Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Физиологические особенности пищеварения у свиней 12
1.2. Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта свиней 15
1.3. Бактерии рода Bacillus как компоненты нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта свиней 24
1.4. Рационы кормления свиней, направленные на профилактику желудочно-кишечных болезней 31
1.5. Пробиотические препараты, применяемые для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней свиней 38
1.6. Кормовые добавки, используемые в свиноводстве, и методы их приготовления 52
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 59
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 67
3.1. Изыскание компонентов, перспективных для включения в состав пробиотика для поросят-отъемышей 67
3.1.1. Сравнительная характеристика биологической активности культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 67
3.1.2. Изыскание адсорбентов для контактно-сорбционного высушивания пробиотиков 82
3.2. Технология приготовления пробиотика КД-5 85
3.2.1. Приготовление опытных серий КД-5 85
3.2.2. Определение антимикробной активности и безвредности опытных серий КД-5 93
3.2.3. Технология промышленного производства пробиотика КД-5 97
3.3. Контроль качества пробиотика КД-5 109
3.4. Оценка лечебно-профилактической эффективности пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей 113
3.4.1. Влияние изучаемых бацилл в составе пробиотика КД-5 на микрофлору кишечника поросят-отъемышей 117
3.4.2. Оценка влияния пробиотика КД-5 на показатели периферической крови поросят отъемышей 121
3.4.3. Экономические показатели применения КД-5 при откорме поросят-отъемышей 130
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 134
5. ВЫВОДЫ 140
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 141
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 142
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 143
ПРИЛОЖЕНИЯ 164
- Физиологические особенности пищеварения у свиней
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Изыскание компонентов, перспективных для включения в состав пробиотика для поросят-отъемышей
Введение к работе
Желудочно-кишечные болезни поросят различной этиологии по частоте, массовости и величине наносимого экономического ущерба занимают одно из первых мест в нозологическом профиле болезней свиней (1).
Ежегодно желудочно-кишечными болезнями переболевает 55-57 % поросят-отъемышей. Падеж от этих болезней составляет около 30 % от всего павшего поголовья молодняка. При этом среди причин отхода животных основное место занимают болезни, связанные с нарушением деятельности желудочно-кишечного тракта, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора. У переболевших поросят снижается прирост живой массы, что сказывается на их дальнейшем развитии и формировании продуктивных качеств (13, 67, 71).
Широко применяемые для лечения поросят антибиотики, наряду с положительным воздействием на течение и форму болезни, вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикорезистентности у патогенных бактерий, дисбактериозы, аллергические реакции и др. (6).
Использование кормовых антибиотиков породило проблему, когда в результате мутаций патогенная микрофлора, являющаяся типичной и для человека, становится резистентной к антибиотикам и передается от животных к человеку (67).
В последние годы в мире наметилась тенденция на снижение масштабов использования кормовых антибиотиков в рационах животных. В 1999 году в странах Евросоюза и восточной Европы было запрещено использование антибиотиков дойным коровам, так как существовал риск потребления человеком остаточных количеств антибиотиков с сырым молоком. С января 2006 г. в странах Евросоюза было принято решение о запрете использования кормовых антибиотиков для разных видов животных, в том числе и свиней (145).
В настоящее время проблему желудочно-кишечных болезней поросят в ряде стран пытаются решить за счет применения экстрактов растительных масел и пробиотических препаратов. Но применение пробиотиков, на наш взгляд, является принципиальным решением вопроса получения экологически чистых продуктов питания и сохранения природного равновесия в зонах промышленного производства сельхозпродукции (8).
В последние годы все большее значение в качестве альтернативы антибиотиков приобретают пробиотические препараты, применение которых в свиноводстве, является принцип решения проблемы получения экологически чистых продуктов питания (7, 20, 27, 28, 30, 33, 38, 55, 91, 116).
При производстве пробиотиков в состав препарата включается как правило только биомасса живых, антагонистически активных микроорганизмов, а ценные продукты микробного синтеза (ферменты и бактериоцины, не используются, т. к. процесс их выделения и концентрирования является технологически сложным и трудоемким.
Однако отечественными и зарубежными авторами установлено, что лак-тобактерии синтезируют молочную кислоту, лизоцим, ацидофилин и др., би-фидобактерии синтезируют витамины группы В, в частности, никотиновую, фолиевую кислоты, тиамин, биотин, цианокобаламин, а также аминокислоты и белки, обеспечивая их всасывание, a B.subtilis и B.licheniformis вырабатывают более 70 видов ферментов, до 200 видов бактериоцинов, продуцируют факторы роста для нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных, витамины группы В, другие биологически активные вещества.
Поэтому утилизация подобных ценных продуктов микробного синтеза при производстве пробиотиков является, на наш взгляд, нерациональным расходованием биологических ресурсов.
В ветеринарной практике свиноводства наиболее востребованы те лекарственные и профилактические средства, которые задаются с кормом, так как этот способ технологичен и не требует больших трудовых затрат.
С учетом отмеченного, разработка пробиотиков на основе живых, антагонистически активных микроорганизмов и продуктов их микробного синтеза, а также оценка эффективности подобных средств при желудочно-кишечных болезнях поросят является актуальной задачей.
- Цель настоящих исследований - разработка технологии производства пробиотика КД-5 и его применение при откорме поросят-отъемышей.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изыскать компоненты, перспективные для включения в состав пробиотика для поросят - отъемышей.
Определить биологическую активность культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 и их метаболитов в различных соотношениях in vitro и in vivo.
Разработать технологию производства пробиотика КД-5 на основе бацилл и продуктов их микробного синтеза.
Оценить воздействие пробиотика КД-5 на показатели гомеостаза организма поросят-отъемышей.
Определить эффективность применения пробиотика КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.
6. Разработать нормативную документацию на препарат КД-5 для регистрации его на территории РФ. Научная новизна.
Впервые, на основе культур штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, а также их продуктов микробного синтеза, сконструирован пробиотик КД-5 для применения в свиноводстве.
Культуры штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 обладают высокой ферментативной активностью и продуцируют бактериоцины, обуславливающие антагонистическое действие в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих желу-
дочно-кишечные болезни у поросят-отъемышей.
Установлено, что в процессе культивирования B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 в смеси с энтеротоксигенными микроорганизми образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеро-токсинов (КФБЭ), представляющий собой смесь пептидогликанов и липо-полисахаридов. Комплекс КФБЭ адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.
Показано, что пробиотик КД-5, содержащий в своем составе биомассу B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, а также их метаболиты в соотношении 1:1, обладает уникальными биологическими свойствами, отличающими его от других пробиотиков: подавление размножения сальмонелл, кандид, стафилококков и стимуляция роста лактобацилл и бифидобактерий in vitro и в желудочно-кишечном тракте поросят-отъемышей.
Разработана технология промышленного производства пробиотика КД-5 с использованием контактно-сорбционного метода высушивания биомассы бацилл и продуктов их микробного синтеза на пшеничных отрубях. Срок хранения препарата составляет не менее 18 месяцев.
Показана высокая (90 - 100%) лечебно-профилактическая эффективность пробиотика КД-5 при гастроэнтеритах поросят-отъемышей.
Выявлено положительное влияние пробиотика на переваримость и эффективность использования организмом поросят-отъемышей питательных веществ препарата, на гематологические, биохимические и иммунологические показатели крови животных. Приросты живой массы поросят-отъемышей возрастают на 40%.
Практическая значимость.
Для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней поросят-отъемышей разработан новый пробиотик КД-5, и промышленная технология его производства.
На базе ООО «НІЖ ЦМВЭИ» (г. Пущино) создана технологическая линия и организовано серийное производство пробиотика КД-5. Получено 3 серии препарата, отвечающие требованиям СТО.
Разработан проект нормативной документации на КД-5 (регламент производства, инструкция по применению, методы контроля качества).
Утверждены в установленном порядке два отчета по испытанию безопасности и антимикробной активности КД-5 и производственных испытаний препарата в условиях свиноводческих хозяйств.
В соответствии с порядком регистрации ветеринарных препаратов в Российской Федерации, нормативная документация, отчеты об испытаниях КД-5 и 3 серии препарата направлены на экспертизу в лабораторию пробио-тиковФГУВГНКИ.
В опытах на поросятах-отъемышах, принадлежащих СПК «Новое Лит-виново» и ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района Московской области, изучен механизм действия пробиотика КД-5; дана оценка влияния биологически активных веществ, синтезируемых B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11, на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных; показана высокая лечебно-профилактическая и экономическая эффективность препарата, при использовании в свиноводстве. Полученные данные подтверждены актами, утвержденными руководителями хозяйств.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ при изучении студентами и слушателями ФПК дисциплин «Ветеринарная микробиология», «Микробиология и иммунология», «Биотехнология».
Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное осуществление исследований по разработке параметров и режимов получения биомассы культур штаммов B.subtilis ТІШ 13 и В.licheniforalis ТГТИ 11, контактно-сорбционного высушивания пробиотика КД-5, определение безвредности препарата на лабораторных животных, испытание лечебно-профилактической эффективности КД-5 в свиноводческих хозяйствах, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, разработка нормативной документации на препарат.
В работе использованы материалы, полученные лично автором. Производственные штаммы B.subtilis ТПИ 13-07.06.21-ДЕПУВГНКИ и B.licheni-formis ТІШ 11-07.06.22-ДЕП/ВГНКИ были предоставлены автором штаммов, профессором Грязневой Т.Н.
Апробирование результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены в 2 отчетах НИР, 3 печатных работах и были доложены:
на международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007);
на 9-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2007»;
- на Международной научно-практической конференции молодых
ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Щелково,
2008).
- на V съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2008).
Материалы диссертации отправлены на соискание премии Президента
Российской Федерации в области науки и инноваций для молодых ученых
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи, в том числе 1 - в научном журнале рекомендованном ВАК, 2 - в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертационной работы. Материалы диссертации изложены на 192 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (201 источник, из которых 61 иностранных авторов). Работа содержит 23 таблицы, 58 рисунков, 28 страниц приложений.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту:
Применение в составе пробиотика КД-5 В. subtilis ТПИ 13 и B.licheni-formis ТПИ 11 и продуктов их микробного синтеза.
Технология приготовления пробиотика КД-5.
Результаты изучения лечебно-профилактической эффективности КД-5 при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.
Физиологические особенности пищеварения у свиней
Свиноводство всегда считалось не только экономически выгодной, но и высокодоходной отраслью, что в значительной степени определяется важными биологическими особенностями организма свиней, которые выгодно отличаются от основных характеристик сельскохозяйственных животных других видов (48).
По данным Антипова В.А. (3), в филогенезе свиньи развиваются как всеядные животные, поэтому пищеварительный тракт их хорошо приспособлен к перевариванию растительных и животных кормов, а по морфофункцио-нальным особенностям пищеварительных органов они занимают промежуточное положение между травоядными с многокамерным желудком и плотоядными. Общий объем желудочно-кишечного тракта у взрослой свиньи составляет 22-30 л, а относительный объем желудка к общему объему пищеварительного тракта равен 30%, тонкого кишечника - 35%. Отношение длины тела к длине кишечника у взрослых свиней 1:21-1:25, а у новорожденных поросят 1:19.
В ротовой полости свиней корм подвергается существенной механической обработке. Тщательность пережевывания зависит от его консистенции. При пережевывании пищи и перемешивании ее со слюной образуется пищевой ком. Значительную роль в его образовании играет муцин слюны, который обволакивает его слизью и тем самым облегчает продвижение корма по пищеводу (4).
По сообщениям Жданова П.И. (38), отличительной особенностью желудочного пищеварения у свиней является слабое перемешивание пищевых масс и послойное расположение корма по мере потребления его животным. Это расстояние, хорошо выраженное при потреблении умеренно увлажненных кормов и при равномерных интервалах между кормлениями, сохраняется несколько часов после приема корма. Но даже при скармливании жидких болтушек при обычной частоте кормлений корм в желудке не смешивается.
Кабанов В.Д. и Ковалев В.Ф. (39, 47), установили, что при даче кормов разной консистенции более плотные порции вытесняют кашицеобразную массу, расположенную вдоль большой кривизны в районе фундальной части желудка, в кардиальную и пилорическую зоны, и быстро подвергаются воздействию желудочного сока. В результате усиливающейся со временем моторики, часть расслоившегося содержимого наполненного желудка постепенно пропитывается желудочным соком. По мере пропитывания содержимого кислым желудочным соком расщепление углеводов замедляется, и начинают преобладать протеолитические процессы.
По данным Куриленко А.Н. (59), особенностью пищеварительного тракта у свиней является то, что пилорический сфинктер у них замыкается не полностью и имеет вид валика, в связи с чем в норме происходит периодический заброс кишечного содержимого в желудок - регургитация, сопровождающийся короткой антиперистальтической волной. Остатки принятого корма обнаруживаются в желудке через 12-15 часов и более. Скорость эвакуации из желудка наибольшая через час после кормления, в дальнейшем она уменьшается. Среднечасовые порции, эвакуированные из желудка, составляют 1000-1100 мл. На скорость эвакуации влияет степень наполнения желудка: чем больше в желудке корма, тем больше его уходит в единицу времени. При потреблении свиньями большой массы корма, а таюке воды и повышения давления в желудке часть пищи может поступить в кишечник уже во время еды.
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в период с 2005 по 2008 г. на кафедрах микробиологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, на базе научно-производственной компании «Центр медико-ветеринарных экологических исследований» (г. Пущино) и в НИИ биоцидов и нанобиотехнологий (г. Москва). Эксперименты на поросятах проводили на свинокомплексах СПК «Новое Литвиново» и ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района, Московской области.
Микроорганизмы. Для приготовления пробиотика КД-5 использовали штаммы В. subtilis ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ и B.licheniformis ТПИ 11-07.06.22-ДЕП/ВГШСИ, депонированные во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ).
Указанные производственные штаммы характеризуются антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и потенциально-патогенных бактерий.
Для определения антагонистической активности бактерий-компонентов пробиотика КД-5 были использованы культуры тест-штаммов, полученные нами из коллекции штаммов кафедры микробиологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ: E.coli 1257, Shigella sonnei 5063, Salmonella typhimurium 55, Staphylo- coccus aureus 209, Candida albicans 690, L.fermentum Ф-36 и B.globosum БФ-4, а также культуры патогенных бактерий E.coli О К88 и S.aureus Н, выделенные от больных животных.
Экспериментальные животные. В опытах по изучению биологических свойств штаммов B.subtillis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 и оценке эффективности пробиотика КД-5 были использованы 60 белых беспородных мышей массой 18-20 г и 80 поросят-отъемышей крупной белой породы в возрасте 35-40 дней.
Материалы, питательные среды, растворы, реактивы. Для выделения и идентификации микроорганизмов использовали питательные среды МПА, МПБ, МРС-2, среды Гаузе № 2, Эндо, Плоскирева, Блаурока, Сабуро, Чапека, Клиглера, Олькеницкого, солевой агар, висмут-сульфит агар, желточно-солевой агар, агар Эндо с желчью, кровяной агар, безбелковые среды Игла и 199, гидролизат-молочная среда.
Изыскание компонентов, перспективных для включения в состав пробиотика для поросят-отъемышей
Для изучения биологической активности культур B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 в сравнительном аспекте определяли их ферментативную и антагонистическую активность в отношении тест-штаммов бактерий, проводили электронно-микроскопический анализ бактерицидного действия изучаемых бацилл на патогенные микроорганизмы.
Культуры В. subtilis ТПИ 13 и В. licheniforrnis ТПИ И выращивали раздельно на МПА в течение 72 часов при температуре 37 С и на безбелковых питательных средах Игла и 199 - в течение 6 суток.
Выросшие на МПА культуры бацилл имели характерные культурально-морфологические и биохимические свойства.
Клетки B.subtilis ТПИ 13 были подвижны, размером (2,6±0,1)х(0,6±0,1), окрашивались грамположительно, имели споры овальной формы, расположенные центрально.
