Введение к работе
Актуальность проблемы. Формирование пигмента меланина в шерсти овец и его ингибирование - весьма сложный комплексный процесс, на течение которого влияет множество факторов. К настоящему времени проведено большое количество исследований, посвященных разработке различных аспектов проблемы депигментации волосяного покрова животных.
Проанализировав ряд работ (Лях C. П. 1981; Oconto Sachiko, 2001), можно прийти к выводу, что абсолютное и относительное количество эумеланиновых и феомеланиновых гранул в волосах, определяющих окраску, следует рассматривать как окончательный результат деятельности меланоцитов и их взаимодействие с кераноцитами.
Фирагут Дж. А. с соавторами (2003) установили, что главные процессы меланогенеза осуществляются в меланоцитах – большая часть факторов, ингибирующих процесс, действует именно на этом этапе. Факторы биохимического и генетического характера, контролирующие количество и качество активных молекул фермента тирозиназы, оказывают прямой эффект на течение меланогенеза. Вероятно, именно эта возможность изменения активности основного фермента реализуется в качестве одного из основных регуляторных механизмов процесса (Farragut J.A.et al., 2003).
По мнению других ученых (Ватти К.В., 2001; Sealy Roger, 2002), премеланосомы, формирующиеся в комплекс Гольджи, имеют специфическую сложную упорядоченную структуру белкового матрикса, листки которого связываются с определенным числом молекул тирозиназы. Нормальное функционирование этих своеобразных органелл, безусловно, контролируется биохимическими факторами и может ингибироваться какими-либо внешними агентами, поступающими в меланоцит.
По данным Prota G. (2005), важным регуляторным механизмом, контролирующим эффективность работы меланоцита, следует считать изменение способности клетки поддерживать внутреннюю стабильную химическую среду (например, концентрацию цистеина или глутитиона). Другие ученые (Махмудов М., 1998; Holstein J. et. al., 1971; Lloyd Tom 2005) установили, что недостаток меди в рационах пигментированных животных ослабляет окраску шерсти. Биосинтез меланина ингибируется также при понижении концентрации в клетке свободного тирозина, при недостаточно высокой концентрации тирозиназы, необходимой либо для быстрого превращения тирозина в ДОФА, либо при увеличении содержания в среде конкурентных веществ, например фенилаланина.
Мы считаем, что для полного выявления факторов, ингибирующих меланогенез шерсти у овец, необходимо исследовать влияние биохимических, молекулярно-клеточных и генетико-селекционных факторов. Большой интерес в качестве объекта для подобных исследований меланогенеза представляет таджикская порода овец, так как селекционировалась она по шерстной продуктивности, что привело к глубоким преобразованиям характера волосяного покрова, формированию новых свойств волосяных фолликулов. Так, при достижении овцами 8-9-месячного возраста в волосяных фолликулах (около 96%) шерстного покрова синтез пигмента меланина приостанавливается.
Одним из подходов изучения природы факторов, контролирующих ингибирование меланогенеза, является комплексное исследование биохимических механизмов блока пролиферации в меланоцитах. Клетки меланосом приобретают свойства, терминальной дифференцированности, когда определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процессы меланогенеза, прекращают свою функцию, но деление клеток меланосом не прекращается, то есть синтез ДНК протекает нормально.
Согласно нашей гипотезе, сульфгидрильные соединения (глутитион и цистеин) подавляют активность тирозиназы, так как связывают медь, активирующую этот фермент. Поэтому изменения концентрации SH-групп в среде (в цитоплазме меланоцита) оказывают непосредственное влияние на течение меланогенеза. Этот механизм действует при самых разнообразных обстоятельствах, либо ингибируя, либо интенсифицируя меланогенез. Наблюдаемое в волосяных фолликулах ягнят таджикской породы в течение первых недель-месяцев постнатального онтогенеза почти полное ингибирование меланогенеза обусловлено возрастанием концентрации в крови и тканях сульфгидрильных групп, вследствие увеличения интенсивности роста пуховых и переходных волокон.
Цель исследования. Целью данной работы является комплексное изучение, и выявление регуляторных механизмов меланогенеза шерсти у овец, то есть выявление влияния биохимических, молекулярно-клеточных факторов, ингибирующих меланогенеза и разработка селекционно-генетических методов отбора высокопродуктивных животных.
Конкретные задачи исследования
1. Исследовать блок репликации в клетках меланосомы методом клеточной гибридизации, выяснить зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах гетерокарионах от пролиферативного потенциала клеток-партнеров и от наличия в них активных онкогенов.
2. Разработать имитацию с помощью вычислительных экспериментов ряда этапов меланогенеза и углубить понимание биохимических механизмов ингибирования пигментации шерсти и его генетического контроля.
3. Изучить некоторые биохимические характеристики депигментации шерсти у ягнят таджикской и гиссарской пород овец, различных генотипов и окрасок. Разработать более целостную картину реализации генотипа и становления фенотипа, дать характеристику более широкому спектру окрасок, изучить взаимодействие генов, контролирующих депигментацию, с генами, определяющими высокую шерстную продуктивность таджикской породы овец.
4. Оценить в производственных условиях генетико-селекционным методом влияние внешних условий, кормления и содержания на характер наследования генов и генотипа баранов-производителей, имеющих более светлую окраску шерстного покрова, на качество шерсти потомства.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Впервые выявлена белковая природа факторов, подавляющих меланогенеза шерсти у овец, и установлено, что эти белки локализованы в цитоплазме клетки.
2 Установлен новый механизм транспортирования меланосом, реализирующихся в процессе методического деления пигментных клеток.
3. Разработан клеточный механизм регуляции процесса меланогенеза у овец и установлены биохимические основы процесса ингибирования меланогенеза.
4. Выявлена зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы от пролиферативного потенциала клеток партнера и от наличия в них активных онкогенов.
5.Выявлен комплекс новых биохимических характеристик пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах.
6. Установлен ранее неизвестный тип меланогенеза, при котором синтезируются оба типа пигмента эу- и феомеланина, обладающие промежуточными свойствами.
7. Обоснована в натурных и вычислительных экспериментах гипотеза об ингибирующем действии на меланогенеза генов, обуславливающих уникальную структуру шерстного покрова.
8. Обнаружено ингибирующее действие на меланогенеза генов, определяющих уникальную структуру, густоту и скорость роста шерсти у овец полугрубого типа.
9. Установлена степень депигментации шерсти у овец в зависимости от окраски ягнят при рождении. Чем светлее покров, тем раньше у ягнят начинается депигментация шерсти.
Научная новизна работы. Впервые проведены комплексные исследования биохимических, молекулярно-клеточных и генетико-селекционных процессов ингибирования меланогенеза, то есть, изучены механизмы депигментации шерстного покрова у овец таджикской породы.
Исследованы биохимические и молекулярно-клеточные основы подавления синтеза пигмента меланина под действием белков-ферментов, основные этапы биохимической и генетической детерминации пигментации шерстного покрова овец. Выявлена белковая природа факторов, подавляющих меланогенеза и установлено, что эти белки локализованы в цитоплазме клетки.
Изучено содержание эумеланина и феомеланина в шерсти овец различных пород и генотипов, блокирующих влияние генов на меланогенеза и обусловливающих высокую шерстную продуктивность, биохимические основы меланогенеза волосяного покрова, молекулярные и клеточные подходы к процессу меланогенеза и оценка баранов по качеству шерсти.
Биохимическими методами установлено, что взаимодействие аллелей генов А и Е обуславливает проявление многочисленных бурой и рыжей окрасок в фенотипе, контролирует формирование смешанного типа меланогенеза, то есть присутствие обоих типов пигмента в различных соотношениях. В то же время, с уменьшением абсолютного количества пигмента эумеланина, наблюдалось возрастание доли феомеланинового компонента. Показано, что у овец широко распространен ранее неизвестный тип меланогенеза, при котором синтезируются оба типа пигмента (эумеланин и феомеланин), обладающие промежуточными свойствами.
Выявлен комплекс биохимических характеристик пигментных клеток и волосяных фолликулов, тесно коррелирующих с содержанием меланина в волосах. Показано, что плавность перехода от темно-бурой окраски к палевой осуществляется вследствие равномерного снижения концентрации меланосом в волосах и изменения их качественных показателей, то есть определяется постепенным повышением эффективности супрессии процесса меланогенеза в результате взаимодействия аллелей генов А и Е.
Дана биохимическая, молекулярно–клеточная, а также генетико-селекционная интерпретация формирования черной, бурой, рыжей и палевой окрасок у полугрубошерстных (таджикских) и грубошерстных (гиссарских) пород овец.
Выявлен новый механизм транспортирования меланосом, реализующихся в процессе митотического деления пигментных клеток, их миграции из зоны сосочка фолликула и включения в формирующиеся волосы. От периода миграции меланобластов в волосяные фолликулы до получения конечного продукта – гранул меланина, локализованных в волосах, путь очень долог и сложен, к тому же контролируется большим числом генов. Эффективность течения процессов на каждой стадии этого пути может ингибироваться многими внутренними и внешними агентами.
Установлен характер линий регрессии и управления множественной регрессией, отражающих эффективность процесса меланогенеза, специфичных для каждого генотипа окраски в волосяных фолликулах, формирующих пуховые, переходные и остевые волосы у ягнят различных фенотипов.
Обнаружено ингибирующее действие на меланогенез генов, определяющих оригинальную структуру, густоту и скорость роста полугрубой шерсти у таджикской породы овец. Рекомендовано несколько вариантов ликвидации пигментированных волокон и генетические методы создания депигментированных стад овец.
Показано, что ингибирование меланогенеза у полугрубошерстных овец таджикской породы происходит в результате преобразования структуры волосяного покрова, то есть в процессе селекции по шерстным характеристикам одна фракция полностью угнетается в результате гиперразвития другой фракции.
Выявлен клеточный механизм регуляции процесса меланогенеза у овец и рекомендованы биохимические методы отбора с целью повышения качества овцеводческой продукции на селекционно-генетической основе. Проведены комплексные исследования по изучению биохимических, генетических и генетико-селекционных основ процесса ингибирования меланогенеза, то есть механизмов депигментации шерстного покрова у овец таджикской породы.
Установлено, что гены-модификаторы, определяющие повышение однородности, густоты, интенсивности и равномерности роста шерсти, ингибируют меланогенез у овец полугрубошерстных пород.
Выявлены биохимический и клеточный механизмы торможения и восстановления активной функции меланоцитов, имеющие фундаментальное значение для разработки новых методов производства полугрубой белой шерсти и повышения шерстной продуктивности в овцеводстве.
Научно-практическое значение работы. Разработанные биохимические, клеточные и генетико-селекционные подходы к изучению механизма ингибирования меланогенеза у полугрубошерстных и грубошерстных овец могут быть широко использованы в овцеводстве с целью повышения эффективности селекции по шерстной продуктивности и получения качественной шерсти для нужд промышленности. Эффективные способы отбора по шерстной продуктивности и производству полугрубой белой шерсти от овец таджикской породы имеют большое практическое значение в рационализации программ при конструировании депигментированных высокопродуктивных пород овец.
Сформулирована и обоснована в натурных и вычислительных экспериментах гипотеза об ингибирующем действии на меланогенез генов, обусловливающих уникальную структуру шерстного покрова и высокую шерстную продуктивность полугрубошерстных пород овец.
Выявлено ранее неизвестное явление - высокая митотическая активность меланоцитов определенных генотипов, локализованных в зоне сосочка волосяного фолликула. Обнаружен до сих пор неизвестный биохимический механизм транспортирования гранул меланина волос, в процессе которого значительная часть пигмента приносится мигрирующими из зоны сосочка меланоцитами. Установлена биохимическая и генетическая детерминированность митотической активности меланоцитов и интенсивность включения пигментных клеток в формирующиеся волосы.
Показана эффективность биохимического метода прогнозирования шерстной продуктивности животных, а также клеточный механизм контроля процесса меланогенеза у овец таджикской породы.
Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что овцы таджикской породы обладают огромными генетически детерминированными возможностями повышения шерстной продуктивности (белой полугрубой шерсти) и являются наиболее перспективными при интенсивной промышленной технологии выращивания животных.
Разработаны рекомендации по максимальному использованию данных потенциальных возможностей, суть которых заключается в создании оптимальных условий кормления и содержания в осенне-зимне-весенний периоды, целенаправленном интенсивном выращивании племенного молодняка и откорме овец.
Публикации, в которых отражены результаты экспериментов и научные разработки, используются в лекциях по курсам «Биохимия», «Генетика», «Генетика с основами биотехнологии», «Актуальные проблемы генетики и селекции животных» в Таджикском аграрном университете, а также во время проведения спецкурса на кафедре биохимии биологического факультета Таджикского национального университета. Опубликованные материалы также могут быть широко использованы для составления методических указаний по изучению биохимии пигментации и разработки рекомендаций по созданию популяций таджикской и других полугрубых пород овец, в шерсти которых полностью отсутствовали бы цветные волокна.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и получили положительную оценку на республиканских научно-теоретических конференциях молодых ученых и специалистов Таджикской ССР (Душанбе, 1985, 1987), на республиканской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Душанбе, 1986), на конференции «Вклад генетики в ускорение научно-технического прогресса в сельском хозяйстве Таджикистана» (Душанбе, 1986), на Х Всесоюзном симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Гродно, 1990), на 5 Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых «Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии» (Рига, 1990); на конференции, посвященной 60-летию зооинженерного факультета ТАУ (Душанбе, 2003), на республиканской конференции биохимиков РТ «Адаптационные аспекты функционирования живых систем» (Душанбе, 2007).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликованы одна монография и 35 научных статей в различных изданиях: «Доклады ВАСХНИЛ» (1987), «Вестник сельскохозяйственной науки» (1989), журнал «Цитология» (1991), журнал «Онтогенез» (1990), журнал «Молекулярная биология» (1991), «Вестник Таджикского национального университета» (2007, 2008), «Вестник сельскохозяйственной академии наук Республики Таджикистан» (2007) журнал «Кишоварз» Таджикского аграрного университета (1998-2007), и других изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 268 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, состоящего из 313 работ, в том числе 128 иностранных авторов. Она содержит 41 рисунков и 35 таблиц.
