусловлено только ССГ. В таблице 9 представлены данные по Ка ССГ с ДГТ и содержанию ССГ в бесстероидных сыворотках нормальной крови доноров (отдельно мужчин и женщин), венозной крови при беременности (третий триместр), ретроплацентар-ной крови, а также указанных сывороток крови , насыщенных ДГТ (2 10 М), до и после инкубации с кортизол-сефарозой. Как следует из данных таблицы 9, инкубация кортизол-сефаро-зы с различными биологическшли источниками ССГ приводит к существенному уменьшению их связывающей емкости без изменения сродства к ДГТ. Насыщение сывороток (в таблице показано на примере сыворотки ретроплацентарной крови) ДГТ (2 мкмоль) препятствует адсорбции ССГ на аффинной колонке. Совокупность полученных данных дает основание говорить о том, что синтезированная аффинная матрица избирательно адсорбирует из бесстероидной сыворотки крови ССГ. В таблице 10 представлен количественный состав получаемого аффинного элюата (данные типичного эксперимента). Таким образом, для выделения ССГ из сыворотки крови человека методом аффинной хроматографии имеются два возможных пути -использование в качестве аффинного сорбента иммобилизованного полового стероида (в частности ДГТ), или иммобилизованного кортизо-ла. При использовании одинаковых количеств обоих типов матриц с одинаковыми концентрациями иммобилизованных стероидов в суспензиях, ДТТ-сефароза обеспечивает несколько большую адсорбцию ССГ ( 85$) из сыворотки ретроплацентарной крови, чем кортизол-сефа-роза ( 75$). Оптимальные условия адсорбции ССГ (время инкубации и температура) были в обоих случаях одинаковыми. При десорбции белков с аффинной матрицы выход ССГ и в том, и в другом случае составлял, примерно, 80$. Однако, содержание ССГ а аффинном элюате, полученном на кортизол-сефарозе, выше, чем в элюате, выделенном на ДТТ-сефарозе.

Так, доля ССГ в первом случае составляет20-25%, а в последнем - не превышает 15%. Важно отметить, что применение кортизол-сефарозы позволяет свести к минимуму неспецифическую сорбцию на матрице белков крови, показателем чего является низкое содержание альбумина (менее 10%) в аффинном элюате. В случае же применения ДГТ-сефарозы содержание альбумина в аффинном элюате достигает 60%. Использование аффинных элюатов, полученных с применением кортизол-сефарозы, облегчает дальнейшую очистку ССГ. Использование кортизол-сефарозы дает определенные практические преимущества при проведении дальнейшей процедуры очистки ССГ. Так, для того чтобы элюировать 80% адсорбированного ДГТ-се-фарозой ССГ необходимо процесс десорбции проводить дважды, в то время как в случае кортизол-сефарозы достаточно одной процедуры элюции. Вследствие этого аффинный элюат, полученный биоспецифической хроматографией на иммобилизованном кортизоле, более концентрирован, чем элюат с ДТТ-сефарозы. Более легкая элюция ССГ с кортизол-сефарозы, по-видимому, объясняется более низкой Ка ССГ с кортизолом (Ка=3,5 Ю6 М-1), чем с ДТТ (Ка=4,5 Ю8 М-1), а также более высокой растворимостью кортизола, что позволяет создать более высокую концентрацию стероида-элюента. Использование более концентрированных белковых растворов значительно ускоряет и облегчает практическое выполнение очистки ССГ. Учитывая эти обстоятельства, в дальнейшей работе для выделения ССГ мы использовали только кортизол-сефарозу /92,93/. II. 3. Очистка ССГ. Аффинный элюат, полученный биоспецифической хроматографией сыворотки крови на кортизол-сефарозе, содержал, наряду с ССГ, небольшие количества альбумина, /"-глобулинов, а также транскортин (рис. 9). Из литературных данных /2/ известно, что проведение адсорбционной колоночной хроматографии в 0,005 М натрий-фоофатном буферном растворе (НФБ) на гидроксиапатите позволяет в одну стадию, количественно отделять транскортин от остальных белков аффинного элюата. ССГ при хроматографии на данном сорбенте элюировался 0,1 М НФБ рН 6,8 (рис. 10). Однако, применение данной стадии очистки приводило к частичной потере стероидсвязывающих участков ССГ (табл. II). Количество связывающих участков ССГ до хроматографии на гидроксиапатите принято за 100$. Представлены результаты выборочных опытов. Потеря стероидсвязывающих участков ССГ при использовании гидроксиапатита обусловлена, по-видимому, применением НФБ. Аналогичные выводы были сделаны другими авторами /41-43/. Кроме того, данному подходу присущи и другие недостатки. Так, при применении колоночной хроматографии на гидроксиапатите предпочтительно использовать небольшие объёмы аффинного элюата, а белок, наносимый на колонку, должен быть в НФБ с низкой ионной силой (0,005 М).

Стероидсвязывающие свойства ССГ

ССГ способен образовывать прочные комплексы со стероидными гормонами. Наибольшей прочностью обладает его комплекс с ДТТ, Ка=4,5 10 М (рис. 19). Комплексообразование с тестостероном и эстрадиолом характеризуется Ка=2,7#10 М""1 и Ka=2,2 I08 М""1, соответственно (рис. 20 и рис. 21). Аналогичное уменьшение Ка в ряду ДТТ тестостерон эстрадиол отмечали в работах /45-48/. ССГ способен специфически связывать не только половые, но и другие стероидные гормоны, однако KQ в последнем случае значительно ниже. Так, Ка чистого ССГ с кортизолом, определенная методом равновесного диализа, имеет значение 3,5 10 М , а с прогестероном - 7,0-Ю6 М" 1. Несмотря на большую прочность комплексов ССГ-половые стероидные гормоны, возможно удаление стероида из связывающего центра белка, причем при этом ССГ в значительной мере сохраняет стероид-связывающую активность (табл. 13). ССГ без стероида быстро теряет стероидсвязывающие свойства. Так, после выдерживания ССГ при 4 в течение 24 ч в 0,05 М трис-ИСІ буфере рН 7,6, содержащем 0,005 М СаСб , 50% молекул белка теряют способность связывать тестостерон, а за 72 ч белок полностью инактивируется (табл. 14). Хранение же комплекса ССГ с тестостероном в течение двух недель в растворе при 4 не приводит к существенному уменьшению количества связывающих участков белка. Высокая ионная сила не оказывает ингибирующего влияния на комплексообразование между ССГ и стероидами (табл. 14). Соли желчных кислот и неионные детергенты оказывают заметное инактивиру-ющее влияние на связывающую способность ССГ при высоких концентрациях. Денатурирующие агенты и высокая температура полностью лишают ССГ стероидсвязывающей активности (табл. 14). В таблице 15 представлены данные о влиянии рН на связывание тестостерона ССГ. Из данных таблицы 15 следует, что связывающая способность ССГ в широком диапазоне рН слабо зависит от концентрации ионов водорода. Так, в интервале рН 5-II связывающая способность ССГ меняется незначительно и только при II рН 5 наблюдается,её падение. Из рН-зависимости можно предполошіть, что стероидсвязывающий центр ССГ имеет гидрофобную природу. Маловероятно, что он содержит аглинокислотные остатки гистидина, цистеина и (или) тирозина. На это также указывали авторы работы /45/. Ультрафиолетовый спектр поглощения ССГ (рис. 22) подобен спектру поглощения триптофана, что соответствует относительному содержанию хромофоров в белке (табл. 16). Спектр поглощения ССГ шеет максимум при 282 нм и два характерных плеча при 276-277 шл и при 289-290 нм.

Для определения коэффициента экстинции ССГ (Agj Q jCM) объемно -весовым методом была рассчитана концентрация ССГ в приготовленном растворе и измерено его поглощение при 280 нм. Величина J80 1см оказалась равной 10,5. Спектрофотометрическое определение концентрации (мкг/мл) белка в растворе по эмпирической формуле С=183 А2зо - 75,8 А260 /97/ дало величину AQ 1СМ равную 10,7. Используя величину AJPQQ JCM=I0,5 И значение молекулярной массы 50 000, мы рассчитали молярный коэффициент экстинции ( ) ССГ. Он оказался равным 52 250. Близкое значение молярного коэффициента экстинции (52 490) было получено нами при расчете данной величины по содержанию в белке ароматических аминокислот тирозина и триптофана (см. гл. 5). В таблице 16 приведен аминокислотный и углеводный состав ССГ. Данный белок содержит в своем составе 12,3$ основных, 22,7/S кислых и 50,1$ гидрофобных аминокислот. Для ССГ характерно низкое содержание тирозина. Колориметрическое определение сульфгид-рильных групп с помощью реактива Элмана /98/ выявило в нативном ССГ лишь один остаток цистеина на молекулу белка. В присутствии 6 М гуанидинхлоргидрата удалось обнаружить два остатка цистеина. Такой же результат дала модификация С-иодацетамидом тиольных групп ССГ в растворе 6 М гуанидинхлоргидрата. После окисления ССГ надмуравьиной кислотой /99/ и последующего аминокислотного анализа было рассчитано общее содержание цистеина, равное четырем остаткам на молекулу белка. Из всех полученных данных можно сделать вывод о том, что в молекуле ССГ содержится, по-видимому, одна дисульфидная связь. Одна SH -группа является поверхностной, другая становится доступной только в денатурирующих условиях. Эти структурные группы важны для проявления стероидсвязыва-ющей активности белка. Так, восстановление молекулы ССГ с помощью дитиотреита (см. гл. У) полностью лишало белок стероидсвязы-вающей активности. После взаимодействия SH -групп белка с йодацетамидом, ССГ также не был способен связывать половые стероидные гормоны. Количество остатков тирозина и триптофана в молекуле ССГ определяли спектрофотометрически /100/ в растворе 6 М гуанидин-хлоргидрата. Число остатков тирозина оказалось равным единице, что совпадает с данными аминокислотного анализа, а триптофана -девяти на молекулу белка. Анализ N -концевых аминокислотных остатков ССГ с помощью дансильного метода /101/ показал, что единственной N -концевой аминокислотой данного глобулина является лейцин. Данные, полученные при действии смеси карбоксипептидаз А и В на десиалированный ССГ /102/, свидетельствовали о том, что С-концевой аминокислотой у этого белка является лейцин. Моносахаридный состав ССГ (табл. 16) и характер взаимодействия гликопротеина с конканавалином А (см. гл. II) позволяют сделать некоторые предварительные выводы о строении углеводного компонента ССГ.

В его состав, по-видимому, входят N -гликозид-носвязанные олигосахаридные цепи, каждая из которых содержит в качестве обязательного элемента по два остатка маннозы, замещенных только при Сfо\, то есть для ССГ характерны "двухантенные" цепи /V-ацетиллактозаминного типа. Присутствие в составе ССГ остатков N -ацетилгалактозамина указывает на то, что этот гликопротеин содержит и О-гликозидносвязанные цепи. По нашим данным ССГ содержит 10,5$ углеводов. Эти результаты трудно сравнить с литературными сведениями, так как содержание углеводов в ССГ, определенное разными авторами, варьирует в широких пределах - от 12,6$ /52/ до 34,4$ /47/. Такое же положение возникает и при сравнении определенного наші аминокислотного состава ССГ с данными других авторов (табл. 4). Аминокислотный состав ССГ, определенный в нашей лаборатории, наиболее близок к результатам группы шведских исследователей /49/. Идентичными оказались и определенные А/-концевые аминокислоты. Наїли были определены некоторые величины, характеризующие в целом глобулу белка. К таким характеристикам относятся удельный парциальный объем ( V ), молекулярный радиус ( R ), фрикционное отношение ( flfo )» гидрофобность белка ( HFave ) и полярное отношение (Р). Удельный парциальный обьем, рассчитанный на основании аминокислотного и углеводного составов ССГ, составил величину 0,7179 см /г. Используя это значение V , мы рассчитали молекулярный о радиус ССГ. Его величина оказалась равной 24,5 А. Затем было рассчитано flfo » то есть отношение радиуса Стокса (29 Ай ) ССГ к молекулярному радиусу. Величина flfo -ІД9 хорошо коррелирует со значениями flfo » приводимыми в работах /45, 48/. Исходя йСреднее значение, полученное из данных электрофореза в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях. из аминокислотного состава ССГ легко рассчитать гидрофобностъ белка ( HFpire ) и полярное отношение (Р) ССГ. HFalr - это величина в кал/остаток, характеризующая энергию переноса аминокислотного остатка из органического окружения в водное. Для ССГ HFaue. оказалось равным I 100 кал/остаток. Р - это отношение объема занятого полярными аминокислотными остатками к объему занятому неполярными аминокислотными остаткшли. Для ССГ Р оказалось равным 0,768. Основные физико-химические параметры ССГ представлены в таблице 17 /103/.

Похожие диссертации на Выделение и структурно-функциональные свойства сексстероидсвязывающего глобулина крови человека

Выделение и изучение свойств фосфозид...4-4-фосфоркиназы из мозга человекаТусунов, Олтаржен Кумарович

Выделение, физико-химические характеристики и иммунохимические свойства эмбрионального альфа-2-глобулинаБулгаков, Александр Александрович

Структурные и функциональные аспекты многокомпонентной системы тироксинсвязывающих белков плазмы крови человекаСвиридов, Олег Васильевич

Сравнительное изучение действия протеиназ ретровирусов человека на белки клетки-хозяина и плазмы кровиКиселев, Алексей Фёдорович

Выделение фрагментов функциональных белков и количественное определение их содержания в клетках и тканях человека и крысыЯцкин Олег Николаевич

Выделение и свойства цитоплазматического рецептора гиббереллина из семяпочек хлопчатникаАбидова, Мазлума Халиловна

Выделение, структура и свойства новых регуляторных пептидов из мозга крупного рогатого скотаКарелин, Андрей Авенирович

Выделение и биологические свойства пептидов из мозга зимоспящих и холодоадаптированных животныхЗиганшин, Рустам Хусманович

Идентификация и выделение нейронального белка со свойствами латротоксинаЦыганкова, Оксана Михайловна

Выделение и физико-химические свойства ауксинсвязывающего белка из проростков хлопчатникаАрзанова, Ирина Александровна