Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЕМСОДЕРЖАЩИХ
ФЕРМЕНТОВ И ПЕРЕНОСЧИКОВ ЭЛЕКТРОНОВ (обзор
литературных данных) 9
-
Функции гемсодержащих белков 9
-
Цитохромы с 9
-
Одногемовые цитохромы с II
-
Природа окислительно-восстановительного потенциала 14
-
Механизм внутримолекулярного переноса электронов 16
-
Цитохромы с» 19
-
Цитохромы Сз 21
1.3. Цитохромы в 23
-
Цитохром в 23
-
Цитохром В 26
-
Цитохром Р-450 28
-
Пероксидазы 30
-
Цитохром с пероксидаза 32
-
Пероксидаза из хрена 35
-
Миелопероксидаза 36
-
Хлоропероксидаза 37
-
Каталазы .....38
-
Цитохром с оксидаза 40
-
Структура белковых комплексов и механизм переноса электронов в них 43
ГЛАВА П. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА
ТОКОПРОЮДЯЩИХ МАТЕРИАЛАХ ГЕМСОДЕРЖАЩИХ ФЕРМЕНТОВ .. 48
2.1. Материалы и методы исследования 48
-
Ферменты 48
-
Иммобилизация ферментов на токопрово-дящих матрицах 50
-
Изготовление рабочих электродов 50
-
Электрохимические измерения 51
-
Изготовление биферментных электродов .. 53
-
Методика исследования действия активаторов на биоэлектрокаталитическое восстановление HgO^ 54
-
Использованные материалы и аппаратура.. 54
2.2. Электровосстановление перекиси водорода
в присутствии гемсодержащих ферментов 55
-
Каталитические свойства иммобилизованной на токопроводящих материалах пероксидазы из хрена 55
-
Каталитические свойства иммобилизованной на графитовых электродах лактопероксидазы 76
-
Функционирование катализ, иммобилизованных на токопроводящих матрицах ... 80
-
Окисление ь-лактата иммобилизованным на токопроводящих органических комплексах цитохром в^ 82
-
Окисление L-лактата иммобилизованным на графитовых электродах цитрохромом Bg 85
-
Окислительно-восстановительные превращения цитохрома с на оптически прозрачных электродах 90
-
Свойства иммобилизованной на "органических металлах" пероксидазы в присутствии глюкозо-оксидазы или холестеролоксидазы 98
ГЛАВА Ш. МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ГЕМСОДЕРЖАЩИХ ФЕРМЕНТОВ
НА ТОКОПРОВОДЯЩИХ МАТРИЦАХ 101
3.1. Кинетические закономерности действия гемсо
держащих ферментов в иммобилизованном
состоянии 101
-
Природа биокаталитического тока 101
-
Лимитирующая стадия биоэлектроката-литического превращения субстратов .... Ю6
-
Закономерности действия активаторов пероксидазы НО
-
Закономерности действия биферментных систем ИЗ
3.2. Молекулярный механизм действия гемсодержащих
ферментов на интерфазе электрод/электролит ... 115
3.2.1. Туннельный механизм переноса электро
нов между активным центром фермента
и токопроводящей матрицой ....115
-
Ориентационные факторы в биоэлектро-катализе 118
-
Механизм действия ГОИ 121
ВЫВОДЫ 125
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 127
Введение к работе
Гемсодержащие белки являются важнейшими молекулярными компонентами митохондриального дыхания, фотосинтеза и пероксидаз-ного катаболизма. Электрон-транспортные процессы с участием этих белков широко исследованы спектрофотометрическими и потен-циометрическими методами. На основе этих исследований получены кинетические и термодинамические характеристики закономерностей переноса электронов в разных метаболических системах в гомогенной среде. Однако большинство гемсодержащих белков не реагируют в цитоплазме, а перенос электронов осуществляется на границе мембрана/цитоплазма, где напряженность электрического поля дос-
7 8 тигает 10-10 В/м и имеет место локальное изменение рН. Кроме того, переносчики электронов, образующие электрон-транспортные цепи, функционируют не изолировано, а объединены в комплексы с достаточно строгим составом и структурой. Расположенные в фос-фолипидной мембране, они обеспечивают как векторность процессов электронного транспорта, так и их высокую эффективность. Поэтому очевидным является, что молекулярные механизмы переноса электронов, протекающего в фосфолипидных мембранах, могут быть выяснены лишь путем исследования этих процессов на интерфазе.
Один из путей создания модельных систем, содержащих функционирующие на интерфазе белки, состоит в иммобилизации этих белков на токопроводящих материалах и изучении их функционирования электрохимическими методами. Эти методы, обладая существенными преимуществами перед другими физикохимическими методами исследования, а именно, высокой чувствительностью, малым объемом растворов и возможностью изучения в оптически непрозрачных средах, позволяют исследовать белки на интерфазе, которую можно организовать подобно границе раздела фаз фосфоли- пидная мембрана/цитоплазма.
Цель настоящей работы заключалась в изучении реакций переноса электронов с участием иммобилизованных на токопроводящих материалах гемсодержащих ферментов.
Задачи: иммобилизация гемсодержащих ферментов - пероксидазы, лактопероксидазы, цитохрома в^ и катализ на токопроводящих материалах; изучение кинетических закономерностей действия биоэлек-трокаталитических систем окисления лактата и восстановления перекиси водорода на основе цитохрома в% и пероксидаз; изучение влияния состояния интерфазы на эффективность биоэлектрокаталитических процессов.
В работе проведена иммобилизация пероксидазы, лактопероксидазы, цитохрома В и катализ на токопроводящих материалах путем необратимой адсорбции.
Впервые изучены каталитические свойства пероксидазы из хрена, иммобилизованной на токопроводящих органических комплексах. Показано, что биоэлектрокаталитическое восстановление перекиси водорода начинается при потенциалах электрода на 0,55 В более положительных, чем в отсутствие фермента.
Впервые осуществлен прямой обмен электронов между активным центром лактопероксидазы и графитовым электродом.
Впервые исследована кинетика генерации биокаталитического тока при адсорбции пероксидазы и цитохрома Bg на токопроводящих матрицах. Показано, что процесс протекает по первому порядку. Константа скорости процесса зависит от концентрации белка в степени 0,32-0,44 и 0,18 для пероксидазы и цитохрома В, соответственно. При совместной адсорбции фермента и иенртного белка скорость процесса зависит от общей концентрации белка в растворе.
Впервые исследовано влияние состояния интерфазы для переноса электронов с участием гемсодержащих ферментов. Показано, что изменение поверхностного состояния токопроводящей матрицы путем модификации липидами или редокс неактивными полимерами, путем изменения рН раствора и потенциала электрода, влияет на эффективность биоэлектрокаталитических процессов. Восстановление активных центров пероксидазы и лактопероксидазы в 1,38 и 1,33 раза медленнее на монослоем холестерина покрытых графитовых электродах. Рассчитанное расстояние между активным центром и токопроводящей матрицой равно 0,76 и 0,85 нм для пероксидазы и лактопероксидазы, соответственно.
Впервые выявлена роль электростатических взаимодействий между ферментом и токопроводящей матрицой для достижения оптимальной ориентации белковых глобул в интерфазе. Показано, что модификация поверхности электродов полиэтиленимином, -метил-поливинилпиридином или лизолецитином увеличивает эффективность окисления -лактата в присутствии цитохрома в% в 3,2-32 раза, а скорость генерации биокаталитического тока при адсорбции фермента - в 2,67 раза, что обусловлено уменьшением расстояния переноса электронов с 1,77 до 1,61 нм.
В работе впервые обнаружено ускорение биоэлектрокаталити-ческого восстановления перекиси водорода в присутствии органических и неорганических субстратов пероксидаз. В случае пероксидазы, иммобилизованной на токопроводящих органических комплексах, максимальный биокаталитический ток увеличивается в ' 1,89-2,67 раза, а в случае лактопероксидазы, иммобилизованной на графите - в 15-21 раз.
На основе биокаталитических систем, содержащих иммобилизованную пероксидазу, созданы биферментные электроды, чувстви- тельные к глюкозе и холестерину.
По данным диссертационной работы получено авторское свидетельство № 891774 "Способ получения ферментных электродов, чувствительных к метаболитам".
Основные положения, которые выносятся на защиту:
Иммобилизация гемсодержащих ферментов на токопроводящих материалах.
Кинетика генерации биокаталитического тока при адсорбции ферментов.
Биоэлектрокаталитическое восстановление перекиси водорода в присутствии субстратов пероксидаз.
Модификация токопроводящих матриц липидами и редокс неактивными полимерами и механизм влияния этих модификаторов на биоэлектрокаталитические процессы.
Создание чувствительных к холестерину и глюкозе бифер-ментных электродов и их параметры.
