Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
Метаболизм метионина 8
1.1 Биологические реакции трансметилирования 12
1.2 Другие Ме1(Аёо)-зависимые процессы 15
1.3 Биологическая роль и применение S-метилметионина 18
1.4 Катаболизм метионина 20
1.5 Регулирование обмена метионина фосфорорганическими аналогами серосодержащих аминокислот 21
1.6 Микробная L-метионин-у-лиаза 27
2. Результаты и обсуждение 38
2.1 Синтез фосфорорганических аналогов у-замещенных серосодержащих аминокислот 38
2.2 Стабильность фосфорорганических аналогов S-аденозилметионинаи S-метилметионина 42
2.3 Синтез фосфорорганических аналогов гомосерина 47
2.4 Взаимодействие фосфорорганических аналогов аминокислот обмена метионина с L-метионин-у-лиазой 50
2.5 Энантиоселективный синтез фосфиновых аналогов у-замещенных серосодержащих аминокислот 65
2.6 Влияние фосфинового аналога метионина на клетки Citrobacter intermedins 68
3. Экспериментальная часть 73
3.1 Препараты и оборудование 73
3.2 Синтез фосфорорганических аналогов серосодержащих аминокислот 74
3.3 Исследование устойчивости фосфорорганических аналогов S-аденозилметионина и S-метилметионина 79
3.4 Синтез фосфорорганических аналогов гомосерина 80
3.5 Взаимодействие фосфорорганических аналогов аминокислот с L-метионин-у-лиазой из С. intermedins и С. freundii 83
3.6 Энантиоселективный синтез фосфиновых аналогов у-замещенных серосодержащих аминокислот 85
3.7 Влияние фосфинового аналога метионина на клетки Citrobacter intermedins 87
Выводы 88
Литература 89
- Другие Ме1(Аёо)-зависимые процессы
- Синтез фосфорорганических аналогов у-замещенных серосодержащих аминокислот
- Энантиоселективный синтез фосфиновых аналогов у-замещенных серосодержащих аминокислот
- Синтез фосфорорганических аналогов серосодержащих аминокислот
Введение к работе
Обширное семейство природных и синтетических
фосфорорганических аналогов аминокислот включает большую группу соединений, относящихся к фосфиновым 1 и фосфоновым 2 кислотам, в основе разнообразной физиологической активности которых лежит влияние на обмен аминокислот и особенности действия которых во многом зависят от строения фосфорсодержащего фрагмента.
R'
В 1-аминоалкилфосфонатах 2 двухосновная фосфонатная группа Р(0)(ОН)2 значительно отличается размерами, геометрией и кислотностью от карбоксильной группы аминокислоты, что делает представления о прямом структурном подобии фосфонатов 2 аминокислотам достаточно формальными. Вместе с тем, строение фосфонатов 2 позволяет рассматривать их как стабильные аналоги лабильных переходных состояний или промежуточных соединений в ферментативных превращениях аминокислот, что явилось основой создания новых видов ингибиторов ферментов аминокислотного обмена [1] и гаптенов для каталитических антител [2].
Модификация фосфонатного фрагмента с заменой гидроксильной группы на водород вызывает кардинальные изменения базовых биохимических характеристик фосфоаналогов. Исследования по взаимодействию фосфинатов 1 с ферментам обмена аминокислот показали, что введение одноосновной группы Р(0)(ОН)Н вместо
карбоксильной группы аминокислоты не сказывается качественно на
связывании аналогов 1, но приводит к существенному снижению
скоростей субстратных превращений [3]. Изучение биологической
активности этих аналогов показало, что они способны, подобно
аминокислотам, к транспорту через микробные клеточные стенки [4].
Существенно, что способность фосфинатов 1 к субстратным
превращениям и образованию в качестве продуктов новых
фосфорорганических соединений оказалась связанной с их биологической
активностью. Таким образом, аминоалкилфосфинаты 1 могут
рассматриваться как изостеры природных аминокислот и являются
перспективным источником химических инструментов для
энзимологических исследований и биологически активных веществ.
Однако до настоящего времени не было осуществлено систематического
изучения их свойств как аналогов субстратов ферментов обмена
аминокислот, в особенности тех, коферментом которых является
пиридоксаль-5'-фосфат (PLP). О
NH2 NH2
la Y=SCH3,X=H lr R=Ado, X=H, Y=C1
2a Y=SCH3, X=OH 26 R=Ado, ХЮН, Y=OAc
16 Y=SH, X=H Ід R=CH3, X=H, Y=I
luY=SAdo,X=H 2b R=CH3, X=OH, Y=I
їж Y=OH, X=H le R=CH3, X=H, Y=OTs
2д Y-OH, X=OH 2r R=CH3, X=OH, Y=OTs
В настоящей работе основными химическими объектами исследования были фосфиновые и фосфоновые аналоги аминокислот обмена метионина (la-ж, 2а-д), что определялось значимостью процессов биометилирования в клеточном метаболизме, а также активностью подобных веществ, как антибактериальных агентов, ингибиторов роста
опухолевых клеток и эффективных фунгицидов [4-6]. Энзимологические исследования проводились на ферменте катаболизма метионина - PLP-зависимой L-метионин-у-лиазе, регулирование активности которой рассматривается как перспективное направление дизайна селективных антимикробных агентов [7].
Целью настоящей работы являлось выявление и изучение свойств фосфиновых и фосфоновых аналогов метионина и родственных веществ, определяющих особенности их химического поведения и взаимодействия с биологическими объектами на примере L-метионин-у-лиазы и клеток Citrobacter intermedins - продуцента этого фермента
В соответствии с целью и задачами исследования в Литературном обзоре обсуждаются основные реакции метаболизма метионина и S-аденозилметионина (Met(Ado)) и некоторые способы их химического регулирования. Особое внимание уделено рассмотрению свойств микробной PLP-зависимой L-метионин-у-лиазы и обсуждению возможностей использования фосфорорганических аналогов серосодержащих аминокислот для воздействия на метионин- и Met(Ado)-зависимые процессы.
Постановка задачи и результаты исследования являются приоритетными, их научная новизна и практическая ценность состоит в следующем:
Найдены и исследованы новые свойства фосфорорганических аналогов S-аденозилметионина - эффективных биорегуляторов Met(Ado)-зависимых процессов. Разработан оригинальный способ получения фосфинового и фосфонового аналогов гомосерина из фосфорорганических аналогов S-метилметионина.
Найдено, что фосфорорганические аналоги метионина эффективно связываются с PLP-зависимой L-метионин-у-лиазой и являются конкурентными ингибиторами фермента. Показано, что фосфиновые
аналоги метионина и гомосерина претерпевают медленные субстратные превращения под действием фермента в фосфиновый аналог кетобутирата. Установлено, что стереохимия ферментативной реакции сохраняется в случае фосфиновых аналогов аминокислот. Исследованы спектральные свойства комплексов фосфинового и фосфонового аналогов метионина с L-метионин-у-лиазой.
Для фосфинового аналога метионина исследована рН-зависимость кинетических параметров реакции а,у-элиминирования. Установлено, что форма зависимости и оптимальные значения рН для ферментативной реакции сохраняются при переходе от природного субстрата к его фосфиновому аналогу.
Предложен химико-энзимологический метод синтеза оптически активных фосфиновых аналогов серосодержащих аминокислот.
Впервые показано, что фосфиновый аналог метионина способен индуцировать биосинтез L-метионин-у-лиазы в клетках С. intermedins подобно природной аминокислоте.
Проведенные исследования демонстрируют перспективность использования аналогов для тонкого химического регулирования обмена серосодержащих аминокислот и представляют интерес для изучения механизма действия PLP-зависимых ферментов, выяснения зависимости каталитических свойств от строения и кислотно-основных свойств ионизируемых групп субстрата,
Отдельные части диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской эшимологии» (Москва, Россия, 2002), на 3-м съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2002), на 5-й международной Школе-конференции «Green Chemistry» (Венеция, Италия, 2002).
Другие Ме1(Аёо)-зависимые процессы
Около 95% от общего содержания Met(Ado) в клетках выступает в качестве донора метильных групп в многочисленных реакциях биометилирования, которые катализируются метилтрансферазами (Схема 2, стадия 2). В них вовлекаются многие классы метаболитов, такие как углеводы, аминокислоты, биогенные амины, стероиды и т.д. Нуклеотиды, сахара, аминокислоты могут метилироваться как таковые, и в составе определенных макромолекул.
На полипептидном уровне метилируются отдельные остатки аминокислот, что оказывает серьезное влияние на формирование молекулы белка и может иметь важное значение для клетки в целом. Бактериальный хемотаксис является примером быстрой обратимой ковалентной модификации, включающей карбоксиметилирование и деметилирование остатков глутамата в белках-рецепторах [12]. Метилирование белков также коррелирует с ростом и дифференцировкой клеток. Например, метилирование фактора элонгации Ти у Escherichia соН, коррелирует с фазой роста бактерий [13].
На уровне полинуклеотидов метилируются углеводы и основания, что лежит в основе модификаций и процессинга нуклеиновых кислот. Метилирование цитозина в ДНК млекопитающих приводит к образованию 5-метилцитозина (тС) [14,15]. Активацию транскрипции некоторых генов связывают с деметилированием определенных последовательностей mCpG [16]. Для целого ряда опухолевых клеток характерно гипометилирование ДНК. Так, в клетках, трансформированных вирусом герпеса, наблюдается снижение уровня метилирования ДНК, несмотря на нормальное содержание ДНК-метилаз [17]. С другой стороны, увеличение экспрессии гена ДНК-метилазы клеток мыши приводит к значительному повышению уровня метилирования ДНК, который сопровождается опухолевой трансформацией [18].
ДНК вирусов обычно не метилированы, однако после интегрирования в геном клетки-хозяина, ДНК вируса подвергается метилированию в определенных участках, что приводит к инактивации транскрипции определенных вирусных генов [19]. В вирусах папилломы метилирование интегрированной ДНК влияет не только на транскрипцию, но и на структуру хроматина [20]. В рибосомной РНК метилируются в основном рибозные фрагменты. Это особенно характерно для эукариот, где на 2 -ОН группу рибозы приходится 90% всех метильных групп рРНК. Метилированию подвергается РНК-предшественник в процессе созревания до перехода из ядра в цитоплазму [21]. В мРНК в основном метилируется положение 6 аденозина, так что на 1500 оснований РНК приходится один 6-метиладенозин [22]. На 5 -конце мРНК эукариот и некоторых вирусов содержатся специфические структуры - кэпы - N-7 метил гуанозин, связанный 5 - ОН группой с 5 -ОН группой концевого нуклеозида трифосфатным мостиком (кэп 0) [23-25]. 5 -концевые нуклеотиды могут быть метилированы по 2 - ОН положению рибозы (кэпы 1 и 2). Кэповые структуры определяют устойчивость мРНК к действию деградирующих ферментов, играют важную роль в транспорте мРНК из ядра, трансляции, сплайсинге и инициации транскрипции клеточных и вирусных РНК. Наибольшее количество метильных нуклеотидов приходится на транспортные РНК. Структурные и функциональные индивидуальности тРНК обусловлены как специфической нуклеотидной последовательностью, так и количеством и характером модификаций нуклеозидов. В суммарной тРНК из различных источников было найдено около 30 различных метилированных нуклеозидов, среди которых наиболее часто встречаются 5-метилуридин, 7-метилгуанозин, 2-метиладенозин и 2 -о-метилгуанозин [26,27]. Метилированные нуклеозиды играют важную роль в функционировании тРНК, в частности, во взаимодействии с аминоацил-тРНК-синтетазами, в кодон-антикодоновых взаимодействиях и связывании с рибосомой [28]. Известно, что в злокачественных клетках скорость метилирования тРНК значительно выше, чем в нормальных, что коррелирует с увеличением концентрации Met(Ado) в трансформированных клетках [29,30]. Например, в клетках лейкоза мышей концентрация Met(Ado) в два раза выше нормы [31], а содержание Met(Ado) в лейкоцитах больных хроническим миелолейкозом в несколько раз превышает содержание его в лейкоцитах здоровых клеток [32]. Концентрации Hcys(Ado) также отличаются в нормальных и трансформированных клетках [32]. Таким образом, биологические реакции трансметилирования исключительно важны для клеток различных типов и вирусов, что позволяет рассматривать их как перспективную биохимическую мишень для поиска новых противоопухолевых, противовирусных и антибактериальных средств. Нсуз(Агіо)-продукт Met(Ado)-3aBHCHMbix мети л транс феразных реакций является мощным ингибитором метилтрансфераз и оказывает прямое действие на метаболизм Met(Ado) в клетке. Однако, это соединение является является субстратом нескольких разлагающих его ферментов, особенно активных в опухолевых клетках, что значительно снижает его пригодность в качестве ингибитора метилтрансфераз in vivo. Поэтому в качестве ингибиторов метилтрансфераз был предложен ряд структурных аналогов HcysfAdo), среди которых наиболее изучены 5 -дезокси-8-изобутиладенозин (СИБА) [33], 5 -дезокси-(1,4-диамино-4-карбоксибутил)аденозин (синефунгин) [33] и 7-деаза аналог Hcys(Ado) - S-туберцидинилгомоцистеин (STH) [34]. СИБА необратимо тормозит онкогенную трансформацию фибробластов куриных эмбрионов, инфицированных вирусом саркомы Рауса, сильно подавляя при этом репликацию вируса [33]. В мышиных клетках, инфицированных ДНК-содержащим вирусом полиомы, СИБА также эффективно подавляет репликацию вируса и его метилирование [35]. Синефунгин эффективно ингибирует репликацию вируса vaccinia и метилирование вирусной мРНК в инфицированных L-клетках мыши [36], а также тормозит карбоксиметилирование белков в экстрактах тимуса теленка [37]. Однако, все рассмотренные ингибиторы очень плохо проникают в клетки, что сильно ограничивает их использование in vivo.
В качестве ингибиторов метилтранфераз также изучались аналоги Met(Ado), связывание которых с ферментами оказалось плохим [38].
Другой подход к воздействию на реакции биометилирования состоит в ингибировании НсуБ(Аёо)-гидролазы — фермента, катализирующего расщепление Hcys(Ado) до гомоцистеина и аденозина (Схема 2, стадия 5). Торможение этого процесса вызывает повышение внутриклеточного содержания Hcys(Ado) и, как следствие ингибирование Met(Ado)-зависимых реакций метилирования. В качестве ингибиторов Hcys(Ado)-гидролазы был предложен целый ряд аналогов нуклеозидов, среди которых наиболее изучен непланоцин А — циклопентенильный аналог аденозина, проявляющий значительные противоопухолевую и антивирусную активности [39]. Однако, не всегда можно объяснить биологический эффект от воздействия этих соединений влиянием исключительно на реакции биометилирования.
Синтез фосфорорганических аналогов у-замещенных серосодержащих аминокислот
Из этих данных следует, что фосфорорганические аналоги Met(Ado) и Mmet могли, подобно своим карбоновым прототипам, вступать в реакцию циклизации, образуя соответствующие фостоны, хотя и с меньшими скоростями.
Первоначально нами исследовалась стабильность кислоты 1г в условиях, аналогичных опубликованным (рН 7.5 и 37С). Однако, ход разложения аналога 1г проводили по изменению спектра ПМР, поэтому реакция проводилась в дейтерированном калий-фосфатном буфере (pD 7.1, что соответствует рН 7.5). В этих условиях соединение 1г было стабильно в течение нескольких суток, тогда как период полураспада Met(Ado) составлял 28 ч. Кроме того, кислота 1г остается стабильной при многомесячной инкубации ее раствора в D20 при комнатной температуре.
При кипячении в водных растворах при рН 4.5 аналоги 1г и 26 также превосходили Met(Ado) по устойчивости (кн для 1г 0.2 10"3 с"1). Различия были отмечены не только в стабильности исследуемых сульфониевых соединений, но и в путях их превращений. Так, при рН 4.5 среди продуктов распада 1г были обнаружены фосфиновые кислоты 1а, 1в и фосфиновый аналог гомосерина (1ж) (Схема 10), а при рН 7.5 не наблюдалось дополнительного образования аденина и фосфинового аналога S-пентозилметионина. S-метилметионин является более устойчивым соединением, чем Met(Ado), и разлагается с образованием гомосерина и диметилсульфида лишь при нагревании и нейтральных и щелочных растворах (по нашим данным кн 1.65 10"3 с"1 при 100С в 0,5 М NaOH). В этих условиях фосфорорганические аналоги 1е и 2г также оказываются более стабильными (кн 0.3 10"4 с"1 и 1.1 10"4 с"1 соответственно), причем продуктом превращения 1е является в основном вещество 1а (Схема 11), тогда как кислота 2г давала сложную смесь продуктов.
Устойчивость фосфината 1г сопоставима со стабильностью S-аденозилгомоцистеамина, в котором сохранен сульфониевый центр, но отсутствует группа СООН. Поэтому различная устойчивость и пути превращения сульфониевых солей 1г и 1е по сравнению с их карбоновыми прототипами объясняется низкой реакционной способностью кислого фосфорсодержащего фрагмента в реакции внутримолекулярного алкилирования, превращение которого в эфир может быть осуществлено другим способом, например с использованием активации карбодиимидами. Поэтому, разложение соединений 1г и 1е протекает, как распад сульфониевой соли без участия кислотного фрагмента молекул. Устойчивость кислот 26 и 2г может объясняться сходным образом. Таким образом, кислый фосфорсодержащий фрагмент в исследованных аналогах природных сульфониевых соединений способен выполнять «якорную» функцию при связывании с ферментами-мишенями, подобно карбоксильной группе субстратов, отличаясь при этом от последней по реакционноспособности. Это свойство может явиться существенным фактором стабилизации фосфоаналогов, включая устойчивость к действию ферментов катаболизма Met(Ado). Среди фосфорорганических аналогов у-замещенных а-ам иноки слот, фосфиновый аналог гомосерина (1ж) до начала настоящих исследований известен не был. Гомосерин играет важную роль в метаболизме серосодержащих аминокислот, являясь промежуточным соединением биосинтеза метионина из аспартата в клетках растений и микроорганизмов. В этой связи представляется перспективным использование аналогов гомосерина в качестве предшественников аналогов метионина в клетках, а также их применение для исследования ключевых ферментов биосинтеза метионина. Существующие методы получения фосфиновых аналогов аминокислот, оказались, по нашим данным, мало пригодными для синтеза УІ кислоты 1ж. Так, нами было показано, что реакция оксима 3-гидроксипропаналя с Н3Р02 приводила к сложной смеси продуктов, а выход целевого фосфината 1ж составил лишь 1% (Схема 12). Фосфоновый аналог гомосерина (2д) ранее был получен многостадийным синтезом, заключающимся в С-алкилировании N-защищенного аналога глицина [89]. В предыдущей главе было показано, что в условиях образования гомосерина из S-метилметионина (нагревание в водных растворах NaOH) сульфониевые соли 1д и 2в оказались значительно более устойчивыми, чем соответствующее карбоксильное соединение и давали смеси продуктов, в которых были обнаружены продукты деметилирования 1а и 2а, а целевые соединения 1ж и 2д присутствовали в незначительных количествах. Мы нашли, что в среде уксусной кислоты наблюдалась выраженная селективность реакции алкилирования с участием не метальных групп, но у-углеродного остатка фосфинового и фосфонового аналогов S-метилметионина. Оказалось, что превращение иодида Ід в соответствующий ацетат и нагревание его раствора в уксусной кислоте в течении 5 ч. с последующим кислотным гидролизом приводит к кислоте 1ж с выходом 30%, при этом образования эфира фосфиновой кислоты не наблюдалось. Аналогичным образом был получен аналог 2д с выходом 27%. Разложение тозилатов 1е и 2г в уксусной кислоте в присутствии NaOAc с последующим кислотным гидролизом позволило получить целевые аминокислоты 1ж и 2д с выходами 80-85% (Схема 12). Очевидно, реакции протекали через промежуточное образование соответствующих О-ацетилпроизводных (Схема 12).
Энантиоселективный синтез фосфиновых аналогов у-замещенных серосодержащих аминокислот
Амино-З-окси-пропилфосфиновая кислота (1ж). А. К кипящему раствору 33 г (0.5 моля) безводной Н3Р02 в 250 мл Рг ОН в атмосфере N2 прибавили при перемешивании в течение 30 мин. 13.8 г (0.155 моля) оксима 3-гидроксипропаналя и кипятили еще 2 ч. Смесь упарили в вакууме и 1ж выделяли на смоле Dowex (ЇҐ-форма), VKM=200 мл, элюируя 15%-ным водным Рг ОН. После перекристаллизации из водного ЕЮН и высушивания в вакууме над Р2Оэ/КОН получили 215 мг (1%) 1ж, т.пл. 193С. Rt 0.41 (A), Rf 0.17 (Б). Спектр ЯМР Н (D20) 5: 1.88-2.29 (м, 2Н, СН2СН); 3.83-3.95 (т, 2Н, ОСН2); 3.32-3.45 (м, 1Н, СН); 6.92 (д, 1Н, РН, J = 527 Гц). Найдено (%): С, 25.71; Н, 7.14; N, 9.91. C3H)0NO3P. Вычислено (%): С, 25.90; Н, 7.24; N, 10.06.
Б. К раствору 622 мг (2 ммоль) 1д прибавляли раствор 336 мг (2 ммоль) AgOAc в 40 мл воды. Осадок Agl отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в 10 мл АсОН и кипятили с обратным холодильником 5 ч. Реакционную смесь упаривали досуха, остаток растворяли б мл СН3ОН, добавляли 0,4 мл 10 М НС1. Раствор оставляли на ночь при комнатной температуре, затем упаривали в вакууме досуха. Кислоту 1ж выделяли, как описано выше. Фракции, содержащие 1ж упаривали в вакууме досуха, остаток высушивали в вакууме над Р2О5/КОН и получили 45 мг (12%) 1ж, идентичного заведомому образцу, полученному по методу А.
В. Раствор 175 мг (0.5 ммоля) 1е и 68 мг (0.5 ммоля) NaOAc 3H20 в 5мл АсОН кипятили с обратным холодильником 5 ч. Реакционную смесь упарили в вакууме досуха, остаток растворили в 5 мл 5 М НС1 и кипятили 30 мин. Раствор упаривали в вакууме досуха, затем соупарили с Н20 и целевой продукт 1ж выделяли ионообменной хроматографией. После перекристаллизации из водного EtOH и высушивания в вакууме над Р2О5/КОН получили 60 мг (85%) 1ж, идентичного заведомому образцу, полученному по методу А.
1-Амино-З-окси-пропилфосфоновая кислота (2д). А. К раствору 163,5 мг (0,5 ммоль) соли 1д прибавляли раствор 84 мг (0,5 ммоль) AgOAc в 10 мл воды. Осадок Agl отфильтровывали, фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в 5 мл АсОН и кипятили с обратным холодильником 5 ч. Реакционную смесь упаривали досуха, остаток растворяли 3 мл СН3ОН, добавляли 0,1 мл 10 М НС1. Раствор оставляли на ночь при комнатной температуре, затем упаривали в вакууме досуха. Продукт 2д выделяли на смоле Dowex (Н+-форма), Укол=4 мл, элюируя 15%-ным водным Рг ОН. Фракции, содержащие 2д упаривали в вакууме досуха, остаток высушивали в вакууме над Р205/КОН и получили 45 мг (58%) 2д, т.пл. 237С, Rf 0.12 (А), Лг 0.17 (Б). Спектр ЯМР Н (D20) S: 1.92-2.30 (м, 2Н, СЯ2СН); 3.82-3.93 (т, 2Н, ОСН2); 3.41-3.55 (м, 1Н, СН). Найдено (%): С, 22.94; Н, 6.45; N, 8.93. C3H10NO4P. Вычислено (%): С, 23.23; Н, 6.49; N, 9.02. Б. Раствор 185 мг (0.5 ммоля) 2г и 68 мг (0.5 ммоля) NaOAc 3H20 в 5мл АсОН кипятили с обратным холодильником 7 ч. Реакционную смесь обрабатывали и продукт выделяли как описано выше. Получили 62 мг (80%) 2д, идентичного заведомому образцу, полученному по методу А. В. К раствору 278 мг (2 ммоля) фосфиновой кислоты їж в смеси 1 мл конц. НВг и 5 мл EtOH при перемешивании прибавили 0.15 мл Вг2 и перемешивали еще 30 мин. при 20С. Затем к смеси прибавляли пропиленоксид и после 2 ч при +4С отфильтровали осадок и промыли ЕЮН. После перекристаллизации из водного EtOH и высушивания в вакууме над Р205/КОН получили 260 мг (84%) 2д, идентичного заведомому образцу, полученному по методу А.
К суспензии 50 мг (0,36 ммоль) кислоты їж в 2 мл МеОН добавляли 50 мкл 46% HBr/НгО. После растворения осадка к смеси добавляли раствор Вг2 в МеОН до устойчивой слабо-желтой окраски. Реакционную смесь упаривали в вакууме досуха и продукт выделяли на смоле Dowex (Н -форма), VK0J]=12 мл, элюируя 15%-ным водным Рг ОН. Фракции, содержащие продукт упаривали в вакууме досуха, остаток высушивали в вакууме над Р2О5/КОН и получили 44 мг (72%) монометилового эфира соединения 2д, R{ 0.36 (А). Спектр ЯМР lH (D20) 6: 2.22-2.55 (м, 2Н, СЯ2СН); 3.78-3.87 (м, 1Н, СН); 3.98 (д, ЗН, ОСН3, J=10,5 Гц); 4.09-4.20 (м, 2Н, ОСЯ2). 3.5. Взаимодействие фосфорорганических аналогов аминокислот с L-метионин-у-лиазой из С. intermedins и C.freundii.
Клетки С. intermedins AKU-10 выращивали на среде, содержащей (%): (NH4)2S04 - 0,1, MgS047H20 - 0,1, КН2Р04 - 0,34, К2НР04ЗН20 - 2,3, FeS04 - 0,001, пиридоксингидрохлорида - 0,01 и лактата калия - 0,5, L-метионин - 0,2, рН среды 7,0. Культивирование проводили при 30С на качалке в колбах объемом 800 мл, содержащих по 200 мл среды, в темноте в течении 48 ч, в аэробных условиях. Биомассу отделяли центрифугированием и дважды промывали водой.
Частично очищенный препарат L-метионин-у-лиазы получали по следующей методике: полученную биомассу суспендировали в ОДМ калий-фосфатном буфере (рН 8,0), содержащем 10_4М пиридоксальфосфата, 1,3 тМ меркаптоэтанола и разрушали ультразвуком (15-20 кГц) при температуре не выше 5С в течении 20 мин. Гомогенат центрифугировали при 8000g в течении 30 мин. Содержание белка в клеточном экстракте определяли методом Лоури, используя в качестве стандарта яичный альбумин. К экстракту добавляли 5% раствор протаминсульфата в количестве 5% от общего содержания белка, осадок отделяли центрифугированием, супернатант выдерживали при 60С в течение 5 мин и осадок отделяли центрифугированием. Полученный препарат концентрировали ультрафильтрацией и промывали 300 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 8,0), содержащим 10_4М пиридоксальфосфата и 1,3 тМ меркаптоэтанола. Активность измеряли по скорости образования 1-оксобутирата из L-метионина методом Фридемана [100]. За единицу активности L-метионин-у-лиазы принимали такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата (L-метионина) за 1 мин при 30С и концентрации L-метионина 40мМ.
Синтез фосфорорганических аналогов серосодержащих аминокислот
В большинстве опубликованных работ, посвященных получению фосфиновых аналогов аминокислот, рассматривается рацемический синтез, в то время как ассимметрический синтез или методы, основанные на химическом и ферментативном разделении рацемических соединений представлены в литературе лишь отдельными примерами. Так, (R)-изомеры фосфиновых аналогов аланина и фенилаланина (е.е. 46% и 99% соответственно) были получены стереоселекивным алкилированием хирального основания Шиффа на основе (1R, 2R, 5К)-2-гидроксипинан-3-она и этилового эфира аминометил(диэтоксиметил)фосфиновой кислоты метилиодидом и бензил бромидом, причем стереоселективность реакции сильно зависела от строения ал кил галоген ид а [83]. (S)-H (Я)-изомеры ряда 1-аминоалкилфосфиновых кислот, в том числе (S)- и )-1-амино-3-метилтиопропилфосфиновые кислоты (аналоги метионина), получены разделением диастереомерных солей соответствующих N-бензилоксикарбонил производных с (R) или (S)-l-метилбензиламинами [78].
Перспективность использования ферментативных методов для разделения и синтеза хиральных фосфиновых аналогов аминокислот была впервые показана на примере взаимодействия энантиомеров фосфинового аналога тирозина с PLP-зависимой L-тирозин-фенол-лиазой [3]. Так, субстратом реакции а,Р-элиминирования был только (R)- изомер фосфиновой кислоты, конфигурация которого соответствует природному (5)-тирозину. Соответственно, продуктом обратной ферментативной реакции также являлся (Я)-изомер фосфинового аналога тирозина:
Как было сказано в предыдущей главе, фосфинат 1а является субстратом реакции а,у-элиминирования, катализируемой L-метионин-у-лиазой из С. intermedius. На основании этих данных можно было предположить возможность участия кислоты 1а в реакции у-замещения, также катализируемой этим ферментом. Мы установили, что аналог 1а при взаимодействии с бензилтиолом в присутствии клеток С. intermedius, содержащих L-метионин-у-лиазу, превращается в оптически активную 1-амино-3-бензилтиопропилфосфиновую кислоту (Із) с выходом 12%. Полученному соединению была присвоена ( -конфигурация на основании предположения, что стереохимия ферментативного превращения не меняется при переходе от природного субстрата к его фосфиновому аналогу.
Мы исследовали различные условия ферментативного синтеза соединения Із из кислоты 1а и бензилтиола и нашли, что использование вместо бактериальных клеток препарата L-метионин-у-лиазы в качестве биокатализатора позволяет в несколько раз увеличить выход Із (до 45%).
Однако, в силу естественных ограничений эта реакция может быть применена лишь к немногим тиолам. Так, действие L-метионин-у-лиазы на la и бутилтиол приводило лишь к следовым количествам фосфинового аналога S-бутилгомоцистеина. Поэтому выбор бензилтиола в качестве субстрата для реакции у-замещения был наиболее оптимальным, к тому же представлялось возможным получение из кислоты Із неописанного ранее (R)-H30Mepa фосфинового аналога гомоцистеина - исходного соединения для синтеза фосфиновых аналогов различных хиральных S-замещенных серосодержащих аминокислот. Дебензилированием Із действием Na в жидком аммиаке был получен (R)-16, метилированием которого была синтезирована оптически активная кислота 1а, знак и величина угла удельного вращения которой соответствовали (Я)-изомеру 1а, описанному в литературе (Схема 14). Таким образом, полученным оптически активным аминокислотам соответствует (К)-конфигурация, что подтверждает наше предположение о "S сохранении энантиоселективности ферментативной реакции у-замещения и демонстрирует устойчивость фосфиновых аналогов аминокислот к рацемизации под действием Na в жидком аммиаке. Обнаружение биологической активности кислоты 1а в отношении некоторых микроорганизмов и опухолевых клеток стимулирует интерес к исследованию действия фосфинового аналога метионина на клетки различных типов, что, возможно, позволит расширить область использования 1а, как биологически активного соединения и поможет установить биохимические основы его активности. В рамках данного исследования мы начали изучение свойств 1а в отношении клеток С. intermedins в культуре. Грамотрицательные бактерии С. intermedins являются факультативными анаэробами и способны расти на минимальных средах, которые могут содержать, в частности, некоторые аминокислоты в качестве единственных источников углерода и азота [66]. При наличии в среде L-метионина бактерии способны продуцировать L-метионин-у-лиазу. Клетки С. intermedins хорошо растут на среде, содержащей лактат в качестве единственного источника углерода (Рис. 6). Индукционный период продолжается 8-12 ч в зависимости от количества инокулята, логарифмическая фаза роста клеток длится около 9-10 ч. Максимальное значение оптической плотности среды, соответствующее максимальной концентрации клеток, отмечается через 38-40 ч. Добавление к среде L-метионина не приводит к существенному изменению характера кривой роста, однако наблюдается небольшое увеличение концентрации клеток (Рис. 6).
