Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной биохимии и физико-химической биологии является разработка и применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК), обладающих селективными свойствами окрашивания клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов [Феллинг и сотр., 2007; Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. ФФК изначально существуют в нефлуоресцентной форме, которая может быть преобразована во флуоресцентную форму путем облучения светом. Изменяя мощность облучающего света и его локализацию, можно варьировать число и пространственное расположение образовавшихся флуоресцентных «зондов» и далее следить за их движением, определять форму и взаимное расположение субклеточных объектов, помеченных ФФК. Эти и другие свойства таких красителей активно используются для разработки и применений новых методов исследования в биологической микроскопии [Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. Большинство существующих ФФК имеют большой размер «маскирующей» группы, а продукты их фотолиза токсичны для клеток [Банала и сотр, 2011]. Ведущим сотрудником лаборатории бионанофотоники Беловым В.Н. (Макс-Планк-Институт биофизической химии, Гёттинген, ФРГ) и профессором Зайцевым СЮ. (кафедра химии, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) в ходе многолетней работы по различным направлениям создания и исследования флуоресцентных красителей [Белов, Зайцев, 2010] были смоделированы новые ФФК производные родамина, имеющие компактную «маскирующую» группу, не токсичную для клеток. Эти ФФК являются ценным инструментом для исследователей в биохимии, биомедицине и бионанотехнологиях. Цель работы: комплексное исследование новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей - производных родамина, обеспечивающих возможность окрашивания клеток и субклеточных структур.
Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
-
Получить и исследовать липидные монослои с встроенными молекулами ФФК, определить и охарактеризовать параметры взаимодействия ФФК с липидами мембран.
-
Определить оптимальную концентрацию ФФК для окрашивания клеток, разработать методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.
3. Получить и исследовать препараты нативных клеток после общей и
локальной фотоактивации и определить возможность визуализации клеток в
реальном времени, используя ФФК.
4. Получить спектры флуоресценции ФФК в различных средах и
выявить зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости и рН.
5. Определить локализацию ФФК в препаратах нативных клеткок.
6. Получить конъюгат хитозана с иммобилизованными молекулами
ФФК и исследовать его на клеточной культуре.
Научная новизна работы. Впервые получены и детально исследованы смешанные монослои новых ФФК и фосфолипидов, моделирующие взаимодействие ФФК с биологическими мембранами. Определена оптимальная концентрация ФФК для окрашивания клеток, разработаны методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Впервые выполнена «прижизненная» микроскопия окрашенного монослоя клеток с помощью ФФК-813. Изучены зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды (вязкости и рН), а также выявлено концентрационное тушение флуоресценции, что позволило объяснить неодинаковую яркость разных субклеточных органелл и отличия окрашивания «фиксированных» и «нативных» клеток. Определена локализация ФФК-813 в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека А431 с помощью коммерческих селективных зондов. Впервые синтезирован конъюгат хитозана с ковалентно иммобилизованными молекулами ФФК, и показана его способность проникать внутрь клеток.
Практическая значимость. Полученные результаты позволяют использовать ФФК как клеточные маркеры в коммерческих наборах, а также для конъюгации с различными нефлуоресцирующими БАВ (в том числе лекарствами), которые можно детектировать с помощью локальной фотоактивации красителя в нативных и фиксированных клетках для определения их динамики и локализации. Данные зависимостей спектральных свойств ФФК от параметров среды позволяют оптимизировать параметры флуоресцентной микроскопии с учетом микроокружения красителя. Знания о локализации ФФК-813 в клетке позволят исследовать внутриклеточную динамику конкретных органелл нативных клеток и, возможно, их ультраструктуру в фиксированных клетках с помощью флуоресцентной наноскопии.
Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО МГАВМиБ для обучения бакалавров и магистров по дисциплинам «Избранные главы биохимии», «Спектральные методы исследования» «Супрамолекулярные биохимические системы в биологии мембран». Данная работа проводилась в рамках гос. контрактов № 02.740.11.5013 и № 02.740.11.0718 по федеральной научно-технической целевой программе Министерства образования и науки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», а также по проектам РФФИ (07-03-00588а, 10-03-00711а) и Макс-Планк-Института биофизической химии (г. Гёттинген, ФРГ). Основные положения, выносимые на защиту:
-
Характеристики и свойства монослоев, ФФК и фосфолипидов как моделей биологических мембран.
-
Оптимальные параметры для окрашивания клеток ФФК.
-
Сравнительные данные по микроскопии окрашенного с помощью ФФК монослоя нативных и фиксированных клеток.
-
Зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды и
внутриклеточного окружения.
-
Данные по локализации ФФК в препаратах нативных клетках.
-
Способность ФФК вступать в реакцию N-ацилирования по аминогруппе хитозана с образованием фотоактивируемого конъюгата, производного хитозана.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференциях молодых ученых и семинарах в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (2009-2012); на научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» (Казань, 2010); во 2-ом и 3-ем туре Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов ВУЗов Минсельхоза РФ, в номинации -биологические науки (Брянск, 2011; Краснодар, 2011); на Международном коллоквиуме «Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии- от истоков до наших дней» (Москва, 2011); на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); на третьей Международной научной конференции "Химическая термодинамика и кинетика" (Великий Новгород, 2013); на IV Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 12 статей (в том числе 6 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК) и 4 тезиса докладов на международных конференциях.
Личный вклад автора. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение эксперимента, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии. Обучение работе на лазерном конфокальном микроскопе осуществлялось при поддержке к.б.н. Свирщевской Е.В. (ИБХ РАН). В период стажировки в ФРГ (4 июля - 31 августа 2010 г.) руководство осуществляли профессор Д. Мёбиус и доктор В.Н. Белов, дальнейшие консультации которых были регулярными и ценными.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения.
