Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА ЭРИТРОЦИТОВ 13
1.1. Свойства фосфофруктокиназы 13
1.2. Аллостерические эффекторы фосфофруктокиназы . 15
1.3. Кинетика фосфофруктокиназной реакции 21
1.4. Энергетический обмен эритроцитов и ретикуло-цитов 22
1.5. Метаболизм АТ в эритроцитах 29
1.6. Старение эритроцитов 35
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
2.1. Фракционирование эритроцитов 42
2.2. Подсчет ретикулоцитов 45
2.3. Определение активности ШІ 46
2.4. Определение кинетических параметров ШІ 47
2.5. Определение содержания АТ 48
2.6. Определение содержания AM 50
ГЛАВА 3. АКТИВНОСТЬ, КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ФОСШРУКТО-
КИНАЗЫ, СОДЕРЖАНИЕ ПРИ СТАРЕНИИ ЭРИТРОЦИТОВ, ПРОЕЦИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ НОРМАЛЬНОГО ЭРИТРОПОЭЗА 52
3.1. Активность и кинетические свойства ФФК 52
3.2. Содержание АТФ и AM 59
ГЛАВА 4. АКТИВНОСТЬ, КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ФОСФОШТОГО-
КИНАЗЫ, СОДЕРЖАНИЕ АТФ И AM ПРИ СТАРЕНИИ ЭРИТРОЦИТОВ, ПРОДУЦИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ НАПРЯЖЕННОГО ЭРИТРОПОЭЗА 64
4.1. Активность, кинетические свойства, содержание АТФ и АДФ на 7 сутки после кровопотери 64
4.2, Активность, кинетические свойства ШС, содержание АТ и АДФ на 20 сутки после кровопотери 71
4.3. Активность, кинетические свойства ФФК на 30 сутки после кровопотери ТІ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86
ШВОДЫ 102
ЛИТЕРАТУРА 104
- Свойства фосфофруктокиназы
- Фракционирование эритроцитов
- Активность и кинетические свойства ФФК
- Активность, кинетические свойства, содержание АТФ и АДФ на 7 сутки после кровопотери
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших проблем биологии и медицины является проблема старения. Удобным и информативным объектом исследования процессов старения на клеточном и молекулярном уровнях служат эритроциты млекопитающих - высокоспециализированные безъядерные клетки, не способные к биосинтезу белка. Особые преимущества эритроцитов связаны также с их легкой доступностью и возможностью разделения на возрастные группы.
Знание механизмов старения и разрушения эритроцитов в физиологических условиях, а также при выведении системы крови из равновесия открывает возможность правильной интерпретации нарушений в системе крови при различных заболеваниях (25, 52, 98, 100, 102, 112, 113, 115, 120, 121, 125, 126).
Основным энергетическим процессом и единственным путем ресинтеза АТФ в зрелых эритроцитах является гликолиз, регулируемый координирующим действием гексокиназы, фосфофруктоки-назы и в меньшей степени пируваткиназы (7, 17-23, 205, 207, 263).
Согласно исследованиям ряда авторов (7, 14, 144-148, 107, 160, 163, 169, 193, 212, 296), ведущим звеном в процессе старения эритроцитов является снижение интенсивности гликолиза (87, 88, 132, 146, 161, 171, 205, 237, 250), вызывающее уменьшение уровня АТФ в клетке, что, в свою очередь, обусловливает цепь последовательно развивающихся событий : нарушение работы ионных насосов (9, 10, 166, 171), повышение внутриклеточной концентрации Са (70, 135, 167, 238, 293, 295), вызывающее агрегацию мембранных белков (36, 41, 55, 83,
174, 238, 293), активацию фосфолипазы Ag (44, 159, 266) и . накопление лизофосфатицов (3, 4, 34, 43). Нарушается синтез низкомолекулярных соединений - глютатиона, фосфорибозилпи* рофосфата, Ekjf (28, 38, 46, 62). При снижении концентрации АТФ происходит дефосфорилирование спектрина, вызывающее структурные перестройки мембраны, гликопротеидного спектра, что приводит к изменению антигенной структуры эритроцитов и обеспечивает селективную элиминацию из кровеносного русла старых клеток (ІГ, 85, 136-140, 150, 151, 157, 199, 200, 203, 213, 217^219, 239, 240, 286, 207).
Б основе снижения интенсивности гликолиза лежит уменьшение активности ферментов этого метаболического цикла (25, 8, 9, 10, 87, 88, I43-, 144, 145, 160, 193, 198). При старении эритроцитов существенно снижается активность гексокиназы, фермента, характеризующегося наименьшей активностью в процессе гликолиза (8, 129, 226, 241, 242, 247, 256, 274, 275). Поведение второго лимитирующего фермента гликолитического пути - фосфофруктокиназы - при старении эритроцитов остается недостаточно изученным. Нет единого мнения относительно изменения активности фосфофруктокиназы (40, 190, 226, 153, 246, 268, 274, 275), не исследованы кинетические свойства этого фермента.
Фосфофруктокиназа (АТФ: d-фруктозо-б-фосфат I фосфо-трансфераза 2.7.1.II.Ш(), катализирующая образование фруктозо-1,6-дифосфата, перенося фосфатный остаток с АТФ на фруктозо-6-фос$ат, является вторым лимитирующим ферментом гликолиза (168, 202, 290, 317). ФЖ *» поливалентный аллостерический фермент, активность которого может варьировать в широких пределах, поскольку на активность фермента - 8 ~ оказывает существенное влияние целый ряд,эффекторов и, в первую очередь, АТФ (72, 132, 133, 211, 223-225, 245), являющаяся одновременно субстратом фосфофруктокиназной реак* ции и аллостерическим ингибитором ФФК (72, 93, 96, 132, 133, 190, 225-224).
На чувствительность фосфофруктокиназы к АТФ оказывают большое влияние положительные эффекторы ФФК, одним из важнейших аллостерических активаторов является АДФ» Чувствительность аллостерического центра фосфофруктокиназы к АТФ, а также к действию эффекторов может меняться при старении эритроцитов.
Важное значение при оценке роли фосфофруктокиназы в поддержании определенного уровня АТФ может иметь сопоставление концентраций АТФ, вызывающих ингибирование ФК, с внутриклеточным содержанием этого косубстрата, а также влияние эффекторов на фосфофруктокиназную реакцию.
Подходом к изучению механизмов старения и значения роли ФШ в поддержании уровня АТФ может быть сравнительное изучение динамики активности, кинетических параметров ФЖ, а также содержания АТФ и АДФ при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритро-поэза.
Эритроциты, образованные в условиях напряженного эрит-ропоэза, характеризуются укороченным сроком жизни, рядом метаболических особенностей, физико-химическими свойствами (6, 12, 13, 14, 26, 27, 31, 33, 34, 37, 45, 133, 287, 314, 301). Скорость гликолиза в них первоначально значительно выше, чем в эритроцитах, продуцированных в условиях нормального эритропоэза, но при старении этих клеток наблюдается более быстрое, чем в норме, снижение гликолитической активности (I-I4, 33, 37, 119, 120, 274.280, 243, 206).
Поведение фосфофруктокиназы при старении эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, не изучено.
Цель работы и задачи исследования. Исследовать активность и кинетические свойства фосфофруктокиназы при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза. Оценить роль ФФК в поддержании уровня АТФ при старении эритроцитов.
Исходя из этого, в задачи исследования входило: изучение динамики активности и кинетических параметров фос** фофруктокиназы при старении эритроцитов (на фракциях молодых, старых клеток и общей эритроцитарной массы у интактных кроликов и на 7 или 20 или 30 сутки после кровопотери); исследовать содержание -АТФ и АДФ в тех же фракциях у интактных кроликов и в различные сроки после кровопускания; сопоставить ингибирующие концентрации АТФ с внутриклеточным содержанием этого косубстрата; исследовать влияние АДФ на кинетику фосфофруктокиназной активности при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.
Научная новизна. Впервые показано, что при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального эритропоэза, происходит изменение кинетических свойств фосфофруктокиназы - увеличение Кдд для АТФ и фруктозо-в-фосфата и сни* жение Vw,a* для обоих субстратов, уменьшение ^к для АТФ. Характер кривой зависимости * от [S] при старении эритро- цитов не меняется как для фруктозо-6-фосфата, так и для АТФ, но при старении эритроцитов наблюдается ингибирование фосфофруктокиназной активности более низкими концентрациями АТФ. При этом снижение ингибирующих концентраций АТФ при старении эритроцитов соответствует уменьшению внутриклеточного содержания этого кофермента. Впервые отмечено, что при старении эритроцитов наблюдается уменьшение активирующего эффекта АДФ на фосфофруктокиназу эритроцитов. Новым явилось изучение всех перечисленных показателей при старении эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэ-за, вызванного острой, одноразовой кровопотерей (60$ всей массы крови). Впервые проведено комплексное исследование всех перечисленных параметров на одном объекте. Обосновано положение о ведущем значении ФФК в уменьшении внутриклеточного содержания АТФ при старении эритроцитов.
Теоретическое значение и практическая ценность работы. Результаты работы вносят вклад в понимание механизмов старения эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза. Обнаруженное изменение кинетических параметров фосфофруктокиназы, снижение концентраций АТФ, вызывающих ингибирование фермента и соответствующее ему снижение внутриклеточного уровня АТФ, изменение чувствительности ФЖ к аденозинтрифосфату при увеличении концентрации АДФ свидетельствует о решающей роли ФФК в снижении уровня АТФ и ограничении скорости гликолиза при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.
Определение активности фосфофруктокиназы и содержания АТФ и АДФ может использоваться в гематологической практике ** XX *" для определения жизнеспособности эритроцитов in vivo , а также при хранении крови in vitro Выявление факторов, обусловливающих снижение жизнеспособности эритроцитов, открывает возможности коррекции нарушений, возникающих в системе красной крови при различных заболеваниях.
Материалы диссертационной работы используются при чте-* нии спецкурсов биохимии (кинетика ферментативных реакций, энзимология, биохимия крови) студентам биолого-химического факультета Красноярского Государственного университета и на медико-биологическом факультете Томского мединститута.
Методики, изложенные в данной работе, поставлены на кафедре биохимии Красноярского Госуниверситета и выполняются студентами на большом практикуме по биохимии, а также в ходе курсовых и дипломных работ.
Тема диссертационной работы утверждена ученым советом биолого-химического факультета Красноярского Госуниверситета. Работа выполнена в соответствии с планом научных работ кафедры биохимии Красноярского Госуниверситета и является разделом темы "Отражение эволюционных закономерностей эритро-поэза в онто- и филогенезе" J 8II00927. Тема входит в координационный план научно-исследовательских работ АН СССР на I98I-I985 годы по решению научно-технической проблемы "Физиология человека и животных" - 2.35 и в Программу фундаментальных исследований по проблеме "Гомеостаз".
Основные положения, выносимые на защиту:
I. Старение эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза, сопровождается снижением активности фоо-фофруктокиназы и изменением кинетического поведения фермента (увеличение Км для АТЗ> и фруктозо-&-фосфата, уменьшение — 12 «*
Чюах для обоих субстратов, снижение п-к для АТФ, снижение ингибирующих концентраций аденозинтрифосфата, уменьшение активирующего действия АДФ; а также снижение уровня АТФ и повышение концентрации АДФ в клетке.).
Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритропоэза, первоначально характеризуются повышенной активностью ФЖ, более высокой \/тм для АТФ и фруктозо-6~фосфа» та, повышением «-^ для АТФ и значительным уменьшением ^, для обоих субстратов. Но старение этих клеток сопровождается более быстрым, чем в норме, изменением этих параметров. фгаамика концентраций АТФ, вызывающих ингибировнние ФФК, при старении эритроцитов, продуцированных как в условиях нормального, так и напряженного эритропоэза, соответствует изменению внутриклеточных концентраций АТФ.
Свойства фосфофруктокиназы
Литературные данные по структуре этого фермента очень противоречивы (124, 216, 226, 230, 236, 248, 292, 307, ЗП, 312, 319, 300). Полагают, что для фосфофруктокиназы характерна сложная четвертичная структура, способная к образованию ассо циатов с молекулярным весом до 2 млн (95, 105, 118, 319). Молекулярная масса ФШ, выделенной из эритроцитов кролика, составляет 200 000 300 000, Эта величина соответсвует молекулярной массе фермента из сердечной мышцы (105, 118, 236). Отдельная субъединица фосфофруктониназы содержит один актив-ный и один ингибиторный центр, специфичный для АТФ (244, 267).
По данным (54, 175, 176, 195, 209, 222, 267) фосфофрук-токиназа представляет собой смесь фосфорилированнои и нефос-форилированной форм, что может приводить к наличию двух независимых параллельных процессов ассоциации (106, 222, 267). Есть указания на то, что в системе, возможно, параллельно существуют несколько процессов ассоциации-диссоциации разных типов симметрии (106, 209).
И.М.Рапанович с соавторами (106) на основании данных по седиментационному поведению фермента, полученных методом скоростного центрифугирования, построили восемь наиболее вероятных моделей ассоциации фосфофруктокиназы типа: мономер--димер-тример-тетрамер и линейной полимеризации вплоть до октомера с двумя константами ассоциации, где "мономером" ассоциации могут быть тримеры, тетрамеры и гексамеры.
Большинство исследователей считают (106, 195, 229, 267), что диссоциация до димеров вызывает полную потерю активности, но обратимая диссоциация - процесс довольно медленный по сравнению с быстрым уменьшением активности под влиянием АТФ. Поэтому, вероятно, аллостерическая регуляция осуществляется на уровне изменения конформации тетрамерного фермента.
Фракционирование эритроцитов
Разделение эритроцитов на возрастные группы основано на увеличении удельной плотности при старении эритроцитов (63, 65). Фракционирование эритроцитов осуществлялось путем многократных повторных центрифугирований клеток, взвешенных в плазме, с последующим отбором верхней и нижней части эритроцитарного столба по методике Авраамовой Т,В., разработанной на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярского Госуниверситета (5), Свежая гепаринизированная кровь тщательно перемешивалась и разливалась в 7 центрифужных пробирок. Кровь в одной из пробирок использовалась для изучения общей эритроцитарной массы, оставшаяся часть подвергалась фракционированию по схеме (рис, 6). I, После первого 20-минутного центрифугирования крови при 3000 об/мин, 4С осторожно отбиралась плазма, используе мая для дальнейшего.фракционирования эритроцитов, тщательно собирался и отбрасывался лейкоцитарный слой. Верхняя половина эритроцитарного столба всех пробирок переносилась в Две новые пробирки "Bj", Оставшаяся часть эритроцитов собиралась в две пробирки "Hj". Эритроциты ресуспендировались до 50$ гемато крита и подвергались центрифугированию при тех же условиях. II. После второго центрифугирования отсасывалась плазма, из двух пробирок "Bj" отбиралась половина эритроцитов и поме щалась в одну пробирку "Вз" и вновь ресуспендировалась в рав ном объеме плазмы; нижняя часть эритроцитарного столба про бирок "Bj" отбрасывалась. Содержимое пробирок "Hj" также делилось на две части: верхняя часть эритроцитарного столба пробирок "Hj" удалялась, а нижняя часть содержимого пробирок сливалась в одну "Hg" и обрабатывалась аналогичным образом.
class3 АКТИВНОСТЬ, КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ФОСШРУКТО-
КИНАЗЫ, СОДЕРЖАНИЕ ПРИ СТАРЕНИИ ЭРИТРОЦИТОВ, ПРОЕЦИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ НОРМАЛЬНОГО ЭРИТРОПОЭЗА class3
Активность и кинетические свойства ФФК
Старение эритроцитов сопровождается снижением интенсивности гликолиза, изменением активности ряда ферментов этого процесса. Однако сведения относительно поведения фосфофруктокиназы при старении красных клеток носят противоречивый характер, особенно это касается степени снижения активности и изменения кинетических свойств фермента (215-217, 273). Эти противоречия объясняются тем, что в различных работах используются неодинаковые методы разделения на возрастные группы (295-298); часто активность фермента эритроцитов сравнивается с активностью ретикулоцитов или крови, обогащенной ретикулоцитами, а также разными объектами исследования (299-302), неодинаковой глубиной кровопотери или введением гемолитических ядов, оказывающих сильное влияние на метаболизм клетки.
В настоящей главе приводятся результаты экспериментов по определению активности фосфофруктокиназы, исследованию кинетических параметров ФШ (К , Vma . , гк для АТФ и фрук-тозо-6-фосфата), влиянию концентрации АДФ на эти параметры, а также содержанию АТФ и АДФ во фракциях молодых, старых клеток и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов.
class4 АКТИВНОСТЬ, КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ФОСФОШТОГО-
КИНАЗЫ, СОДЕРЖАНИЕ АТФ И AM ПРИ СТАРЕНИИ ЭРИТРОЦИТОВ, ПРОДУЦИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ НАПРЯЖЕННОГО ЭРИТРОПОЭЗА class4
Активность, кинетические свойства, содержание АТФ и АДФ на 7 сутки после кровопотери
Седьмые сутки после кровопотери характеризуются высоким ретикулоцитозом, в кровяном русле присутствуют две популяции эритроцитов, продуцированных как при нормальном, так и при напряженном эритропоэзе (46-51). В этот период фракция молодых клеток представлена популяцией эритроцитов, образованных в условиях напряженного эритропоэза, общая эритроцитарная масса содержит смешанную популяцию клеток, продуцированных как в условиях нормального, так и напряженного эритропоэза, во фракции старых клеток присутствуют эритроциты, продуцированные до кровопотери в условиях нормального эритропоэза.
