Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Особенности энергетического обмена ретикулоцитов и эритроцитов 11
1.2. Пентозофосфатный путь 16
1.3. Нормальный и напряженный эритропоэз 21
1.4. Старение эритроцитов 23
1.5. Характеристика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 25
Заключение 32
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 33
2.1. Объект исследования 33
2.2. Фракционирование эритроцитов 34
2.3. Подсчет ретикулоцитов 36
2.4. Определение гемоглобина 36
2.5. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 37
2.6. Определение температурной зависимости глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 39
2.7. Определение рН-зависимости глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы39
2.8. Характеристика основных кинетических параметров 40
2.9. Статистическая обработка результатов 41
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 42
3.1. Изменение свойств глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза 42
3.2. Изменение свойств глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при старении эритроцитов, образованных после стресс-воздействия (массивной кровопотери) 56
3.2.1. Активность и кинетические параметры глгокозо-6-фосфатдегидрогеназы на 7 сутки после кровопотери 58
3.2.2. Активность и кинетические параметры глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы в разных фракциях эритроцитов на 20 сутки после кровопотери 63
3.2.3. Активность и кинетические параметры глюкозо-6~ фосфатдегидрогеназы на 30 сутки после кровопотери 67
3.3. Влияние температуры и рН среды на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза 69
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 76
ВЫВОДЫ 88
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90
- Особенности энергетического обмена ретикулоцитов и эритроцитов
- Фракционирование эритроцитов
- Изменение свойств глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из основных проблем современной биологии и медицины является выяснение молекулярных процессов, определяющих продолжительность жизни организмов. Удобным и информативным объектом для исследования процессов старения служат эритроциты млекопитающих - высокоспециализированные клетки, лишенные ядра, органелл и белоксинтезирующего аппарата. Кроме того, особые преимущества эритроцитов связаны с их легкой доступностью и возможностью разделения на возрастные группы.
Старение эритроцитов сопровождается существенным снижением их метаболической активности. Значительно уменьшается интенсивность гликолиза и пентозофосфатного пути окисления углеводов (Grimes A.J., 1986). Это в свою очередь приводит к целому ряду изменений в метаболизме клетки: снижению концентрации АТФ, НАДН и НАДФН (БогатскаяЛ.Н,, Рагимова А.А., 1986; Смолина Е.В., 1984); нарушению работы ионных насосов (Hadengue A.L., 1998), повышению внутриклеточной концентрации ионов Са (Minetti G. et al., 2001), вызывающее агрегацию мембранных белков (Jain S.K. et al, 1980; Preiano B.S., Guerini D., 1996), активации фосфолипазы A2 (Никитченко Ю.В., 1999) и накоплению лизофосфолипидов (Боровкова Г.И., 1983; Jain S.K., 1988; Kale М., 1998). Нарушается синтез низкомолекулярных соединений - глутатиона, фосфорибозилпирофосфата, НАД*, НАДФ+, ФАД (Piccinini G. et al., 1995) и накапливается метгемоглобин (Akintonwa D.A., 2000). При снижении концентрации АТФ происходит дефосфорилирование спектрина, вызывающее структурные перестройки мембраны, гликопротеинового спектра, что приводит к изменению антигенной структуры эритроцитов и обеспечивает селективную элиминацию из кровяного русла старых клеток (Kay J.J. et al., 1991; Козлова ЕМ. и др., 1998).
На данном этапе развития науки существует огромное количество теорий, пытающихся объяснить прогрессирующие вредные изменения, происходящие при старении (Титов С.А., Крутько В.Н.,1996; Анисимов В.Н., 2000; Подколозин А.А. и др., 2001; Sharpless N.E., DePinho R.A., 2004). В настоящее время самой популярной теорией старения является свободнорадикальная теория, предложенная D. Harman в 1956. Согласно этой теории, неполное восстановление кислорода приводит к образованию ряда цитотоксичних активных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион-радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал. Эти высоко реактивные АФК могут вызывать различные клеточные повреждения, включая перекисное окисление липидов, повреждение ДНК, изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала и инактивацию ферментов (Halliwell В., Gutteridge М.С., 2003; Ozturk О., Gumuslu S., 2004). Для эритроцитов, чей род деятельности связан с транспортом высоких концентраций кислорода, данная теория является наиболее актуальной.
Процессы свободнорадикального окисления ограничиваются антиоксидантной системой. Самым важным антиоксидантным ферментом в эритроцитах является глюкозо- б-фосфатдегидрогеназа.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - ключевой и скорость лимитирующий фермент пентозо фосфатного пути окисления глюкозы. Роль этого фермента в метаболизме эритроцитов чрезвычайно велика, поскольку в ходе реакций, катализируемых Г6ФД, а также 6-фосфоглюконатдегидрогеназой, происходит образование НАДФН, необходимого для поддержания функциональной активности и целостности эритроцита. Восстановленный НАДФ необходим для роста, дифференцировки и запрограммированной гибели клеток (Tain W-N. et al., 1998; Tian W-N. et al., 1999; Filosa S., 2003). Огромная роль НАДФН в эритроцитах состоит в регенерации окисленного глутатаиона, который предотвращает денатурацию гемоглобина, предохраняет от окисления SH-группы мембранных белков красных клеток крови участвует в обезвреживании перекиси водорода и активных форм кислорода (Deutsch J., 1990). Снижение активности Г6ФД приводит к дефициту НАДФН и восстановленного глутатиона, что вызывает ранний гемолиз эритроцитов в селезенке.
В работах, посвященных исследованию активности Г6ФД при старении клеток, возрастные изменения толвко констатируются без достаточного анализа их причин. Между тем, выяснение механизмов изменения активности фермента является существенным звеном для изучения причин снижения интенсивности и регуляции пентозофосфатного пути при старении эритроцитов.
Подходом к изучению механизмов изменения и значения роли Г6ФД в старении клеток может бытв сравнительное исследование динамики активности и кинетических параметров фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.
Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритропоэза, характеризуются укороченным сроком жизни, рядом метаболических и физико-химических особенностей (Поэтова В.Т. и др., 1967). Поведение Г6ФД при старении эритроцитов напряженного эритропоэза не изучено.
Цель работы. Исследовать активность и кинетические свойства Г6ФД, а также влияния температуры и рН среды на активность фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.
Задачи исследования.
Изучить динамику активности Г6ФД при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.
Изучить кинетические свойства Г6ФД в онтогенезе эритроцитов нормального эритропоэза.
Исследовать кинетические параметры Г6ФД при старении эритроцитов напряженного эритропоэза.
Изучить влияние температуры на активность Г6ФД в эритроцитах разного возраста, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.
Исследовать влияние рН среды на активность Г6ФД при старении эритроцитов нормального и напряженного эритропоэза.
Научная новизна. Впервые показано, что при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального эритропоэза, происходит изменение кинетических свойств Г6ФД: повышение Км для глкжозо-6-фосфата и [S]0,5 для НАДФ+ ; уменьшение кооперативных свойств фермента по отношению к НАДФ+, вплоть до полного исчезновения кооперативных взаимодействий в старых клетках; увеличение ингибирующего влияния НАДФН и АТФ на активность фермента.
Впервые, изучены исследуемые параметры при старении эритроцитов, продуцированных при напряженном эритропоэзе, вызванного массивной, одноразовой кровопотерей. Показано, что Г6ФД в эритроцитах, образованных в условиях напряженного эритропоэза первоначально характеризуется повышенной активностью и существенными отличиями в кинетических свойствах, что может свидетельствовать о качественном отличии эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, от клеток, образованных в нормальных условиях кроветворения. Впервые изучено влияние температуры и рН среды на активность Г6ФД при старении эритроцитов нормального напряженного эритропоэза.
Теоретическая и практическая ценность работы.
Результаты работы вносят вклад в понимание механизмов снижения активности ферментов при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза. Кроме того, исследования, проведенные в данной работе, свидетельствуют о том, что эритроциты, образованные после стресс воздействия (массивной кровопотери), являются качественно иными по сравнению с клетками, образованными в условиях нормального эритропоэза.
Материалы, полученные в данной работе, используются при чтении лекций по спецдисциплинам (энзимология, кинетика ферментативных реакций, термодинамика, биохимия крови) студентам биологического факультета Красноярского Государственного Университета. Методики, изложенные в диссертации, включены в разделы большого и малого практикума по биохимии, энзимологии и кинетике ферментативных реакций на кафедре биохимии и физиологии человека и животных КрасГУ и используются студентами в процессе выполнения курсовых и дипломных работ, а таюке могут быть рекомендованы для внедрения в деятельность клинико-биохимических лабораторий учреждений здравоохранения и НИИ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Старение эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза сопровождается значительным снижением активности Г6ФД и изменением кинетических параметров: увеличением константы Михаэлиса и снижением Vmax для глюкозо-6-фосфата; уменьшением кооперативных взаимодействий и повышением [S]o,s для НАДФ+; усилением ингибирующего влияния НАДФН и АТФ на активность фермента.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа в эритроцитах, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, существенно отличается по активности и свойствам от Г6ФД в клетках, образованных в условиях нормального кроветворения.
При старении эритроцитов, образованных в условиях как нормального, так и напряженного эритропоэза оптимумы температуры и рН Г6ФД не меняются, но повышается чувствительность к воздействию высоких температур и значений рН среды.
Апробация материалов диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Между нар. научен, кона, студентов и молодых ученых "Экология Южной Сибири и сопредельных территорий", Абакан, 2002; Межрегион, науч.-практич. конф. "Молодежь Сибири-науке России", Красноярск, 2003; Итоговой науч. конф. "Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири", Красноярск, 2003; Междунар. конф. "Механизмы функционирования висцеральных систем", Санкт-Петербург, 2003; XIX Съезде Физиол. общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004.
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 10 печатных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, главы результатов исследований и их обсуждений, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (197 источников, в том числе 139 иностранных). Диссертация содержит 9 таблиц и 18 рисунков.
Особенности энергетического обмена ретикулоцитов и эритроцитов
Эритроцит млекопитающих - безъядерная клетка с высоким содержанием дыхательного пигмента, гемоглобина. Основной функцией эритроцитов является снабжение тканей кислородом - транспорт кислорода от легких к тканям. Перенося кислород, эритроцит не потребляет его и не расходует энергию на совершение этого процесса.
В кровяное русло эритроциты выходят в виде ретикулоцитов. Ретикулоцит - промежуточная стадия созревания эритроцитов, которая характеризуется элиминацией ядра, с одной стороны, и присутствием функционально активных рибосом и митохондрий - с другой. В ретикулоцитах содержатся мРНК, тРНК и происходит интенсивный синтез гемоглобина, некоторых мембранных белков и ферментов (Григорьев Г.П., 1981).
В ретикулоцитах интенсивно протекает глицин-сукцинатный цикл, синтезируются пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды de novo, Осуществляется синтез жирных кислот, триглицеридов, фосфолипидов, холестерина, протекают процессы переаминирования и дезаминирования аминокислот.
Энергетический обмен ретикулоцитов своеобразен. Характерной особенностью метаболизма этих клеток является наличие активного гликолиза, которые не ингибирутся в присутствии кислорода - неполный пастеровский эффект (Grosh А.К., Sloviter Н.А., 1981). В митохондриях активно функционирует цикл Кребса и дыхательная цепь. Ресинтез АТФ в ретикулоцитах происходит в ходе гликолиза и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи. Ретикулоциты характеризуются интенсивным дыханием. Одним из субстратов окисления в ретикулоцитах является глюкоза. Поглощение глюкозы ретикулоцитами в 4 раза превышает поглощение глюкозы эритроцитами. Баланс утилизации глюкозы в ретикулоцитах по результатам экспериментов и математического моделирования таков: 45% поглощаемой ретикулоцитами глюкозы окисляется до С02 и Н20 в цикле Кребса, 50% - преобразуется в лактат, 2% глюкозы окисляется в пеитозофосфатном пути, остальная используется на образование серина и глицина, необходимых для синтеза гемоглобина (Siems W. et al, 1981; Siems W. et al.,1982).
Субстратами окисления в ретикулоцитах могут быть аминокислоты. Аминокислотный пул в ретикулоцитах включает эндогенные аминокислоты, образующиеся при расщеплении митохондрий и рибосом, и экзогенные поступающие в клетку из плазмы крови (Черняк Н.Б., 1976). Часть аминокислот подвергается окислению в цикле Кребса, часть используется для биосинтеза гемоглобина.
Переход ретикулоцитов в эритроциты сопровождается значительными морфологическими и биохимическими изменениями. Созревание ретикулоцита включает одновременно синтез последней трети суммарного гемоглобина, содержащегося в зрелом эритроците, с полной деградацией эндоплазматической сети, рибосом и митохондрий (Черняк Н.Б., 1976). Деградация осуществляется ферментами, главным образом рибонуклеазами, протеазами и фосфолипазами (Rapoport S. et al., 1981).
Фракционирование эритроцитов
Фракционирование эритроцитов проводили по методу, разработанному на кафедре биохимии и физиологии человека и животных КрасГУ (Авраамова Т.В., Титова Н.М., 1978). Принцип метода основан на том, что старение эритроцитов сопровождается увеличением удельного веса данных клеток (Бриллиант М.Д., Воробьев А.И., 1961). Поэтому при центрифугировании цельной крови происходит распределение эритроцитов в соответствии с их удельным весом. В верхней части эритроцитарного столба собираются наиболее молодые клетки, в нижней части - наиболее старые.
Часть свежей гепаринизированой крови, отливали для исследования -нефракционированная кровь (общая эритроцитарная масса), оставшуюся часть подвергали фракционированию. После 20-минутного центрифугирования крови при lOOOg при 4С осторожно отбирают плазму и сохраняют для дальнейшего фракционирования эритроцитов. Затем тщательно собирают и отбрасывают лейкоциты, верхнюю половину эритроцитарного столба переносят в новую пробирку. Эритроциты ресуспендируют до 50%-ного гематокрита и подвергают центрифугированию при тех же условиях. После отбора плазмы верхнюю половину эритроцитарного столба отбирают в пробирку. Процедуру отбора верхней половины эритроцитарного столба, взвешивания отобранных эритроцитов и центрифугирования повторяют четыре раза, затем снимают 1 мл эритроцитов, расположенных в самой верхней части эритроцитарного столба (верхний слой или фракция молодых клеток).
Нижнюю часть эритроцитарного столба, оставшуюся после первого центрифугирования, также ресуспендируют и подвергают фракционированию путем последовательного отбора и удаления верхней половины эритроцитарного столба, ресуспендирования и новых центрифугирований. Эту процедуру повторяют четыре раза. После четвертого удаления верхней половины эритроцитарного столба на дне пробирки остается 1 - 1,2 мл нижнего слоя (фракция старых клеток) (рис.5.). Фракционирование контролируют подсчетом ретикулоцитов. Полученный при фракционировании эритроцитов верхний слой содержит 10-12% ретикулоцитов и более молодые эритроциты. Нижний слой содержит наиболее старые клетки. Ретикулоциты в ней отсутствуют. По окончании фракционирования фракции молодых и старых клеток и общую эритроцитарную массу отмывают от плазмы. Для этого эритроциты суспендируют в десятикратном объеме 0,9%-ного раствора хлористого натрия и центрифугируют в течение 15 минут при 1000g. Супернатант отбрасывают. Процедуру отмывания повторяют три раза. Последнее центрифугирование проводят в течение 20 минут для более плотной упаковки клеток.
Для подсчета ретикулоцитов на стекла шлифовальным предметным стеклом наносили мазок краски (1,2%-ный раствор бриллиант крезилового синего, приготовленный на абсолютном спирте). На край окрашенного стекла помещали каплю суспензии эритроцитов нужной фракции и делали мазок. Полученные мазки немедленно помещали во влажную камеру на 10-15 минут. По окончании окрашивания стекла высушивали и осуществляли подсчет ретикулоцитов под микроскопом. В отличие от равномерной зеленовато-голубой окраски эритроцитов ретикулоциты имеют характерную фиолетово-синюю зернистость. Подсчет ретикулоцитов производили на 3000 клеток. Количество ретикулоцитов выражали в процентах (Авраамова Т.В., Титова Н.М., 1978).
Изменение свойств глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза
В литературе существуют сведения о снижении активности Г6ФД при старении эритроцитов, однако в отношении степени снижения активности данные разноречивы (Oliver C.N. et aL, 1987, Stadtman E.R,, Oliver, C.N. 1991, Jindal H.K. et al., 1996). Что касается исследования кинетических свойств Г6ФД, то в доступной нам литературе встретились работы, в которых кинетика ГбФД-ной реакции изучались либо в общей эритроцитарной массе, представленной нефракционированными клетками, либо на очищенном препарате фермента.
Проведенное сравнительное изучение активности фермента во фракции молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе обнаружило снижение Г6ФД от фракции молодых к фракции старых эритроцитов.
Полученные данные говорят о том, что фракция молодых эритроцитов характеризуется наибольшей активностью ГбФД- 9,21±0,03 мкмоль НАДФН/мин гНЪ. В общей, эритроцитарной массе активность на 15,6% ниже, чем во ФМЭ (Р 0,01). Наиболее низкая активность фермента наблюдается во фракции старых клеток - она на 40,2% ниже активности Г6ФД во ФМЭ (Р 0,01) (рис.6).
Таким образом, с возрастом клетки активность Г6ФД снижается, и это снижение может быть обусловлено несколькими причинами. Прежде всего, при старении может происходить уменьшение количества фермента. В клетке количество фермента поддерживается на определенном уровне за счет процессов синтеза и деградации. В зрелых эритроцитах, как известно, синтез белков, в том числе и ферментов, не происходит, а деградация может происходить. Белки разрушаются под действием как мембраносвязанных, так и цитозольных эндопептидаз (Алексеенко Л.П. и др., 1982; Houben A. et al., 1984).
Снижение активности фермента можно объяснить и посттраысляционными модификациями белковой молекулы. К этим модификациям относят агрегацию, полимеризацию, окисление свободных SH-rpyim (Демченко А.П., Орловская Н.Н., 1981; Gershon D. et al., 1982). Помимо этого, к посттрансляционным модификациям относят окислительную модификацию белков, которая имеет место при старении эритроцитов, в связи с усилением процессов свободнорадикального окисления (Кудряшов A.M., 2002; Levine R.L., Stadtman E.R., 2001; Linton S. et al., 2001; Beal M.F., 2002; Levine R.L., 2002). Такие модификации могут приводить к тому, что часть молекул фермента перейдет в неактивную форму, а это равносильно потере клеткой определенного количества ферментного белка. Модификации могут иметь и другой характер -затрагивая белковую молекулу, изменяя ее конформацию, они приведут к изменению кинетических, а возможно, и регуляторных свойств молекулы фермента (Демченко А.П., ОрловскаяН.Н., 1981).
Существуют разные методы, позволяющие выяснить, произошли или нет изменения свойств фермента в процессе старения белковой молекулы. Наибольшее распространение имеет исследование кинетических параметров фермента - константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции, а в случае ферментов, обладающих кооперативными свойствами, коэффициента Хилла.
Поскольку Г6ФД катализирует двухсубстратную реакцию, то для определения кинетических характеристик фермента необходимо было исследовать зависимость скорости реакции как от концентрации субстрата -глюкоза-6-фосфата, так и от концентрации кофермента - НАДФ+.
Экспериментальные данные показали, что зависимость скорости ГбФД-иой реакции от концентрации Г6Ф следует кинетике Михаэлиса-Ментен (рис.7).
