Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор по проблеме исследований 12
1.1 : Методы получения трансформированных растений . 12
1.2. Краткая характеристика агробактериальных векторных систем 12
1.2.1. Структурно- функциональная организация Ті - плазмид 14
1.2.2. Методы агробактериальной трансформации растений 18
1.3. Методы прямого переноса генов в растения 19
1.4. Селекция трансформированных тканей растений 22
1.5. Экспрессия чужеродных генов и ее регуляция в трансгенных растениях 23
1.6.1. Регенерация растений плодовых культур 24
1.6.2. Агробактериальная трансформация растений плодовых культур 32 1.7. 1. Регенерация растений рода Rubus 35
1.7. 2. Трансформация растений рода Rubus с помощью Agrobacterium
tumefaciens 41
1.8. Генетическая стабильность регенерирующих побегов 43
ГЛАВА II. Методика и условия исследований 46
2.1. Характеристика объекта исследований 50
2.2. Методика трансформации табака 50 2.3 Строение используемых генетических конструкций 52
2.4. Методика получения регенерантов ремонтантной малины 53
2.5. Агробактериальная трансформация листовых эксплантов ремон
тантной малины 56
2.6 Методика выделения ДНК малины 57
2.7. Методика выделения плазмидной ДНК из агробактерии 57
2.8 Условия проведения полимеразной цепной реакции для анализа полученных регенерантов 58
2,9. Методика постановки чашечного теста для определения экспрес сии гена лихеназы 60
2.10 Методика выделения ДНК и РІЖ малины 61
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 63
3.1. Разработка условий регенерации на листовых эксплантах ремонтантной малины 63
3.2. Изучение генетической однородности полученных регенерантов ремонтантной малины 83
3.3. Разработка метода трансформации ремонтантной малины 89
3.3.1 .Освоение методики трансформации на табаке 89
3.3.2. Подбор оптимальных условий агробактириальной трансформации
ремонтантной малины 91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 111
Выводы и практические рекомендации 113
Список использованной литературы 115
- : Методы получения трансформированных растений
- Характеристика объекта исследований
- Разработка условий регенерации на листовых эксплантах ремонтантной малины
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время сильно возрос интерес к методам культуры тканей и клеток. Это связано с увеличением роли клеточных культур в фундаментальных исследованиях и с возможностью применения клеточных технологий в растениеводстве, селекции растений и в генетической инженерии.
Ремонтантные формы малины (Rubus idaens) отличаются способностью формировать урожай на однолетних побегах. Технология их предусматривает осеннее скашивание отплодоносивших побегов, что позволяет решать проблемы зимостойкости, морозоустойчивости и препятствует перезимовке и размножению патогенов и вредителей. Но физиологические особенности развития ремонтантных форм обуславливают крайне низкую способность к вегетативному размножению. Разработка эффективной системы регенерации позволит решить проблемы размножения. А использование методов генетической инженерии может позволить решить ряд других проблем актуальных для ремонтантных форм: повысить вкусовые и технологические качества ягод, скороспелость и продуктивность растений; решить проблему устойчивости к вирусным болезням; создание сортов, устойчивых к экологически чистым гербицидам, позволит существенно снизить трудоемкость возделывания малины.
Для плодовых и ягодных культур возможности генной инженерии используются недостаточно из- за отсутствия эффективных методов регенерации растений из различного рода эксплантов.
Регенерация малины в большинстве работ получена на культуральных средах, где в качестве источника цитокининов использовали 6-бензиламинопурин (6-БАП) (например Упадышев М. Т. и др., 1995). Существуют отдельные сообщения о возможности улучшения регенерации при использовании других типов цитокининов (Fiola J. A. et al., 1990; МШап-Mendoza В. et al., 1999). Однако для малины до сих пор не разработана эффективная универсальная система регенерации и генетической трансформации растений, пригодная для широкого круга генотипов. Регенерационная способность ремонтантных форм малины совсем не изучена. Поэтому работа в данном направлении является актуальной.
Цель исследований: определение оптимальных условий для проявления наибольшего регенерационного потенциала листовых эксплантов ремонтантной малины и подбор условий для генетической трансформации.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА. СПтрвург /-./«.
оэ toolhsrOn «
-Исследовать воздействие различных фитогормонов в системе in vitro и подобрать их оптимальные концентрации для получения побегов - регенерантов-регенерации.
-Изучить влияние внешних условий, типа экспланта, его физиологического состояния на проявление регенерационного потенциала различных генотипов. Проверить с помощью ISSR-PCR наличие генетических изменений в полученных регенератах.
-ВЫЯВИТЬ влияние агробактерии на регенерацию и подобрать оптимальные способы инокуляции листовых эксплантов.
-Подобрать условия для селекции трансформантов с помощью канамицина.
-Получить трансгенные растения малины, содержащие селективные и ре-портерные гены и доказать присутствие вводимых генов в полученных растениях.
Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований установлено:
-Регенерационный потенциал эксплантов малины ремонтантной, полученной с участием межвидовой гибридизации, активно реализуется только в присутствии цитокининов структурного ряда дифенилмочевины, в частности ти-диазурона, а в присутствии 6-БАП (производное аденина) морфогенез практически отсутствует. Другие фитогормоны, ауксины, АБК, существенно не влияют на процессы регенерации из листовых эксплантов.
В полученных регенерантах малины не обнаружено генетических отклонений от исходных форм при анализе методом ISSR-PCR с 9 праймерами, дающими наибольший полиморфизм на изучаемых генотипах ремонтантной малины.
В подобранных условиях стеблевой органогенез на листовых эксплантах малины идет двумя путями- как регенерация из субэпидермальных тканей без видимого каллусообразования (прямая регенерация) и как регенерация из первичного каллуса.
Ингибирующее действие, которое оказывает инокуляция A. tumefaciens при регенерации из листовых эксплантов малины, зависит от способа инокуляции и может быть существенно снижено при включении в регенерационную среду АБК,
При использовании штамма A tumefaciens GANE 7, содержащего ген Ь6, влияющего на регенерацию, наблюдается значительное (полуторакратное) увеличение стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах малины по сравнению с контролем без инокуляции.
Инокуляция A. rhizogenes дикого типа в несколько раз увеличивает процент укоренения у трудноукореняемых форм ремонтантной малины.
Определены селективные концентрации канамицина для использования на этапе регенерации из листовых эксплантов и для селекции полученных реге-нерантов.
Впервые получены трансформанты малины, содержащие экспрессирую-щиеся репортерные гены термостабильной бактериальной лихеназы (lie Б) вместе с геном устойчивости к антибиотику канамицину (nptll).
Практическая значимость работы. Разработанная система регенерации, позволяет получать регенераты широкого спектра генотипов ремонтантной малины, где степень регенерации варьирует от 3,3 до 81 %. В силу отсутствия генетических отклонений эта система может использоваться для ускорения размножения ценных форм ремонтантной малины. Подобранные условия трансформации могут бьпь использованы для введения новых генов как с целью изучения генома и регуляторных элементов экспрессии, так и для придания малине новых хозяйственно ценных признаков.
Апробация результатов работы. Материалы диссертации были представлены на Международных научно-практических конференциях: «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001); «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Харьков, 2003); V съезде общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003) и 4 региональных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов
и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изло
жена на страницах машинописного текста, включая таблиц и рисунков.
Список цитируемых литературных источников включает наименования.
: Методы получения трансформированных растений
Создание трансгенных форм культурных растений с заданными характеристиками требует разработки методов трансформации применительно к изучаемой культуре и используемым сортам. В настоящее время применяются две основные группы методов переноса чужеродных ДНК в клетки растений. В методах первой группы используются векторные системы на основе Т-ДНК агробактериальных Ті- плазмид. Сдерживающим фактором при использовании методов этой группы является ограниченный круг хозяев агробактерии (Лугова Л. А., 2000).
Вторая группа методов использует различные приемы прямого переноса ДНК в растительную клетку, в частности, микроинъекции, электропо-рацию, биолистику и их различные вариации. Для второй группы методов нет ограничений в таксономическом положении растений, однако большинство из них сопряжено с использованием изолированных протопластов растений, что не всегда удобно при получении регенерантов растений (Zieng R. G. et al., 1980; Chourey P. S. et al., 1981; Deka P. С et al., 1976).
Краткая характеристика агробактериальных векторных систем
Болезни неопластической трансформации растений, вызываемые почвенными бактериями Agrobacterium tumefaciens (вызывающие образование «корончатого» галла) и Agrobacterium rhizogenes (вызывающие эффект «бородатого корня»), связаны с переносом в клетки растений и интеграцией в их геном Т-ДНК- специфической экспрессируемой в растениях части агробактериальных Ті- и Ri - плазмид, несущей one гены (Brishbane P. G. et al., 1983; Petersen S. et al., 1989; Глеба Ю; Ю., 1988; Кучук H. В., 1997).
Несмотря на то, что A. tumefaciens и A. rhizogenes сходны, структура их Ті- и Ri- плазмид, а также молекулярные механизмы переноса Т-ДНК в клетки растения и интеграция в растительный геном также близки, физиологические основы заболеваний «корончатый галл» и «бородатый корень» различны. Так, если «корончатые галлы» появляются в результате сверхпродукции трансформированными клетками фитогормонов ауксинов и цитоки-нинов, которая определяется генами Т-ДНК A.tumefaciens (Drummond М: Н.,. et al., 1977; Дрейпер Дж. и др., 1991), то «бородатые корни» образуются, по-видимому, вследствие повышенной чувствительности трансформированных клеток к эндогенным гормонам. Отдельные трансформированные корни, отделенные от «бородатых корней», имеют клональное происхождение и не содержат нетрансформированных клеток в отличие от опухолей, индуцированных A.tumefaciens (Лугова Л. А., 2000). В то же время из этих корней удается получать нормализованные трансформированные растения, сохраняющие в своем геноме гены Т-ДНК Ri- плазмиды (Tepfer D., 1984). Таким образом, активность генов Т-ДНК Ri- плазмид направлена на изменение как содержания фитогормонов в клетках, так и на чувствительность этих клеток к гормональному воздействию (Кучук Н. В., 1997).
Гены Т-ДНК транскрибируются в растительных клетках ферментами растения - хозяина (Чумаков М. И., 2001). Транскрипты генов Т-ДНК поли-аденилированы, кэпированы, т. е. имеют особенности эукариотических матриц. В результате этого процесса в растительных тканях начинается опухолевый рост, который, однажды начавшись, может продолжаться в отсутствие бактерий, а опухолевая ткань способна расти на питательной среде, не содержащей экзогенных ауксинов и цитокининов (Шевелуха В. С. и др.,1998). Опухолевые ткани синтезируют новые для растений производные аминокислот, известные как опины. Тип опина, синтезируемого в опухоли (нопалин, октопин, агроцинопин, маннопин, агропин и др.), зависит от штамма агробактерии, вызвавшего ее образование (Depicker A. et al., 1982; Пирузян Э. С. и др., 1985; Melchers L. S. et al.,. 1990). Бактерии обладают способностью специфически утилизировать опины в качестве источника углерода и. азота. Опины являются не только субстратом катаболизма агробактерии, но и индуктором Ті-плазмид, то есть способствуют распространению этих плазмид в популяции. В связи с этим агробактерии с Ті -и Ri- плазмидами называют «генетическими колонизаторами» (Лутова Л, А., 2000), а их Т-ДНК можно рассматривать как природный вектор для переноса генетической информации из бактериальной клетки в растение.
Трансформации подвергаются не все растительные клетки, а только чувствительные к агробактерии (компетентные). При механическом повреждении растения трансформируются клетки в месте поранения, активно делящиеся и/или метаболизирующие растительные клетки также являются компетентными (Binns А. N. et al., 1988).
Характеристика объекта исследований
Малина - одна из наиболее ценных и популярных ягодных культур. Ее плоды отличаются уникальными, питательными и лечебными свойствами. Прекрасным вкусом и заслуженно считаются эликсиром здоровья и творческого долголетия человека.
Благодаря богатому биохимическому составу ягоды малины успешно используют для профилактики и лечения сердечно- сосудистых, желудочных, простудных и других заболеваний. Малина - скороплодная и урожайная культура. Лучшие ее сорта при хорошем уходе способны продуцировать 4-5 и более кг. ягод с куста или 30-35 т/га. Однако такую урожайность малины в условиях средней полосы России получают крайне редко, так как ни один из выращиваемых сортов не обладает надежной адаптацией к ряду отрицательных факторов внешней среды. Растения малины сильно подмерзают в экс-тримальные зимы, резко снижают продуктивность в жаркие, засушливые периоды вегетации, а вредители и болезни в эпифитотийные годы нередко приводят к полной потере товарного урожая. Кроме того малина - одна из наиболее трудоемких ягодных культур.
Перспективным направлением в решении этой проблемы является создание ремонтантных сортов, плодоносящих на однолетних побегах в конце . лета - начале осени. Сорта такого типа наиболее полно реализуют потенциал своей продуктивности, так как способны избегать отрицательных воздействий внешней среды, в результате односезонного цикла формирования урожая и особой низкозатратной технологии их возделывания (И. В. Казаков, 1999). Суть этой технологии заключается в том, что после уборки созревшего на однолетних побегах урожая и наступления осенних заморозков всю надземную часть малины скашивают косилкой или срезают секатором. С весны еле- дующего года отрастают новые побеги, которые в июле зацветают, а в конце лета - начале осени обильно плодоносят. При наступлении устойчивых осенних заморозков надземную часть растений снова скашивают. Таким образом, ежегодно поддерживается однолетний цикл формирования урожая. Выращивание ремонтантных сортов с подзимним скашиванием растений и полным отказом от использования пестицидов обеспечивает им эколого-технологическую и экономическую привлекательность.
Применение ремонтантных сортов продлевает сезон потребления свежих ягод до первых заморозков, а их выращивание в дополнение к сортам обычного типа (неремонтантные) приводит к; непрерывному поступлению полезного диетического продукта,начиная с половины июня до начала октября. В результате работы селекционеров уже созданы ценные сорта и фор- мы, среди них американские сорта Сентябрьская, Херитейдж, Амити, Ред-винг, Ватсон, Августред, английский - Оттом Близ, швейцарские - Роми и Зева Хербстернт, болгарский сорт Люлин и другие. К сожалению, для полного созревания осеннего урожая большинству зарубежных сортов требуется безморозный период 150-160 дней и сумма активных температур не менее 3000 С. В условиях Брянской области - сумма активных температур 2100-2300С, и потенциальная урожайность этих сортов малины реализуется лишь на 15-20%, поэтому они не представляют практического интереса для возделывания.
Активная работа по созданию сортов малины ремонтантного типа проводится на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.), где собрана многочисленная коллекция ремонтантных сортов и форм. Здесь создан самый крупный в стране гибридный фонд и в 70-х годах получены первые отечественные ремонтантные сорта Бабье лето и Журавлик. Ежегодно из тысяч сеянцев, полученных из семян от межвидовой и внутривидовой гибридизации малины, отбираются генотипы, которые выделились по каким-либо хозяйственно-ценным признакам; по размеру, вкусовым качествам и плотности ягод, по устойчивости к болезням и вредителям, по срокам плодоношения и дружности созревания урожая, по возможности механизированной; уборки урожая, по типу формирования куста и высоте побегов. Таким образом, отобрано более 200 форм, превосходящих по ряду хозяйственно-биологических признаков ремонтантный сорт Бабье лето. Лучшие из этих образцов заслуживают интенсивного использования в селекции, а некоторые - внедрения в производство.
Наряду с ценными технологическими свойствами многие сорта и формы, обладающие высокой степенью ремонтантности (зона плодоношения может достигать 100 % от длины побега), имеют трудности с размножением. Так, ряд ценных отборов сложного межвидового происхождения, включающих геногшазму малины красной, черной, боярышниколистной, душистой,, замечательной и поленики, отличается очень низким коэффициентом размножения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли (Казаков И.В., 1994,1995).
Это свойство является следствием физиологических особенностей ремонтантных форм, у которых метаболизм всего растения направлен на формирование урожая на побегах текущего года, и основной объем ассимилятов потребляется молодыми растущими побегами и развивающимися плодоэле-ментами, поэтому формирование корневых отпрысков резко замедляется; в результате вегетативное размножение ремонтантных форм намного ниже, чем у обычных гибридов.
Эта биологическая особенность выделенных форм ограничивает количество и объем комбинаций скрещивания, затрудняет размножение этих генотипов и, таким образом, значительно удлиняет период от выделения гибрида в элиту до передачи его в сортоиспытание.
Решить проблему размножения генетически ценного материала и ускорить селекционный процесс возможно, применяя метод клонального микроразмножения. Этот метод широко используется на многих плодовых и ягодных культурах, в том числе и на малине, для получения большого количества высококачественного посадочного материала за короткое время (В .А.Высоцкий, 1989).
Основные методы при микроклональном размножении -это активация развития уже существующих меристем или индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями эксгшанта, он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях регенерировать целые растения.
Характеристики некоторых генотипов приведены ниже:
Бабье лето-2 (8-242-1). В кусте насчитывается 4-5 побегов замещения высотой 140-160 см, зона плодоношения занимает 2/3 их длины. Характерна высокая толерантность к основным грибным болезням и устойчивость к малинному клещу. Отличается высоким потешшалом продуктивности (до 4,5 кг ягод с куста), степень его реализации в гидротермических условиях Брянской области составляет 90-100 %. Ягоды легко снимаются с плодоложа, средне крупные (3-3,5 г), широко-тупоконические, малиновой окраски,
Геракл (50-253-1). Куст формируется из 3-4 среднерослых не требующих опоры побегов, образует небольшое количество корневых отпрысков. Растения устойчивы к малинному клещу, дидимелле, антракнозу и септориозу, ягоды слабо поражаются серой гнилью. Потенциал продуктивности (3,5-4,0 кг ягод с куста), реализуется на 60-70 %. Ягоды плотные, усечённо-конической формы, средняя масса первого сбора 6-7 г, максимальная - до 10 г.
14-205-27. Побеги пряморослые. высотой 100-140 см, практически не нуждаются в шпалере. Плодоношение относительно дружное, начинается с третьей декады июля, осенний урожай в условиях средней полосы России составляет 2,0-2,3 кг ягод с куста. Степень реализации потенциала продуктивности до наступления устойчивых осенних заморозков находится в пределах 90-100 %. Ягоды шаровидной формы, тёмно-красные с прочно сцепленными костянками, с едва заметной продольной бороздкой, средняя масса 4 - 4,5 гр.
Оценка вкуса - 4,1 балла. Недостатком является наличие жёстких колючих шипов по всей длине побега.
8-79-2. Отличается ранним созреванием урожая, начало которого приходится на третью декаду июля. Размер ягод от 2,5 до 3,8 г. Плоды правильной конической формы, хорошего десертного вкуса (4,1 балла). Относительно устойчив к основным грибным болезням. Недостаток - низкая побегооб-разовательная способность.
21-232-2. Содержание Сахаров в мякоти ягод составляет 6-7%, растворимых сухих веществ 15-16%, аскорбиновой кислоты 23-25%. Данный отбор является генетическим источником вкуса, повышенного содержания сухих веществ и раннего созревания урожая,
5-253-1. Элитная форма, отличается оптимальными для машинной уборки показателями отделяемости ягод от плодоложа и их плотности, пря-морослым габитусом куста, высокой урожайностью, крупными плодами (4,7 г), 80 % которых успевает созреть до наступления устойчивых осенних заморозков.
Разработка условий регенерации на листовых эксплантах ремонтантной малины
Одним из наиболее перспективных и динамично развивающихся направлений современной; биотехнологии является генетическая инженерия, перед которой поставлена основная цель - создание трансгенных растений, обладающих свойствами и характеристиками, которые трудно поддаются или совсем не поддаются селекции традиционными методами. В последние десятилетия в этой области получены впечатляющие результаты - созданы сорта сои, кукурузы, хлопчатника, рапса и других культур, имеющие высокую и стабильную продуктивность, устойчивость к гербицидам, вредителям и вирусным болезням (Шевелуха B.C. и др., 2000).
Для создания трансгенных растений необходима разработка эффективной системы регенерации растений из тканей и органов растений. При этом крайне важно, чтобы уровень регенерации был достаточно высок для обеспечения большего выхода трансформантов. При агробактериальной; трансформации растений и дальнейшей селекции растительного материала на средах, содержащих антибиотики, выход регенерантов резко падает, поэтому при низком базовом уровне регенерации успех работы по созданию трансформированных растений снижается практически до нуля.. Регенерация растений зависит от генетических особенностей выбранной культуры, сорта или генотипа, исходных органов и тканей, выбранных в качестве эксплантов, их возраста и физиологического состояния, используемых фитогормонов и их синтетических аналогов, концентраций выбранных гормонов, и условий, в которых культивируются экспланты - освещенности, температуры и т.д. На малине ремонтантной подобные исследования не проводились, а на малине сортов с обычным типом плодоношения регенерация наблюдалась лишь на некоторых сортах (Хамукова Ф.Н., 1999).
На начальном этапе проводимой работы было необходимо определить типы используемых для регенерации фитогормонов, их оптимальные концентрации и сочетания, с тем, чтобы на найденной оптимизированной среде проводить последующие эксперименты.
Опыты по подбору оптимального гормонального состава сред для регенерации проводили на сорте Бабье лето-2. В качестве цитокининов использовали 6-бензиламинопурин (6-БАП) в различных концентрациях (табл. 4).
Анализ приведенной таблицы свидетельствует, что наибольшее количество регенерантов удалось получить при концентрации 6-БАП 3 мг/л. Включение в состав регенерационной среды ауксинов не оказывало положительного влияния на проявляемую регенерационную способность. В следующих опытах мы испытывали цитокинины ряда дифенилмочевины, с целью повышения выхода регенерантов (табл. 5). В описываемом опыте использование 6-БАП, было наименее эффективно в сравнении с цитокининами 4-PU и TDZ при стимулировании регенерации побегов.
