Введение к работе
"_.,.>-,-, ji ':.'.-v:l:'.їмуальность проблемы. Расшифровка механизма бактериальной биолюминесценции представляет большой научный интерес как в связи о необычайной эффективностью трансформации люциферазой химической энергии п световую, так и в связи с тем, что фермент представляет собой идеальную модель для исследования свойств монооксигеназ.
В настоящее время отсутствует единая точка зрения на механизм катализируемой бактериальной люциферазой реакции (Данилов, Егоров, 1990; Ghiola et al., 1987; Hastings et al., 1985Г Lee et ai., 1990). Связано это с нерешенностью целого ряда узловых моментов, в частности, вопроса о механизме взаимодействия фермента с алифатическими лигвндами - субстратами и ингибиторами.
В основе многих концепций функционирования люциферазы лежит предположение о том, что в условиях инициированной ишнг реакции фермент способен совершать только один оборот. При этом кинетика биолюминесценции может быть описана простой экспоненциальной зависимостью (Hastings, aibeon, 1963). Обоснованность подобных выводов, однако, вызывает серьезные сомнения.
Большинство исследователей либо вообще не рассматривает механизм связывания альдегидного субстрата в активном центре фермента, либо, вслед за Гастингсом и соавторами (Hastings et al., 1985), полагает, что связывание альдегида происходит путем образования 4а-пероксиполуацеталя с находящимся в комплексе с люциферазой 4а-гидропероксифлавином. В рамках последней модели объяснить конкурентный до отношению к альдегиду характер ингибирования люцифоразной реакции целым рядом гидрофобных соединений (Измайлов и др., 1981; Adey et al., 1976; Holzman, Baldwin, 1981; Yoehida, Nakamura, 1974) не представляется возможным. Таким образом, получение достоверных сведений о МЄХШШЯМ9 взаимодействия люциферязн с различными алифатическими
- г -
лигандами является несомненно актуальним.
В настоящее время биолшинесцентные мотода находят широкое применение в анализе различных биологически активных соединений, ферментов и метаболитов, что обусловлено их высокой чувствительностью, вкопрессностыо, простотой. В этой связи актуальной представляется задача расширения возмохностей биолюминесцонтного метода в анализе различных ферментов, особенно имеющих клинико-диагностическое значение, как, например, моноамшюоксидаза (МАО).
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение новых дашшх о механизме взаимодействия бактериальной люциферазы с алифатическими лигандами - субстратами (альдегидами) и ингибиторами (аминами), а'также разработка биолюминесцент-ного метода определения активности МАО, способной катализировать окисление длинноцепочечних аминов в соответствупцие альдегиды. В процессе работы в наши задачи входило:
I). исследование кинетики биолюминесценции в инициировашюй фотовосствновленным флавином реакции бактериальной люциферазы о различными алифатическими альдегидами;
2). проведение ингибиторного анализа люциферазной реакции с использованием алифатических длишюцепочечных первичных аминов;
3). анализ функциональных параметров сопряженной системы МАО - люцифераза;
4). создание на основе бактериальной люциферазы высокочувствительной аналитической системы для определения активности МАО в различных биологических образцах.
Научная новизна роботы. Впервые показано, что в стандартных условиях с различными альдегидами в качостве субстрата кинетика биолюминесценции в реакции с фотовосстановлешшм' флавином не описывается простой вкспонентой. Сделан вывод о том, что в
условиях инициированной fmnh2 биолюминесцентной реакции фермент способен совершать каталитический цикл многократно, утилизируя в качества субстрата различные формы флавина.
Обнаружен новый класс высокоэффективных ингибиторов лщифврвзы (алифатические первичные еминн) с конкурентным по отношению к альдегиду и неконкурентным по отношении к флавину механизмом действия. Приведены доказательства в пользу возможного участия гидрофобных и электростатических взаимодействий в образовании нековэлентного кошлекса фермента с алифатическими лигандачи.
Проведен кинетический анализ сопряяекной система МАО -люцифераза при отличном от стандартного сооткошошш активностей анализируемого п вспомогательного ферментов, и показана принципиальная возможность использования одного из параметров люминесцентной реакции (начальная скорость нарастания биолюминесценции) для определения активности анализируемого фермента в условиях, когда активность вспомогательного фермента является скоростьлимитарующим фактором.
Практическое значение работы. Практическую значимость имеют сфордулированные в работе новые принципы' организации биосэнсоров на основе ЛЕЦифераз как бактериального, так и иного происхокдения. ' Использование бйолкминесцвнтных систем в количествах, лимитирующих скорость цепочки сопряяешшх реакций, позволяет значительно снизить стоимость анализа. Результаты проведенного анализа сопрягшнной системы на основе бактериальной люциферазы свидетельствуют о необходимости учета особенностей фермента как мснооксигеназы.
Большое практическое значение имеет разработанный на основе люциферазы V.hsrveyl способ определения активности МАО, превосходящий по чувствительности наиболее эффективные
радиохимические методы и выгодно отличающийся от них экологической безопасностью, простотой и акспрессностыо.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на 18 научной конференции молодых ученых биологического факультета МГУ "Проблемы современной биологии" (Москва, 1987), v Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), III Всесоюзной научной конференции "Проблемы экологии Прибайкалья" (Иркутск, 1988), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), V Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесцвнции (Флоренция, Италия, 1988), Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано, 13 работ, включая I авторское,свидетельство.
Структура и объем работы, диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, еыводов и списка литераторы, содержащего c<.'J^J
