Введение к работе
Актуальность исследования
Современный уровень развития оптоэлектроники и вычислительной техники позволяет создавать и успешно внедрять новые инструменты исследования биологических объектов. Последние достижения в области компьютерной микроскопии и томографии [1,2] в сочетании с автоматизированными системами распознавания образов широко используются в качестве диагностических инструментов в клинической практике. Основная задача современных методов микроскопии - поиск корреляции между функциональным состоянием отдельной клетки и физическими параметрами ее органелл. Ее решение будет иметь фундаментальное значение для понимания внутриклеточной динамики, а также откроет перспективу разработки новых методов диагностики в молекулярной медицине. Практически важными приложениями таких методов являются скрининг биологически активных соединений и экспресс-диагностика ряда заболеваний на клеточном уровне.
Для решения подобных задач требуются методы, позволяющие проводить количественную оценку метаболических процессов в реальном времени на отдельных клетках или клеточных органеллах. В настоящее время для анализа динамических процессов в клетке используются методы атомно-силовой микроскопии [3], однако вследствие инвазивности экспериментов применение подобных методов для исследования клеток мягких тканей ограничено. Использование современных методов высокоскоростной конфокальной микроскопии [4] при исследовании быстрых динамических процессов также ограничено вследствие низкого пространственного и временного разрешения. Методы флуоресцентной микроскопии [5] требуют применения красителей, которые способны
вносить экспериментальные артефакты и воздействовать на метаболические процессы.
Наиболее перспективными оказываются методы интерференционной лазерной микроскопии, такие как когерентная фазовая микроскопия [6], динамическая фазовая микроскопия [7], оптическая когерентная томография [2] и модуляционная интерференционная лазерная микроскопия [8], которые позволяют осуществлять неинвазивные исследования клеточной морфологии и динамики со сверхвысоким пространственным разрешением.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы было развитие методов интерференционной лазерной микроскопии как новой методологической базы для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени. Предполагалось показать, что использование последних достижений оптоэлектроники позволяет увеличивать быстродействие существующих методов микроскопии при сохранении возможности сверхвысокого разрешения. Результатом работы должны быть реализованные в экспериментальных установках усовершенствованные методы интерференционной лазерной микроскопии (локальная динамическая и модуляционная интерференционная микроскопия), адаптированные для исследования фазовой микроморфологии и внутриклеточной динамики биологических объектов в реальном масштабе времени. Предметом исследования выбраны эритроциты и лимфоциты человека, нервные волокна лягушки, опухолевые клетки и пчелиные споры т.к. их исследования актуальны для биофизики и клинической практики.
Основные задачи работы:
-
Показать, что реализация метода локальной динамической лазерной микроскопии позволит в реальном времени регистрировать внутриклеточные динамические процессы с частотами до 30 Гц;
-
Показать, что применение ИК-лазеров (Я.=875 нм, ширина линии ДА. =0.5 нм) в качестве источников когерентного излучения для интерференционной микроскопии позволить минимизировать степень воздействия лазера на изучаемый объект;
-
Показать, что реализация нового алгоритма расчета фазы методом модуляционной интерференционной лазерной микроскопии позволит увеличить быстродействие экспериментальной установки до 200 кадров в секунду при сохранении возможности сверхвысокого пространственного разрешения.
-
Разработать программное обеспечение для регистрации обработки и анализа динамических процессов в реальном времени;
-
Провести апробацию методов локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии на биологических объектах и показать эффективность их применения для решения ряда исследовательских и диагностических задач;
Методы исследования
Исследования, отраженные в диссертационной работе осуществлялись следующими методами:
Когерентная фазовая лазерная микроскопия;
Динамическая фазовая лазерная микроскопия;
Локальная динамическая лазерная микроскопия;
Модуляционная интерференционная лазерная микроскопия.
Суть перечисленных методов изложена в 1 и 2 главах диссертационной работы.
Научная новизна
Научная новизна работы заключается в том, что разработанные и использованные автором методы (локальная динамическая и модуляционная интерференционная лазерная микроскопия) позволяют, в отличие от известных [3-5], проводить неинвазивные исследования морфологии и динамики нативных биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением. Предлагаемые автором методы исследования биообъектов позволяют на порядок сократить время исследований, расширить возможности методов когерентной фазовой и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии при исследовании внутриклеточной динамики, что отразится на увеличении эффективности применения этих методов для диагностических задач.
Практическая ценность работы
Данные, полученные при исследовании морфологии и динамики внутриклеточных процессов, позволяют судить о функциональном состоянии различных биологических объектов, что может быть использовано для экспресс-диагностики клеточных патологий на ранней стадии развития.
Результаты исследования активации лимфоцитов методом когерентной фазовой лазерной микроскопии успешно применяются для диагностики криза отторжения в трансплантологии в МОНИКИ им Владимирского.
Реализация и внедрение результатов работы
По результатам работы разработана и утверждена методика оценки жизнеспособности микроспоридий рода Nosema методом лазерной интерференционной микроскопии.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 26 научных работ, 11 из которых опубликованы в журналах, входящих в перечень изданий ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: Information technologies in modern Life (Bonn 2007), International Conference on Laser Applications in Life Sciences в 2007 и 2010 годах (LALS-2007 и LALS-2010), III Троицкая конференция «Медицинская Физика и Инновации в Медицине (Троицк 2008), V International Optical Congress "Optics - XXI Century" Topical Meeting on Optoinformatics (St. Petersburg 2008); Международная научная конференция МИРЭА Intermatic (Москва 2008), Международный форум Высокие технологии XXI века (Москва 2008, 2009), Международный форум по нанотехнологиям Роснанофорум (Москва 2008, 2009), Московская региональная научно-практическая конференция Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва 2009,2010);
Личный вклад автора
Усовершенствованный при непосредственном участии автора научно-методический аппарат позволяет исследовать морфологию и динамику биообъектов в реальном времени, тем самым расширить возможности методов при исследовании отклика объекта на внешнее воздействие.
Выявленные автором закономерности изменения морфологии и характера внутриклеточных динамических процессов биообъектов при внешних воздействиях позволяют сделать вывод об эффективности применения методов локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии для оценки функционального состояния широкого круга биологических объектов.
Достоверность результатов
Достоверность экспериментальных результатов обеспечивается отработанными методиками проведения измерений и обработки результатов, а также авторитетом рецензентов, соавторов, консультантов и научных руководителей выполненных работ.
Структура и объем диссертации
