Введение к работе
Рост распространенности туберкулеза (ТБ) во многих странах мира является следствием социально-экономических потрясений, распространения ВИЧ-инфекции, а также результатом изменений самого возбудителя, а именно, появления штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, устойчивых ко многим лекарственным препаратам.
Формирование лекарственной устойчивости микобактерий может быть обусловлено различными биохимическими механизмами: (і) снижением проницаемости клеточной стенки для препарата; (іі) усиленным выведение препарата из бактериальной клетки; (ні) ферментативной инактивацией препарата; (iv) модификацией мишени препарата; (у) инактивацией фермента, приводящего антибиотик в активную форму; (vi) повышенной экспрессией белка-мишени лекарственного препарата (Wade et al., 2004). Данные механизмы резистентности к препаратам могут проявляться как в качестве природных свойств бактериальной клетки, так и возникать в результате селективного действия антибактериальных препаратов. Природная устойчивость бактерий к некоторым препаратам не является результатом возникших генетических изменений, в то время как приобретенная резистентность обусловлена генетически, а именно изменением нуклеотидной последовательности бактериальных генов или изменением уровня экспрессии собственных генов. Наиболее частой причиной возникновения устойчивости штаммов микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) к противотуберкулезных препаратам, являются спонтанные мутации бактериальных генов. Однако частота мутаций, связанная с развитием лекарственной резистентности, может различаться в зависимости от географического региона. Для эффективного применения молекулярно-биологических методов ускоренной диагностики лекарственной устойчивости необходимо знать частоту мутаций, связанных с резистентностью к препаратам, в конкретном регионе в данный момент времени.
Помимо лекарственной устойчивости, серьезную угрозу возникновения
эпидемии представляет рост заболеваемости ТБ среди ВИЧ-инфицированных
индивидов, лиц, находящихся в местах лишения свободы, бездомных и мигрантов.
В настоящее время существует достаточное количество работ, посвященных
молекулярно-биологическим исследованиям штаммов микобактерий
туберкулезного комплекса, распространенных в различных регионах России (Kovalev et al., 2005; Surikova et al., 2005; Drobniewski et al., 2005(a); Mokrousov et al., 2008). В большинстве работ изучается генетическое разнообразие штаммов МБТ, циркулирующих среди общей популяции больных ТБ (Kovalev et al., 2005; Surikova et al., 2005; Mokrousov et al., 2008). Незначительное количество работ посвящено изучению особенностей генома штаммов МБТ, распространенных среди заключенных (Kimerling et al., 1999; Toungoussova et al., 2003; Drobniewski et al., 2005(a)). Вместе с тем, молекулярно-биологические особенности штаммов
МБТ, циркулирующих в группах риска, особенно среди таких как ВИЧ-инфицированные и лица БОМЖ, не изучены. Поэтому изучение генетического разнообразия штаммов МБТ, распространенных среди пациентов из групп риска, представляет большой интерес.
Цель и задачи исследования.
Целью исследования является изучение биохимических и молекулярно-биологических особенностей штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных на территории Санкт-Петербурга.
Задачи:
Сформировать коллекцию образцов геномной ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов M.tuberculosis, выявленных среди больных Санкт-Петербурга.
Определить частоту характерных аминокислотных замен, ассоциированных с устойчивостью штаммов микобактерий туберкулезного комплекса к изониазиду, рифампицину и офлоксацину.
Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам, а также обладающих множественной и широкой лекарственной устойчивостью.
Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, выявленных у пациентов из различных групп риска.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Применены современные методы анализа ДНК, для молекулярного типирования штаммов микобактерий туберкулезного комплекса и обнаружения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. Сформирована коллекция образцов геномной ДНК клинических штаммов M.tuberculosis, выявленных среди больных туберкулезом жителей Санкт-Петербурга.
Проведена комплексная биохимическая и молекулярно-биологическая
характеристика лекарственно-устойчивых и чувствительных к
противотуберкулезным препаратам штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Санкт-Петербурге.
Впервые проведено молекулярно-биологическое сравнение штаммов М. tuberculosis, выявленных среди пациентов из различных медико-социальных групп: бездомных, ВИЧ-инфицированных, заключенных и общей популяции жителей Санкт-Петербурга. Продемонстрировано доминирование штаммов М. tuberculosis Beijing во всех исследованных группах изолятов, а также значительное преобладание штаммов семейства Beijing среди пациентов, находящихся в местах лишения свободы.
Детекция мутаций в генах katG и гроВ позволяет с высокой вероятностью предсказывать наличие лекарственной устойчивости петербургских штаммов М. tuberculosis к изониазиду и рифампицину, соответственно.
Результаты работы показали, что мутации в области QRDR гена gyrA обнаруживаются только у 57% офлоксацин-устойчивых изолятов, включенных в исследование. Этот факт демонстрирует относительно невысокую значимость мутаций в гене gyrA для определения лекарственной устойчивости штаммов М. tuberculosis к офлоксацину в Санкт-Петербурге по сравнению с другими регионами.
Результаты работы могут иметь значение для решения ряда прикладных задач современной клинической микробиологии и эпидемиологии туберкулезной инфекции, и являются достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания кандидатной субъединичной вакцины против туберкулеза, а также диагностических тест-систем.
Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнена в рамках финансирования ЧНИУ «Биомедицинский центр» по гранту Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследование в области ВИЧ и туберкулеза» (№ RUB1-7000-ST-08).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на нескольких международных конференциях (4-й Международной конференции по инфекционным заболеваниям в Пекине (Китай) в 2010 г.; 16-й, 18-й и 19-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург (Россия) в 2007, 2009 и 2010 гг., Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва (Россия) в 2009 г., Международной конференции молодых ученых «Ломоносов», Москва (Россия), 2009 г., Конференции по Иммунодиагностике туберкулеза, Вирджиния Бич (США), 2008 г.
Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 11 публикациях (2 статьи в рецензируемых журналах, 1 заявка на изобретение, 8 тезисов и сообщений на конференциях).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 25 рисунков. Состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», который включает 274 источника.
