Введение к работе
Актуальность темы. Фактор VIII (FVIII) является критически важным белком системы свёртывания крови. Генетический дефицит или дефект фактора VIII является причиной гемофилии А, наиболее распространенного наследственного заболевания свёртывания крови, поражающего одного из 5000 мужчин. Болезнь сопровождается тяжелыми кровотечениями, нередко со смертельным исходом, и спонтанными кровоизлияниями в суставах [Plug et al. 2006]. Изучение молекулярных механизмов ключевых взаимодействий FVIII с компонентами системы свёртывания крови, несомненно, является фундаментальной задачей биохимии человека. В настоящей работе были исследованы молекулярные механизмы принципиально важных взаимодействий FVIII на разных стадиях его жизненного цикла. В частности, мы установили механизм взаимодействия FVIII с фактором фон Виллебранда (vWf), происходящего сразу же после секреции FVIII в кровоток и критически важного для выживания FVIII в циркуляции, механизмы активации FVIII тромбином и активированным фактором X (FXa), а также механизмы протеолитической инактивации FVIII активированным протеином С (АРС) и плазмином. Мы также впервые установили механизм рецептор-опосредованного клиренса FVIII из кровотока, идентифицировали сайты и критически важные аминокислотные остатки FVIII и рецептора, участвующие во взаимодействии.
Главным способом лечения гемофилии А является заместительная терапия больных гемофилией А концентратами FVIII, приготовленными из плазмы крови доноров, или более безопасными и современными, но весьма дорогостоящими, рекомбинантными препаратами FVIII [Lee 2002]. Наиболее обещающим подходом для увеличения эффективности и доступности терапии гемофилии А является создание рекомбинантного полноразмерного FVIII со свойствами, улучшенными по сравнению с природным диким типом. Полученные нами фундаментальные данные о расположении функционально важных сайтов FVIII создают основу для модулирования ключевых взаимодействий FVTII в направлении увеличения времени жизни в кровотоке, большей чувствительности FVIII к активации, большей стабильности активированной формы FVIII и её большей устойчивости к протеолитической инактивации. В свою очередь, модулирование ключевых биохимических взаимодействий FVIII перспективно для создания терапевтических препаратов FVIII нового поколения.
Цель работы. Изучить критически важные молекулярные механизмы, ответственные за поддержание уровня FVIII в кровотоке, его функциональную активность, инактивацию и клиренс из циркуляции. Задачи исследования:
1. Установить молекулярные механизмы связывания FVIII с vWf и диссоциации этого комплекса в результате протеолитической активации.
2. Изучить молекулярные основы узнавания и протеолиза FVIII важнейшими
физиологическими активаторами - тромбином и фактором Ха.
3. Определить механизмы протеолитической инактивации FVIII
активированным протеином С и плазмином и регулирования этих процессов
протеином S и vWf.
4. Установить важнейшие эпитопы связывания гемофилийных
ингибиторных антител на молекуле FVIII и механизмы ингибирования
функциональной активности FVIII.
5. Изучить молекулярный механизм рецептор-опосредованного клиренса
FVIII из кровообращения.
Научная новизна. Установлены молекулярные механизмы, взаимодействия FVIII с важнейшими физиологическими лигандами на различных стадиях его жизни - от секреции в кровоток до клиренса из циркуляции. Эти механизмы определяют поддержание уровня FVIII в кровотоке, его протеолитическую активацию, инактивацию и клиренс из циркуляции. В частности, были локализованы сайты FVIII, отвечающие за связывание FVIII с vWf, необходимое для защиты FVIII от протеолитической деградации, преждевременного связывания с фосфолипидами и клиренсными рецепторами. Изучение механизма активации FVIII, необходимого для диссоциации его комплекса с vWf, позволило установить молекулярные механизмы взаимодействия FVIII с двумя важнейшими протеазами-активаторами: фактором Ха и тромбином. Были локализованы сайты связывания тромбина и FXa на молекуле FVIII и идентифицированы отдельные аминокислоты в этих сайтах, играющие ключевую роль в связывании.
В ходе изучения молекулярных механизмов инактивации FVIII нами было впервые показано, что протеин S, являющийся классическим кофактором активированного протеина С, способен ингибировать функциональную активность FVIII путём ингибирования связывания FVIII с активированным фактором IX (FIXa) в теназном комплексе. Эта способность протеина S определяется перекрыванием сайта связывания FIXa и идентифицированного нами сайта связывания протеина S на молекуле FVIII. Нами был открыт и ещё один механизм регулирования протеолитической инактивации FVIII, обусловленный прямой конкуренцией vWf и активированного протеина С (АРС) за общий сайт связывания на молекуле FVIII.
Поскольку серьезным осложнением при заместительной терапии гемофилии А является образование антител, связывающих FVIII и ингибирующих его функциональную активность, мы установили важнейшие эпитопы связывания антител больных гемофилией А на молекуле FVIII и установили молекулярные механизмы инактивации FVIII этими антителами.
Одним из ограничений заместительной терапии при лечении гемофилии А является относительно короткое время полужизни FVIII. Мы изучили механизмы, отвечающие за регулирование уровня FVIII в кровотоке и определяющие клиренс FVIII из циркуляции. Открытие молекулярных основ этого метаболического пути FVIII позволило разработать концепцию создания рекомбинантного FVIII с улучшенными фармакокинетическими характеристиками для более эффективной терапии гемофилии А.
Научно-практическое значение. Главное направление лечения гемофилии А -заместительная терапия, заключающаяся в периодическом введении дорогостоящих концентратов FVIII, которые получены либо из плазмы крови доноров, либо рекомбинантным путём. Поскольку в настоящее время наблюдается устойчивый сдвиг в сторону использования в клинике более безопасных рекомбинантных препаратов FVIII, стоимость которых выше препаратов FVIII из плазмы крови, возникает необходимость создания препаратов FVIII нового поколения с повышенной терапевтической эффективностью. Наши исследования, в ходе которых были впервые установлены молекулярные механизмы и важнейшие сайты FVIII, ответственные за его активацию, стабильность, инактивацию и клиренс из циркуляции, служат основой для создания FVIII, обладающего улучшенными терапевтическими свойствами. Такой FVIII необходим для улучшения качества и удешевления терапии больных гемофилией А. Основные положения, выносимые на защиту:
Локализованы сайты FVIII, ответственные за связывание с vWf, и установлены механизмы образования комплекса FVTII с vWf, а также механизмы диссоциации комплекса при его активации и последующего связывания FVIII с фосфолипидом.
Локализованы сайты связывания FVIII, участвующие во взаимодействии с важнейшими активаторами - тромбином и активированным фактором X и установлены соответствующие молекулярные механизмы активации
Установлены новые механизмы, регулирующие инактивацию FVilla, такие как непротеолитический механизм инактивации F Villa протеином S, протеолитическая инактивация плазмином, а также прямое vWf-зависимое регулирование инактивации FVIII активированным протеином С.
Определены важнейшие эпитопы FVIII, связывающие различные классы ингибиторных антител больных гемофилией, и установлены механизмы инактивации FVIII этими антителами.
Установлен механизм клиренса FVIII из кровотока, опосредованный рецепторами семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности, и установлены механизмы контроля уровня и активности FVIII четырьмя различными рецепторами этого семейства.
Апробация работы. Работа прошла апробацию 14 февраля 2012 г. на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Материалы диссертации доложены автором на следующих конференциях и съездах: XVIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Florence, Italy, June 6-12, 1997; 41st Annual Meeting of the American Society of Hematology, New Orleans, Louisiana, USA, December 3-7, 1999; XVIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Washington, DC, USA, September 15-21, 1999; International Congress on Thrombosis, Porto, Portugal, May 5-8, 2000; XVIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis, Paris, France, July 6-12, 2001; XXV International Congress of the World Federation of Hemophilia, Seville, Spain, May 19-24, 2002; XXXV Nordic Conference on Coagulation, Reykjavik, Iceland, August 10-13, 2002; XIX Congress of the International Society of Thrombosis and Haemosytasis, Birmingham, UK, July 12-18, 2003; 45th Annual Meeting of the American Society of Hematology, San Diego, CA, December 6-9, 2003; Hemophilia 2004 World Congress, Bangkok, Thailand, October 17-21, 2004; Fifth Bari Interantional Conference on Hemophilia and Allied Disorders, von Willebrand Factor and Platelet Glycoproteins, Pizzomunno, Vieste del Gargano, Italy, May 22-25, 2005; XXth Congress of International Society of Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia, 5-13 August, 2005; 47th Annual Meeting of the American Society of Hematology, Atlanta, Georgia, USA, December 10-13, 2005; State of the Art International Symposium on Pharmacokinetics of Factor Concentrates in Hemophilia, Toronto, Canada September 29-30, 2005; 36th Haemophilia Symposium, Hamburg, Germany, November 18-19, 2005; XXth Hemophilia Forum, Telfs, Austria, 16-19 March, 2006.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 91 работа, в том числе 60 статей в реферируемых научных изданиях и 31 работа в материалах конференций и съездов.
Личное участие автора в получении результатов. Автором полностью выполнены эксперименты по изучению взаимодействия FVIII с фактором фон Виллебранда, синтетическими фосфолипидами и тромбоцитами. Автором были проведены эксперименты по картированию эпитопов ингибиторных антител, выделенных из крови больных гемофилией А, установлению механизмов ингибирования активности FVIII этими антителами, а также по изучению влияния мутаций в молекуле FVIII на время полужизни активированной формы FVIII. Сайты связывания тромбина, фактора Ха, плазмина, протеина С и S были установлены и охарактеризованы в ходе совместных исследований автора с группой учёных Медицинского Университета города Нара, Япония. В этих исследованиях автор провёл измерения кинетики ключевых белок-белковых
взаимодействий в реальном времени методом плазмонового резонанса. В ходе изучения рецептор-опосредованного клиренса FVIII автор руководил группой сотрудников и разрабатывал дизайн всех экспериментов. Кроме того, на начальной стадии этих исследований автором были проведены ключевые эксперименты, показывающие, что гепато-рецептор (LRP) из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности связывает FVIII в очищенной системе и осуществляет его эндоцитоз и клиренс in vitro и in vivo.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырёх глав, 27 таблиц, 84 рисунков, выводов и библиографического указателя, включающего 346 источников.
