Содержание к диссертации
Стр.
ВВЭДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА I. ГЛУТАМАТ - НЕЙРОМЕЩИАТОР В ЩС ШІЖОПИТАІОЩИХ . 15
Доказательства нейромедиаторнои роли глутамата в 1ЩС млекопитающих. Пресинаптические критерии 16
Постсинаптические критерии доказательства медиаторной функции глутамата. Классификация глутаматных рецепторов 20
Основные глутаматергические пути ЦНС млекопитающих 28
Вовлечение глутаматергических путей в механизмы патогенеза ряда заболевании ЦНС ... 35
ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА. УЧАСТКОВ СВЯЗЫВАНИЯ L-ГЛУТАМАТА
НА СИНАПТИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА . . 45
Методологические аспекты определения рецепторного связывания L-глутамата 45
Кинетические параметры связывания \-ъ-глутамата 51
Влияние ионного состава инкубационной смеси
на специфическое связывание н-ь -глутамата . 55
2.4. Фармакологические свойства участков связы-
3
вания н-L -глутамата . 56
2.5. Молекулярные характеристики солюбилизирован-
ных глутаматных рецепторов 62
ГЛАВА 3. ЭНДОГЕННАЯ РЕГУЛНІЩ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ . . 66
Са2+ и Са2+-зависимые протеазы 68
Мембранные лигшды 70
Гуаниловые нуклеотиды. Связь глутаматных рецепторов с системой циклических нуклеотидов . 72
Эндогенные ингибиторы пептидной природы ... 75
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 82
4.1. Выделение и характеристика синаптических
мембран из ткани головного мозга 82
Схема выделения мембран 82
Электронномикроскопический анализ выделенных фракций 83
Электрофорез мембранных белков в полиакри-ламидном геле в присутствии додецилсульфа-
та натрия 83
Определение активности Na, К-АТФазы .... 86
Определение неорганического фосфата .... 87
Определение активности цитохромоксидазы . . 87
Определение активности глутаматдекарбо-ксилазы 89
Определение содержания белка в пробах ... 90
Выделение синаптических мембран из посмертных препаратов мозга человека .... 92
4.1.10.Хранение препаратов синаптических мембран . 92
4.2. Выделение плазматических мембран клеток
нейробластомы 92
4.2.1. Культивирование клеток нейробластомы ... 92
- 4 -4.2.2. Схема выделения плазматических мембран
клеток нейробластомы 93
4.3. Определение специфического связывания
%-Ь-глутамата 95
Методика эксперимента и аппаратура .... 95
Обработка экспериментальных данных .... 98
4.4. Выделение и очистка эндогенного фактора,
ингибирующего специфическое связывание
%-L -глутамата (ФИО) 99
Получение первичного экстракта ФИО .... 99
Осаадение балластных белков 99
Ионообменная хроматография ФИО HaDowex AG 50x2 (концентрирование) 100
Гель-фильтрация ФИО на Sephadex G-25 . . 101
Ионообменная хроматография ФИО на Dov/ex
AG 50 х 2 ЮЗ
4.4.6. Определение нингидрин-положительного
материала в полученных фракциях 104
4.5. Характеристика ФИО 104
Аналитическая тонкослойная хроматография (ТОХ) 104
Полупрепаративная тонкослойная хроматография . . 106
Анализ аминокислотного состава ФИО на высокочувствительном аминокислотном анализаторе 107
Эксперименты с крысами линии Крушинского-Молодкиной 107
Статистическая обработка результатов . . . 108
4.8. Материалы, использованные в исследовании .... 109
ГЛАВА 5. СВЯЗЫВАНИЕ 3H-L -ГЛУТАМАТА С СИНАПТИЧЕСКИМИ
МЕМБРАНАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМ ИЗ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА
КРЫС И ЧЕЛОВЕКА III
Характеристика синаптических мембран III
Характеристика специфического связывания %-L-глутамата с синаптическими мембранами коры
головного мозга крыс 117
5.3. Связывание н-ь-глутамата с синаптическими
мембранами, выделенными из посмертных препаратов
коры головного мозга человека 123
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ КАТИОНОВ НА СПЕЦИФИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ h-Ъ -ГЛУТАМАТА С СИНАПТИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ И ПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ . 126
Влияние Na+ на связывание ^-Ь-глутамата с синаптическими и митохондриальными мембранами . 126
Влияние Са + на связывание %-ъ -глутамата с
синаптическими и митохондриальными мембранами . 128
6.3. Связывание H-L-глутамата с плазматическими
мембранами гибридных клеток нейробластомы ІИ8. 131
ГЛАВА 7. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СВЯЗЫВАНИЯ
3Н-ЬГЛУТАМАТА 135
ГЛАВА 8. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОГЕННОГО ФАКТОРА,
ИНГИБИРУЩЕГО СПЕЦИФИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ Зн-Ь-ГЛУ
ТАМАТА 148
ГЛАВА 9. ХАРАКТЕРИСТИКА СВЯЗЫВАНИЯ 3H-L -ГЛУТАМАТА В
МОЗІУ КРЫС ЛИНИИ КРУШЕСКОГО-МОЛОДКИНОЙ И ВЛИЯ
НИЕ ФИС НА РАЗВИТИЕ У НИХ АУДИОГЕННОГО СУДОРОЖ
НОГО ПРИПАДКА 158
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 161
ВЫВОДЫ 169
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 171
Список сокращений
АДФ - аденозиндифосфат
ШШ " - аденозинмонофосфат
АРВ - 2-амино-4-фосфономасляная кислота
АТФ - аденозинтрифосфат
АТаза - аденозинтрифосфатаза
АЦ - аденилатциклаза
Вмах - концентрация участков связывания
в/б - внутрибрюшинно
в/ж - внутрь желудочков мозга
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ВПСП - возбуждающий постсинаптический потенциал
ГАМК - гаммааминомасляная кислота
ГДК - глутаматдекарбоксилаза
ГШ> - гуанозинмонофосфат
ГТФ - гуанозинтрифосфат
ДП - длительная потенциация
Кд - константа связывания
Kj - константа ассоциации
K_j - константа диссоциации
Кд - константа ингибирования
КМ - крысы линии Крушинского-Молодкиной
СМЖ - спинномозговая жидкость
ФИО - фактор, ингибируюпщй специфическое связывание
ЦНС - центральная нервная система
IGgQ - концентрация вещества, при которой его ингибирующее
действие проявляется на 50$.
Введение к работе
Актуальность проблемы. Физиолого-биохимические исследования, проводимые в рамках комплексного подхода к изучению структурно-функциональной организации головного мозга человека под руководством академика Е.П.Бехтеревой, являются одним из важнейших направлений научных исследований Отдела нейрофизиологии человека НИИЭМ АМН СССР. В числе актуальных задач исследований механизмов формирования биоэлектрической активности стоит изучение вклада мембранных рецепторних структур в процессы интеграции электрических и метаболических взаимодействий в нервной ткани. В частности, в химических синапсах (которыми представлено абсолютное большинство синаптических контактов в ВДС позвоночных /46/)эффективность синаптической передачи во многом определяется состоянием постсинаптических рецепторов -сложных мембранных хеморецепторных комплексов, функция которых состоит в узнавании нейромедиатора и трансформации химического сигнала в электрический.
Накопленные за последние 20 лет экспериментальные данные свидетельствуют о том, что одним из основных медиаторов, опосредующих передачу нервных импульсов в возбуждающих путях ВДС млекопитающих, является анион глутаминовой кислоты - глутамат /125/. Исторически сложилось так, что постсинаптические рецепторы глутамата изучены значительно меньше, чем рецепторы других нейромедиаторов, таких как, например, ацетилхолин /10/ или катехоламины /I/. Остаются невыясненными молекулярная структура, механизмы функционирования и эндогенной регуляции глута-матных рецепторов. Широкая распространенность глутаматергичес-ких синапсов и недостаточная изученность механизмов их функци-
- 8 -онирования определяют важное теоретическое и практическое значение исследований в этой области.
Исследования глутаматных рецепторов в Отделе нейрофизиологии человека НИЙЭМ АМН СССР проводятся в рамках программы "Фундаментальные науки - медицине" по разделу 02.11.08 (изучение механизмов функционирования хеморецептивных мембран) и "Мозг" по разделу 4.1.3 (физиолого-биохимические основы устойчивых патологических состояний ВДС). Определение молекулярных характеристик и структуры активного центра глутаматного рецептора может дополнить и расширить имеющиеся представления об общих закономерностях организации и строения хеморецепторных комплексов. Понимание общих закономерностей функционирования хеморецепторов как "информационного входа" нейрона важно для разработки молекулярно-биологических подходов к изучению инте-гративной функции нейронов.
Следует отметить,: что глутаматергические нейроны найдены не только у млекопитающих, но и в центральной и периферической нервных системах беспозвоночных /2, 34/. Кроме того, глутамат-связывающие участки обнаружены на мембранах экстерорецептор-ных - вкусовых и обонятельных - органов самых различных животных: от простейших до приматов /55, 59/. Эти факты ставят проблему исследования структуры и свойств глутаматных рецепторов в круг вопросов, ответы на которые позволят во многом дополнить представления о ходе естественной эволюции химических факторов переноса информации и опосредуемых ими систем /37/.
Особое место в кругу вопросов, связанных с функционированием глутаматных рецепторов, занимает проблема их эндогенной и экзогенной регуляции. Тот факт, что глутаматные рецепторы являются важной функциональной частью возбуждающих путей головного
мозга, определяет их участие в молекулярных механизмах патогенеза целого ряда неврологических заболеваний, таких как, например, эпилепсия /40/. Относительная стабильность мембранных рецепторних комплексов и, вместе с тем, возможность направленного изменения их характеристик обусловливает вероятность участия этих структур в формировании патологических состояний, возникающих при некоторых заболеваниях ЦНС. Соответственно, воздействие именно на эти участки синаптической передачи может оказаться эффективным для терапевтической коррекции подобных состояний.
Биохимическое изучение глутаматных рецепторов in vitro , основанное на применении радиолигандного метода, позволяет выделить факторы, действующие непосредственно на процесс связывания медиатора с выделенными из нервной ткани синаптическими мембранами. Преимущество этого подхода перед изучением фармакологических характеристик рецепторов in vitro и на изолированных препаратах нервной ткани состоит в возможности точно локализовать участок взаимодействия изучаемых регуляторних факторов с препаратом. Применение радиолигандного метода позволяет стандартизировать процедуру первичного скрининга синтетических соединений, конкурирующих с глутаматом за участки рецепторного связывания. Тестирование соединений такого рода может дать ценную информацию о структуре активного центра мембраносвязанного рецептора и одновременно оптимизировать процессы поиска и создания новых фармакологических препаратов, воздействующих непосредственно на узнающие участки рецепторних комплексов в возбуждающих путях головного мозга.
Наряду с созданием синтетических фармакологических препаратов, взаимодействующих с рецепторами ЦНС, не менее важным
- 10 -представляется поиск эндогенных, присущих самому организму, факторов, регулирующих сннаптическую активность. В отличие от многочисленных ферментных систем, экзогенные и эндогенные регуляторы которых в настоящее время уже достаточно хорошо изучены /108/, о регуляции нейромедиаторных и, в особенности, глу-таматных рецепторов известно значительно меньше. В частности, недостаточно изучена роль ближайшего ионного окружения рецептора и, прежде всего, ионов Са и Na , не определены природа и свойства эндогенного ингибитора рецепторного связывания Ь-глутамата, обнаруживаемого в экстракте синаптосом /227/. Не исследована роль функциональных изменений глутаматных рецепторов в патогенезе заболеваний ЦВС.
Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось изучение механизмов эндогенной регуляции и возможностей направленного воздействия на рецепторное связывание ь-глутамата. В качестве методологической основы выбрана бескдеточная модель: определяемое радиолигандным методом связывание %-L--глутамата с выделяемыми из нервной ткани синаптическими мембранами.
В конкретные задачи входило:
Определение возможных регуляторних функций основных катионов, принигяающих участие в синаптической передаче - Яа+ и «га
Определение влияния на специфическое связывание %-ь--глутамата его известных аналогов и синтезированных на основе представлений о структуре активного центра рецептора веществ.
Выделение, частичная очистка и определение природы и свойств эндогенного ингибитора связывания ^-L-глутамата.
Исследование особенностей связывания ^-ь - глутамата
- II -
в структурах мозга крыс линии Крушинского-Молодкиной, обладающих наследственной предрасположенностью к аудиогенным судорожным припадкам.
Научная новизна работы. В работе впервые показана возможность изучения регуляторних механизмов эффективности синапти-ческой передачи in vitro в условиях, максимально приближенных к реально существующим. Найдены модели для селективного изучения и разделения На+- зависимого (ассоциированного с активным транспортом медиатора) и Па+-независимого (рецепторного) компонента специфического связывания %-ь-глутамата с синаптиче-скими мембранами.
Продемонстрирована регуляторная роль ионов Са2+ в активации глутаматных рецепторов. Предлагается новая схема эндогенной регуляции глутаматных рецепторов на основе взаимодействия
2+ +
рецепторного комплекса с ионами с а и Na .
Определено влияние на специфическое связывание *%-ь- глу-тамата более 50 различных аналогов глутаминовой кислоты, большинство из которых впервые синтезировано для этой цели в Отделе фармакологии НИИЭМ АМН СССР.
Впервые проведена очистка эндогенного ингибитора связывания %-L -глутамата, показана его пептидная природа, определены некоторые свойства и примерный аминокислотный состав.
Впервые определены параметры связывания %-Ъ-глутамата в отделах мозга крыс линии Крушинского-Молодкиной и изучены особенности их регуляции в ходе аудиогенного судорожного припадка.
Научно-практическое значение полученных результатов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на основе разработанной бесклеточной модели исследования рецепторного связывания ь- глутамата стало возможным изучение механизмов эндогенной
- 12 -регуляции рецепторов и методов направленного воздействия на глутаматергические возбуждающие пути ЦВС. Проведение исследований по изучению структуры активного центра рецептора показало перспективность синтеза соединений, включающих в свой состав структуры-аналоги глутаминовой кислоты, эффективно вытесняющие меченый глутамат с участков связывания на синаптических мембранах, выделенных как из мозга лабораторных животных, так и из посмертных препаратов мозга человека.
Важное значение имеет выявление в синаптосомальном экстракте эндогенного ингибитора связывания %-ь-глутамата с си-наптическими мембранами, определение его пептидной природы и основных характеристик. Детальное выяснение функциональной роли, определение аминокислотной последовательности и синтез этого пептида могут сыграть существенную роль в понимании регуляторних механизмов ЦНС, а также в создании на его основе новых фармакологических препаратов, избирательно воздействующих на глутаматергическую передачу и обладающих выраженным антиэпилептическим действием.
Обнаруженные изменения рецепторного связыванияь-глутама-та с синаптическими мембранами гиппокампа крыс линии Крушинско-го-Молодкиной во время аудиогенного судорожного припадка свидетельствуют о перспективности исследований функциональной роли нарушений регуляции глутаматных рецепторов ЩС в механизмах формирования эпилептиформной активности.
Структура диссертации, диссертация изложена на 170 стр. и состоит из введения, обзора литературы (главы I, 2 и 3), материалов и методов исследования (глава 4), собственных исследований (главы 5-9), обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 28 рисунками и содержит 9 таблиц. Список литера-
- ІЗ -туры содержит 271 название работ на русском и иностранных языках.
Положения, которые выносятся на защиту
1. Основная роль в эндогенной регуляции рецепторного свя-
о і і 9-4-
зывания Ь-глутамата принадлежит ионам с а и Па Ионы с а активируют мембраносвязанные глутаматные рецепторы предположительно за счет отделения блокирующей узнающие участки регуля-
+ торной субъединицы. В присутствии ионов Na значительно ускоряется диссоциация молекул глутамата от рецептора, включающего как минимум два идентичных узнающих участка.
Эндогенный фактор, блокирующий рецепторное связывание L-глутамата, представляет собой небольшой кислый пептид, включающий в свой состав остатки глутаминовой кислоты.
Наибольшие перспективы для осуществления направленного воздействия на глутаматные рецепторы в возбуждающих путях головного мозга предоставляет синтез соединений, имеющих в своей структуре аналоги глутаминовой кислоты: глутаматсодержащих пептидов и соединений глутаминовой кислоты с молекулами липидной природы.
Апробация работы. Апробация состоялась 25 октября 1984 г. на научной конференции Отдела нейрофизиологии человека (зав. отделом - академик Н.П.Бехтерева) НИИЭМ АМН СССР.
Основные результаты работы доложены на
Ш Советско-шведском симпозиуме по физико-химической биологии, Тбилиси, 1981 г.;
ІУ Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы, Ереван, 1983 г.;
16-й Международной конференции федерации европейских
- 14 -биохимических обществ (ФЕБО), Москва, 1984 г.;
- I Всесоюзном симпозиуме "Система мозговых и внемозговых пептидов", Ленинград, 1984 г.
