Содержание к диссертации
Введение
Закономерности синтеза и аминокислотный состав хитозанов 50
Образование хитозана в гетерогенных условиях 50
Гидразинолиз хитина и хитозана 57
Аминокислотный состав гидролизатов хитозана 59
Особенности получения хитозана в гомогенных условиях 62
Исследование стабильности вязкостных свойств растворов хитозана 72
Исследование внутримолекулярной подвижности хитозана методом спиновых меток 76
Полиэлектролитный эффект в растворах хитозана него хлористоводородной соли; электрохимические и реологические свойства 80
Некоторые физико-химические свойства растворов хлористоводородной соли хитозана 80
Исследование реологических свойств разбавленных и умеренно концентрированных растворов хитозана 86
Молекулярная масса и конформационные характеристики хитозана 94
Гидродинамические и конформационные свойства хитозана 94
Структурные переходы в растворах и пленках хитозана 102
Исследования структурообразования хитозана в растворах методом электронной микроскопии 102
Рентгенографическое изучение пленок хитозана 106
Полимераналогичные превращения хитозана. Биоспецифические и биосорбционные свойства его призводных 114
Статистические процессы расщепления хитозана 114
Частичный кислотный гидролиз хитозана соляной кислотой 115
Деструкция хитозана под действием перекиси водорода 123
Радиационно-химические превращения хитозана 126
Механо-химические превращения хитозана 129
Региоселективная функционализация в цепях хитозана 131
N-Ацилирование хитозана 131
N-Ацилированные производные сульфатов хитозана 138
Особенности частичного дезаминирования хитозана 141
Противовирусная активность хитозана и его производных 145
О-Карбоксиметилирование хитозана 149
Модификация процесса получения N-0-карбоксиметилхитозана 159
Гемостатические ран евые покрытия на основе КМХТ и коллагена 169
О-Сульфатирование хитозана 171
Антикоагулянтная активность сульфатов хитозана 186
Сулъфатированные производные хитозана как ингибиторы ВИЧ- инфекции 188
Исследование соотношения антивирусной и антикоагулянтной активностей сулъфатированнных производных хитозана 195
Исследование связи между структурой и биоспецифическими свойствами сульфатов хитозана 201
Нестехиометричные полиэлектролитные комплексы хитозана 204
Условия образования и свойства полиэлектролитных комплексов хлоргидрата хитозана с декстрансулъфатом натрия 204
Гидродинамические и молекулярные характеристики полиэлектролитных комплексов декстрансульфата натрия и хлоргидрата хитозана 213
Внутримолекулярная подвижность производных хитозана в растворах и комплексах с полиэлектролитами 218
Биоспецифические свойства полиэлектролитных комплексов хитозана 223
Модифицирование поверхности неорганических носителей хитозаном и его производными 227
Некоторые аспекты синтеза ионообменных смол на основе хитина и хитозана 228
Сшивание хитозана гексаметилендиизоцианатом 228
Сшивание хитозана фосфорноватистой кислотой 235
Биоспецифические сорбенты на основе производных хитозана и некоторых ионогенных полисахаридов 241
Модифицированные угольные волокна для сорбции липопротеинов 241
Сорбция липопротеинов сулъфатированными производными хитозана 248
Биотехнологические (биотехнические) аспекты применения хитина и его производных 252
Сорбирующие композиции на основе интермедиатов хитина/хитозана 252
Выделение хитин-белкового конъюгата 252
Сорбционные свойства хитозана и его производных 265
Различные препаративные формы композиций на основе ХБК 269
Порошковые композиции хитозана в качестве агрохимических препаратов 276
Композиции хитозана с янтарной кислотой с его гомологами 276
Биологическая активность хитозана и его производных в отношении фитопатогенов 278
Росторегулирующие свойства композиций хитозана 280
Антигрибные свойства композиций хитозана 283
Некоторые принципы создания композиционных биопрепаратов на основе хитозана 286
Антимикробные свойства хитозана и его композиций 286
Гормон-стимулирующие свойства хитозана 294
Структурные и биологические характеристики агрохимического порошкового препарата «Фитохит» 298
Экспериментальная часть 309
Заключение и выводы 330
Литература 334
Приложение 347
- Образование хитозана в гетерогенных условиях
- Частичный кислотный гидролиз хитозана соляной кислотой
- Внутримолекулярная подвижность производных хитозана в растворах и комплексах с полиэлектролитами
- Структурные и биологические характеристики агрохимического порошкового препарата «Фитохит»
Введение к работе
Актуальность темы.
Диссертационная работа посвящена актуальной проблеме целенаправленного изменения структуры и свойства биополимеров с целью создания необходимых предпосылок для применения в биоматериаловедении и других областях человеческой деятельности с высокими экологическими требованиями.
Хитин второй в мире по распространенности и промышленному освоению биополимер после целлюлозы. В отличие от целлюлозы, хитин является физиологически активным соединением. Как источник биологического азота хитин является экологически благоприятным в растениеводстве органическим удобрением.
Хитин является практически единственным азотсодержащим биополимером, выпускаемым в промышленном масштабе. Однако, из-за плохой податливости к физико-химической модификации, он не находит столь широкого применения, как его растворимое деацетилированное производное-хитозан. Накопленный к настоящему времени огромный фактический материал научно-прикладного характера в области исследования хитина и хитозана позволяет рассматривать их также в качестве потенциально новых экологически безопасных биоразложимых полимеров.
Согласно экспертным данным, предполагаемый объем мирового производства хитина только из морских организмов (напр., ракообразных) составляет 109т/год, что свидетельствует о высокой значимости этой океанской фауны как индустриального источника хитина. Мировое промышленное производство наиболее изученного производного хитина - хитозана составляет несколько тысяч тонн в год.
Хитин, как известно, относится к классу мукополисахаридов, целый ряд представителей которого (гепарин, хондроитинсульфат, гиалуроновая кислота) составляет основу широко известных лекарственных средств и биопрепаратов. В этом аспекте повышенный интерес к себе привлекают также хитин и его производные. Хитин является частью пищи человека (грибы) и пищей для животных (киты). Поэтому не удивительно, что в человеческом и растительном организмах существуют специфические хитинолитические ферменты (лизоцим, хитиназа). Это свидетельствует о том, что хитин не является чужеродным соединением для животного и растительного мира, поэтому, очевидно, нет особой необходимости в обосновании применения его в медицине и растениеводстве.
Уникальный комплекс нативных свойств хитина/хитозана (биосовместимость, биоразложимость и чрезвычайно малая токсичность на фоне высокой биологической и сорбционной активности), а также многообразие практических приложений хитина/хитозана в различных сферах деятельности человека (сельское хозяйство, очистка вод, косметика, биотехнология, медицина и др.) позволяют отнести эти аминополисахариды к немногочисленной группе промышленных экологически безопасных полимерных соединений (ЭБПС) и в перспективе к потенциально новым биоматериалам. Особенностью хитина и хитозана как ЭПБС является то, что они с одинаковым успехом могли бы быть полезны и благоприятны или безвредны как для человека, так и для окружающей его среды.
В связи с этим особую важность приобретает создание необходимых предпосылок для развития наиболее эффективных способов модификации свойств уже известных
биоматериалов, а также разработка различных путей синтеза новых типов потенциально широкопрофильных в биоматериаловедении и экологии соединений на основе хитина/хитозана. Важным решением данной задачи может быть разработка подходов и методов получения базисных соединений в виде стандартных промежуточных продуктов (интермедиатов) реакции хитина/хитозана, которые содержали бы как элементы родоначальной структуры, так и новые функциональные группы. Благодаря этому может быть осуществлен выход к большому разнообразию продуктов на основе хитина/хитозана, максимально удовлетворяющих потребности людей и не причиняющих вреда окружающей среде.
Хитин нерастворим в обычных растворителях, что серьезно ограничивает его практическое применение. Между тем, при достаточно высокой степени деацетилирования хитина полученный прдукт - т.н.хитозан приобретает растворимость в слабокислых водных растворах, однако, последний, в отличие от хитина, уже не разлагается специфическими ферментами. Потеря биоразложимости компенсируется появлением в хитозане полиэлектролитных свойств. Одновременно с этим возникает композиционная неоднородность хитозана вследствие неполного деацетилирования хитина. Положение усугубляется тем, что до настоящего времени для хитозанов не определены четкие структурные признаки и поэтому важной задачей является разработка критериев идентичности хитозанов по различным параметрам, предъявляемым в отношении биоматериалов.
Основной целью работы являлась разработка научно обоснованных подходов и методов синтеза биологически активных производных (биофункционализации) хитина /хитозана контролируемой структуры путем их целенаправленной модификации. Другой целью было изучение связи между отдельными структурными фрагментами и биоспецифическими свойствами полученных соединений. Проблема модификации подобных соединений с тремя различными по реакционной способности центрами взаимодействия состоит в необходимости осознанного выбора путей получения конечных компромиссных структур с полезными биофункциональными свойствами.
Для достижения поставленных целей были разработаны гомофазные варианты некоторых ранее не описанных, а также известных реакций модификации хитозана с обеспечением их региоселективности. Такой подход позволяет проводить ступенчатую модификацию хитозана до образования сначала интермедиата с одними требуемыми свойствами, а затем продолжить модификацию в ином направлении и тем самым получить необходимый комплекс биоспецифических свойств для предполагаемого биоматериала. Таким образом, синтез стандартизованных интермедиатов, предназначенных для дальнейших синтетических превращений, является одной из основных задач химии хитина и хитозана при получении биоматериалов.
Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые разработаны и обобщены основные критерии в оценке биофункциональности производных хитина и хитозана, а также обосновывается возможность получения целевых структур с оптимальными биоспецифическими свойствами на основе интермедиатов хитина/хитозана и их производных, образующихся в результате ограниченной региоселективной модификации в цепях полимера.
Впервые описаны модельные гомогенные условия для некоторых подходящих региоселективных реакций модификации хитина/хитозана, позволяющие получать стандартизованные интермедиаты контролируемой структуры.
Разработаны оригинальные подходы в полимераналогичных реакциях N-ацилирования и N-деацетилирования, а также О-карбоксиметилирования и О-сульфатирования хитозана в гомофазном исполнении.
Впервые описаны условия структурной трансформации макромолекул в растворах хитозана под влиянием акцепторов водородной связи, способствующих стабилизации гидродинамических и реологических свойств растворов полимера.
Определены экспериментально значимые факторы, контролирующие размеры и конформацию частиц хитозана и его полиэлектролитных комплексов в растворах и пленках.
Установлены корреляционные зависимости, связывающие характеристическую вязкость и молекулярную массу для определенных структур хитозана и его карбоксиметильных, а также сернокислых эфиров.
Выявлены некоторые структурно-конфигурационные особенности олигомеров хитозана, определяющие их оптическую активность.
Впервые показана высокая антивирусная активность частично дезаминированного олигохитозана в отношении фитопатогенов.
Найдены основные структурные критерии оценки сульфатированных производных хитозана в качестве высокоэффективных ингибиторов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), антикоагулянтов и селективных липопротеин-связывающих адсорбентов.
Впервые найдены условия получения растворимых форм нестехиометричных полиэлектролитных комплексов гидрохлорида хитозония и декстрансульфата натрия, а также показана возможность контролирования биологических свойств этих поликомплексов путем изменения их состава.
Практическая значимость диссертационной работы.
Разработаны промышленная технология и нормативно-техническая документация процесса получения аминокислотного гидролизата, хитин-белкового комплекса (ХБК) и хитина с использованием ферментных препаратов.
Разработаны практические рекомендации по получению и применению гелевых композиционных материалов на основе ХБК, хитозана и альгината натрия для извлечения тяжелых металлов из морской среды и азотнокислых технологических растворов.
Разработаны принципы создания гемосовместимых энтеросорбентов с иммобилизованными производными сульфатов хитозана и проведены доклинические испытания по избирательной сорбции липопротеинов низкой и очень низкой плотности.
Разработаны научно-технологические основы, нормативно-техническая и сертификационная документация на коллоиднуюформу высокоочищенного хитозана, одобренной Минздравом РФ в качестве биологически активной добавки к пище.
Разработаны технологическая, нормативно-техническая и сертификационная документация на агрохимический препарат «Фитохит», зарегистрированный в Госхимкомиссии РФ в качестве регулятора роста и индуктора болезнеустойчивости растений.
На защиту выносятся:
концепция биофункционализации или направленного изменения
биоспецифических свойств производных хитина/хитозана путем получения бинарных интермедиатов контролируемой структуры, представляющих собой смесь родоначальных и модифицированных звеньев полимеров;
разработанные гомофазные методы получения некоторых производных хитина/хитозана, позволяющие получать стандартизованные интермедиаты как перспективные исходные соединения для разработки биоматериалов и дальнейших синтетических превращений;
способ и условия трансформации структуры и размеров частиц макромолекул хитозана и его полиэлектролитных комплексов;
данные о строении и свойствах собственно биологически активных производных хитозана и его полиэлектролитных комплексов.
Личный вклад автора заключается в формулировании и постановке целей и задач, обосновании путей их решения и непосредственном выполнении экспериментов, анализе и обобщении результатов исследований и медико-биологических испытаний, организации опытно- промышленной апробации разработанных технологических процессов.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложеныуждены на I -III Всесоюзных конференциях по хитину и хитозану (Владивосток, 1983; Мурманск, 1987 и Москва, 1991), XII Всесоюзной конференции по высокомолекулярным соединениям (Алма-Ата, 1985),1 Всесоюзной конференции по интерполимерным комплексам (Москва, 1984), III, IV hVI Международной конференции по хитину и хитозану (Италия, 1985; Норвегия, 1988 и Польша, 1994), III Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1987), I Международной конференции Европейского хитинового общества (Франция, 1995), V и VII Международных конференциях " Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" Москва, 1999 г. и Санкт-Петербург, 2003г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов, методической части, списка литературы (411 наименований) и приложений, включающих акты об испытаниях и другую нормативно-техническую документацию. Основной текст диссертации изложен на 425 страницах, включая 131 рисунок и 107 таблиц. Работа выполнена в лаборатории биополимеров ИНЭОС РАН и группе мукополисахаридов ИПВ РАН, а также при участии ряда других организаций (ИФХМ МЗ РФ, ВНИРО). Теоретические и экспериментальные исследования , результаты которых обобщены в диссертационной работе, проводились в рамках и соответствии с Координационными планами АН СССР и Постановлением правительства СССР (задание "Омега" на 1986-1990 гг.), а также при поддержке Международного научного фонда и Миннауки РФ (гранты N4B300 и N4B000, 1994-1996 гг.).
Образование хитозана в гетерогенных условиях
Гетерогенные условия полимераналогичной реакции деацетилирования хитина являются основной причиной получения структурно незавершенных продуктов. Жесткий режим данной реакции затрудняет стандартизацию параметров процесса, что приводит, как правило, к образованию различных по составу хитозанов с промежуточными свойствами. В связи с этим важное значение имеет поиск менее жестких условий получения хитозанов для контролирования строения образующихся интермедиатов или «структурных изомеров» хитозана и их физико-химических характеристик.
Образование хитозана в гетерогенных условиях.
Как известно [190], в процессе обработки хитина концентрированными растворами щелочей при повышенной температуре происходит отщепление N-ацетильных групп полимера с образованием неполностью деацетилированного и полидисперсного продукта - своеобразного сополимера, т.н. хитозана. Это обусловлено тем, что одновременно с гетерогенной реакцией деацетилирования протекает также и гидролитическое расщепление гликозидных связей хитина так, что с увеличением времени щелочной обработки степень деацетилирования вскоре достигает предельного значения (80 - 85%), а степень деструкции полимера при этом неуклонно повышается.
В ряде работ [195-198], вероятно, с целью упрощения процесса получения хитозана по схеме панцирь —» деминерализация — депротеинирование — хитин — хитозан одну из стадий обработки панциря намеренно опускают, при этом исходным сырьем для получения хитозана является уже не индивидуальный хитин, а его комплекс с белком или минеральным компонентом. Между тем, такой комплекс может определенным образом влиять на ход процесса и свойства полученного продукта. Так, в зависимости от способа депротеинирования хитина (щелочной или ферментативный) и соответственно состава исходного сырья получаются хитозаноподобные продукты с различными значениями вязкости [197, 198].
Выяснение природы происходящих процессов при деацетилировании подобных хитиноидных соединений имеет важное значение, прежде всего, для получения конечного продукта с воспроизводимыми физико-химическими свойствами. С другой стороны, подобный аспект исследования может выявить новые экстремальные характеристики по сравнению с традиционным продуктом. В этом случае в зависимости от предполагаемой области применения хитозана способ его получения можно было бы привязать к определенному сырью и тем самым свести к минимуму невоспроизводимость свойств полученных продуктов.
В данном параграфе описаны результаты исследования особенностей процесса получения хитозана в зависимости от различного содержания белка и минеральных солей в исходном сырье, а также влияния на происходящие процессы таких факторов, как концентрация щелочи, температура и время реакции.
Исследуемые образцы хитина получали из панцирей ракообразных (например, краба, криля и др.), подвергая их в зависимости от поставленной задачи последовательно операциям деминерализации или депротеинирования. Деминерализацию проводили действием на измельченные (до 1 мм) панцири 0,6 н. водного раствора НС1 в весовом соотношении 1: 25 при 25 в течение 3 ч; полученный остаток промывали на фильтре дистиллированной водой до рН 7, ацетоном, эфиром и сушили в вакууме. В том случае, когда для исследования необходимо было неполное удаление из панциря минеральных солей, варьировали концентрацию кислоты, оставляя все остальные условия обработки неизменными. Так, при использовании 0,12 н. НС1 содержание солей в панцире удавалось снизить в 2 раза от 21,7% до 12,8%.
Депротеинирование панцирей проводили в 3 %-ном водном растворе NaOH в весовом соотношении 1: 20 с добавкой 0,3 % додецилсульфата натрия при 25 в течение б ч; полученный остаток промывали на фильтре дистиллированной водой до рН 7, ацетоном, эфиром и сушили в вакууме. В случае неполного удаления белков варьировали продолжительность обработки, оставляя остальные условия неизменными. Полученные образцы хитина с различным содержанием минеральных или белковых веществ переводили в хитозан следующим образом. Предварительно измельченные частицы хитина помещали в четырехгорлую стеклянную колбу из стекла «пирекс», снабженную мешалкой, обратным холодильником, термометром и барботером. В течение 10 мин пропускали аргон ( 60 пузырьков в мин), а затем приливали через фильтр 50%-ный водный раствор NaOH (температура раствора 80) в весовом соотношении 1:15. Смесь перемешивали 5 мин, не прекращая подачу аргона, далее колбу опускали в предварительно нагретую до 170 ± 3 масляную баню. Через 25 - 30 мин в колбе устанавливалась температура кипения смеси 141 ± 1, которую поддерживали в течение 1 ч. После окончания обработки реакционную систему быстро охлаждали в ледяной воде, одновременно добавляя в колбу кусочки льда, при этом подачу аргона не прекращали. По охлаждении содержимого колбы до 80, реакционную массу переносили на фильтр и промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции по фенолфталеину, затем метанолом, эфиром и сушили сначала в эксикаторе под водоструйным насосом, далее в вакууме при 60. При получении хитозана ампульным методом реакционную массу предварительно дегазировали путем многократных операций замораживания - размораживания (не менее 8 раз); две последние операции проводили в атмосфере аргона, очищенного от следов кислорода и влаги. По окончании реакции содержимое ампулы обрабатывали аналогично вышеописанному. Полученный хитозан очищали переосаждением по методике [189]. Вязкость исследуемых образцов измеряли в модифицированном капиллярном вискозиметре Уббелоде при 25 в водном растворе 2 %-ной уксусной кислоты с добавкой 0,2 м. ацетата натрия. Определение констант седиментации образцов проводили при четырех концентрациях с экстраполяцией к бесконечному разбавлению на ультрацентрифуге MOM 3170-Б (ВНР). Степень деацетилирования хитозана а определят по данным титрования на кондуктометре типа ОК102/1 (ВНР) по формуле где М] и М2 - молекулярные массы звеньев хитина и хитозана соответственно г; V и N -объем и нормальность раствора щелочи соответственно в мл и г-экв/л; Р - навеска, г. О количестве белка в образцах хитина судили по содержанию общего азота из данных элементного анализа, а также результатов аминокислотного анализа. Образцы для аминокислотного анализа готовили путем полного кислотного гидролиза 5мг хитина в 5 мл 6 н. НС1 при 105 — 110 в течение 24 ч. По окончании реакции содержимое ампулы промывали на фильтре от смол, фильтрат трижды упаривали с бидистиллатом на роторном испарителе, сушили над щелочью в вакуумном эксикаторе и анализировали на содержание аминокислот на анализаторе AAA 881 (ЧССР).
Известно [199], что содержание основных компонентов в панцирях ракообразных подвержено значительным изменениям в зависимости от вида, а в пределах одного вида также от возраста, пола, времени и места вылова объекта. Очевидно, что без учета вышеуказанных факторов при стандартной методике обработки панцирей практически невозможно получить хитин одинаковой степени чистоты. Это обстоятельство осложняется также тем, что хитин, как известно [200], прочно связан, в том числе ковалентными связями, с сопутствующими ему белковыми веществами.
Для выяснения влияния, в частности, белковых веществ на свойства полученного из такого сырья хитозана нами был получен ряд образцов хитина, различающихся содержанием белка. С этой, целью панцирь предварительно полностью деминерализовали по вышеописанной методике, а затем на стадии депротеинирования, варьируя время обработки, получали образцы с различным количеством белка.
Как видно из рис. 3, основное количество белка (остатков мышечного и панцирного) удачяется при этом за первые 1,5 ч, а к 6 ч обработки содержание общего азота (по данным элементного анализа) составляет 6,9%,. что соответствует теоретическому содержанию азота в индивидуальном хитине. Однако в данном образце качественно по биуретовой реакции был обнаружен белок.
Частичный кислотный гидролиз хитозана соляной кислотой
В последнее время одним из перспективных направлений использования хитозана является создание на его основе биологически активных полимерных соединений с определенными заранее заданными молекулярно-массовыми характеристиками. Обычно при этом исходный полимер предварительно подвергают ограниченному гидролизу с целью дозированного снижения ММ, а затем проводят химическую модификацию полученного продукта [247].
Вследствие этого перспективы применения контролируемого гомогенного гидролиза хитозана гораздо шире благодаря возможности получения при этом широкого спектра полимер-гомологов хитозана. Этому в известной степени способствует статистический характер гидролиза подобных биополимеров с HCI, что дает возможность целенаправленного получения стандартизованных образцов хитозана по ММР. В принципе, получение образцов хитозана с различной ММ можно осуществлять путем щелочного деацетилирования хитина при определенных степенях превращения. Однако, в гетерогенных условиях реакции наряду с уменьшением ММ полимера происходит, как правило, неравномерное отщепление ацетильных групп из различных частей хитина, в связи с чем полученные образцы хитозана будут отличаться также по степени ацетилирования и характеру распределения остаточных ацетамидных групп.
Гомогенный кислотный гидролиз хитозана, очевидно, лишен указанных недостатков. Предположение о повышенной устойчивости хитозана в кислых средах [248] давало основание надеяться на возможность получения образцов полимера в широком диапазоне ММ.
Исследование кислотного гидролиза хитозана представляет интерес не только в прикладном аспекте, но и в плане детализации общей картины гидролиза глюкозаминогликанов в кислых средах. В данных условиях поведение хитозана может иметь свои особенности, поскольку известно, что наличие аминогруппы при втором углеродном атоме пиранозного кольца заметно повышает устойчивость гликозидной связи к кислотному гидролизу, как это наблюдается в случае 2-амино-2-дезокси-3-метил-В-глюкопиранозида [249].
В данном разделе детально описаны закономерности ограниченного кислотного гидролиза хитозана в гомогенной среде в зависимости от ММ полимера, концентрации и природы кислоты, а также температуры и продолжительности реакции.
В работе использовали хитозан, полученный по методике [185] кипячением хитина в 50%-ном водном растворе NaOH в течение 30-60 мин при 140—143 в токе аргона. Характеристическую вязкость образцов хитозана определяли в модифицированном капиллярном вискозиметре Уббелоде при 25 в интервале концентрации полимера 0,01— 0,07 г/дл (для образцов с высокими ММ) и 0,2—1,2 г/дл (для образцов с низкими ММ). Время истечения растворителя для всех использованных сред составляло не менее 100 с. Степень деацетилирования хитозана определяли на основе кривых кондуктометрического титрования на кондуктометре типа ОК 102/1 (ВНР) [185].
Кислотный гидролиз хитозана проводили двумя методами. По ампульному способу навеску полимера (0,5 г) в ампуле на 100 см3 заливали 50 мл 0,67 моль/л дихлоруксусной кислоты и полученный раствор дегазировали путем многократного (не менее 8 раз) замораживания - размораживания. Затем ампулу заполняли аргоном, запаивали и помешали в масляную баню, нагретую до определенной температуры. По окончании реакции содержимое ампулы быстро охлаждали в ледяной воде, раствор выливали в четырехкратный объем дистиллированной воды и при перемешивании по каплям добавляли 0,5 н. NaOH до получения осадка. Сформировавшийся осадок тщательно промывали декантацией водой до отрицательной реакции на фенолфталеин, затем сушили лиофильно и в вакууме при 60 до постоянного веса.
Кислотный гидролиз в соляной кислоте различной концентрации проводили при кипячении (100) в токе аргона в «открытой системе» в колбе с обратным холодильником. Исходную концентрацию хитозана варьировали в пределах 0,2—4,0%. После определенного периода времени пробу раствора, подвергнутого гидролизу, объемом 10 мл разбавляли до 100 мл охлажденной водой, затем рН раствора доводили до 10 прибавлением 1,0 н. NaOH, полученный осадок промывали водой до рН 7, далее метанолом, ацетоном, эфиром и сушили в вакууме при 60 до постоянного веса.
Молекулярно-массовые характеристики гидролизованных образцов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе фирмы «Дюпон» (США) модель 830. Детектирование пиков осуществляли с помощью дифференциального рефрактометра фирмы LDC (США). Разделение проводили на четырех последовательно соединенных колонках (2 мм х 100 см), заполненных сухим способом сорбентом Гликофаза GPC-100 (1 колонка) и GPC-460 (3 колонки) с размером частиц 37-74 мкм. В качестве подвижной фазы использовали 0,2 моль/л ацетатный буфер (рН 4,4), скорость потока 0,8 мл/мин. В инжектор вводили 50 мкл 0,5% пли 1,0%-ного раствора хитозана. Калибровку колонок осуществляли с помощью семи стандартов декстрана серии Т фирмы «Фармация» (Швеция). Молекулярно-массовые характеристики рассчитывали аналогично работам [250, 251].
Расчеты констант скорости и предельной длины не осаждаемых фрагментов полимера L по уравнению (4) (см. ниже) проводили на ЭВМ СМ-4 по составленной нами программе в два этапа. На первом этапе методом «деформируемого многогранника» вычислялось первое приближение оценок параметров уравнения. На втором этапе благодаря линеаризации уравнения по отыскиваемым параметрам методом наименьших квадратов уточнялись оценки параметров, вычислялись доверительные интервалы параметров и целевой функции. Общее число итераций для каждого набора данных -5000 (машинное время составляло40 с.)
Как известно, рост числа разрывов макромолекул может быть достигнут увеличением либо концентрации катализатора-кислоты (при постоянном времени гидролиза), либо продолжительности гидролиза (при постоянной концентрации кислоты). В работе применяли оба способа увеличения числа разрывов, используя для этого дихлоруксусную и соляную кислоты. Применение дихлоруксусной кислоты давало возможность сохранять неизменными вязкостные свойства растворов полимера в данной кислоте в течение длительного времени [189], что существенно облегчало проведение кинетических измерений.
Исследование кинетики гидролиза хитозана проводили в растворе 0,67 моль/л ([Н+]=0,2 г-ион/л) ампульным методом в интервале 55 - 100. Контроль за ходом процесса осуществляли по изменению характеристической вязкости [г\] в системе 2% СНзСООН+0,2 моль/л CHbCOONa [241], а также в 0,02 моль/л НС1. Измерения [п] в последнем растворителе позволяли наблюдать небольшие изменения в полимере в широком температурно-временном интервале (рис. 55).
Предварительными опытами в экстремальных условиях эксперимента было показано, что при варьировании концентрации полимера в дихлоруксусной кислоте от ОД до 2,0% степень снижения [л] при прочих равных условиях практически одинакова, причем в пределах указанного диапазона изменяли на порядок как навеску полимера (при фиксированном объеме), так и объем раствора полимера (при постоянной навеске). Таким образом, можно считать, что в выбранных условиях кислотного гидролиза, по-видимому, отсутствуют диффузионные осложнения, связанные с возможным существованием надмолекулярного порядка в растворах хитозана.
Хорошо известно также, что степень снижения [ті] или ММ полимера в процессе деградации определенным образом зависит от величины исходного ММ и полидисперсности образца, характеризуемой отношением MJM„.
Как видно из таблицы 19, полидисперсность выбранных образцов хитозана близка к двум, что характерно для образцов со статистическим ММР. Это подтверждается и тем, что коэффициент полидисперсности данных образцов, как и следует из теории [191], в пределах погрешностей определения ММ практически не меняется в процессе гидролиза.
Внутримолекулярная подвижность производных хитозана в растворах и комплексах с полиэлектролитами
Как было показано выше, нестехиометричное взаимодействие между противоположно заряженными полимерными молекулами приводит, как правило, к образованию ионогенных ПЭК, растворимых в воде. При этом комплексообразование может сопровождаться компактизацией образующихся частиц [333], приводя к изменению внутримолекулярной подвижности цепей [337]. Целью настоящей работы было определение методом спиновой метки [338] внутримолекулярной подвижности (ВМП) производных хитозана и сопоставление полученных результатов с внутримолекулярной подвижностью исходного хитозана [336], определение ВМП полиэлектролитньгх комплексов, образованных двумя жесткоцепными полимерами: хлоргидрата хитозана (ХГХ) в качестве поликатиона и декстрансульфата натрия (ДСН) или гепарина в качестве полианионов.
В работе использовали два образца ХГХ, полученные из низкомолекулярного (ХГХ-1) и высокомолекулярного (ХГХ-П) хитозана. ХГХ-П, синтезированный по методике [185], имел характеристическую вязкость 3,5 дл/г и Mv=l,5-105. ХГХ-1 получали кислотным гидролизом ХГХ-П в 1 н. НС1 при 100 (5 ч), = 0,57 дл/г и Mv=l,8-104. Сульфат хитозана (СХ) получали по методике, приведенной в работе [299], содержание серы в СХ составляло 15,5%, [г\] = 0,68 дл/г "(в 0,5 М ацетатном буфере с рН 4,5), что соответствует Му=2,5-105.
Методика синтеза спин-меченых образцов приведена в работе [336]. Меченые полимеры переводили в форму хлор гидрата растворением их в 0,2 н. НС1 и осаждением в безводный ацетон. Содержание спиновых меток, определенное методом ЭПР, составляло -1 метку на 65 звеньев.
В качестве полианионов использовали ДСН фирмы «Фармация» (Швеция) с Mw-5-Ю6, содержанием серы 17,4% и гепарин фирмы «Рихтер» (Венгрия).
ПЭК получали смешением растворов компонентов в 4 М водной мочевине при соотношениях (осново-моль/л компонентов исходной смеси) Z=[XrX]: [ДСН]=0,11; 0,17 и 0,33 ([ХГХ]=2 мг/мл, рН 6,5). Здесь параметр ф является соотношением количества всех звеньев реагирующих цепей, независимо от того, несут они или не несут заряженные группы. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре ERS-220 в Х-диапазоне (частота модуляции 100 кГц) при 20.
Для электронно-микроскопических исследований использовали разбавленные (0,001 вес.%) растворы комплексов ХГХ с ДСН, полученные в отсутствие мочевины. Растворы ПЭК состава Z=0,33 и растворы ДСН предварительно очищали, пропуская через фильтр «Миллипор» с порами 22 мкм, затем распыляли с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-2Т при частоте 22 кГц на сетки с коллодиевой подложкой с последующим высушиванием на воздухе при 20, либо замораживанием в жидком азоте и сублимацией льда в вакуумной установке ВУП-4 при -100; в последнем случае образцы оттеняли сплавом платина — палладий и просматривали в электронном микроскопе ЭВМ-100 Л.
На рис.104 представлены спектры ЭПР разбавленных водных растворов ХГХ-1 и ХҐХ-ІІ. Параметры этих спектров (расстояние между крайними экстремумами 1А\{ и соотношение интенсивностей двух компонент спектра 1\11г), измеренные как показано на рис.104, приведены в табл.53. Как видно, 2А\{ для спектров растворов ХГХ-1 и ХГХ-П близки, а отношение 1\/1г больше для низкомолекулярного полимера ХГХ-1. Это означает, что относительное количество участков цепи полимера с высокой молекулярной подвижностью больше в низкомолекулярном полимере, чем в высокомолекулярном [336].
В табл. 53 приведены также параметры спектров ЭПР растворов ХГХ-1 при увеличении концентрации полимера от 0,23 до 3,31 вес.%. Отсутствие зависимости параметров спектров от концентрации полимера свидетельствует о том, что межмакромолекулярные взаимодействия, из-за которых резко возрастает вязкость раствора, не влияют на локальную ВМП в области концентраций до -3 вес.%.
Методика определения сегментальной подвижности спин-меченых макромолекул подробно изложена в работе [338]. В настоящей работе определены времена сегментальных движений тс ХГХ и СХ приблизительно одинаковой ММ при 20 в растворах в 2%-ной уксусной кислоте; вязкость растворителя изменяли добавлением к раствору от 2 до 50 вес.% сахарозы. На рис. 105 представлены спектры ЭПР растворов с разной вязкостью и на рис. 106 рассчитанная из спектров зависимость параметра 2Ац от (77rj )0 8.
Времена сегментальной подвижности, полученные из этих данных, практически совпадают для ХГХ и СХ (тс=15,0 не в водном растворе при 20) и близки к временам, определенным для растворов хитозана в работе [336] (14,5 не при 25). Усиление как основных (в случае ХГХ), так и кислотных (в случае СХ) свойств производных хитозана и связанное с этим распрямление полимерных цепей в растворе, не приводят к существенным изменениям ВМП.
Отметим, что для гибкоцепного полимера — спин-меченого поли-4-винилпиридина наблюдаются иные закономерности: разворачивание полимерной цепи, вызванное увеличением числа зарядов на макромолекуле в результате кватернизации диметилсульфатом, заметно увеличивает хс, т. е. понижает сегментальную подвижность [338].
Рассмотрим, как изменяется ВМП при комплексообразовании с ДСН и гепарином. На рис. 107 представлены спектры ЭПР растворов комплексов ХГХ-І с ДСН в 4 М водном растворе мочевины. Расстояние между крайними экстремумами спектров зависит от состава комплекса и возрастает от 49,2 Гс для раствора ХГХ-1 до 61,6 Гс для комплекса состава Z=0,33. Для определения тс необходимо получить вязкостную зависимость параметра 2Ац. Однако, при добавлении к растворам комплексов сахарозы с целью изменения вязкости растворителя наблюдается осаждение комплексов из раствора, поэтому проводилось лишь качественное рассмотрения изменения подвижности спиновых меток.
Результаты интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в значительной степени зависят от используемой модели [338]. В модели изотропного вращения спиновых меток параметр 2Ац возрастает при увеличении времени корреляции вращения метки. В модели быстрого анизотропного вращения метки предполагается, что усреднение анизотропного СТВ происходит в результате быстрого движения метки относительно сегмента макромолекулы и в результате сегментального движения полимерной цепи [338]. Если та часть анизотропного СТВ, которая усредняется быстрым вращением метки, зависит только от ее химического строения и связи с полимерной цепочкой, то эта часть усреднения одинакова для растворов спин-меченого полимера и для растворов его комплексов. Тогда в рамках модели анизотропного вращения уменьшению подвижности сегментов также соответствует увеличение параметра 2А\\.
Структурные и биологические характеристики агрохимического порошкового препарата «Фитохит»
Как известно, хитозан имеет фибриллярную структуру, которая препятствует его эффективному взаимодействию с другими веществами в различных средах, особенно, в твердой фазе. Поэтому для разрушения надмолекулярной структуры хитозан подвергают измельчению до порошкообразного состояния. В результате подобной механо-химической обработки, очевидно, облегчается введение в активированный полимер других порошкообразных веществ в процессе измельчения. Примером реализации такого совмещения различных биоактивных порошкообразных веществ с предварительно измельченным хитозаном является разработка агрохимического препарата «Фитохит».
Ниже приведены результаты электронно-микроскопического и рентгенографического исследования порошковой композиции «Фитохит».
Исследование микроструктуры данного препарата и его компонентов было проведено в растровом электронном микроскопе S-2500 фирмы Хитачи (Япония). В процессе препарирования образца на его поверхность наносили слой золота толщиной 25 нм с помощью ионного распылителя.
Как показали исследования исходного хитозана, измельченного в виброшаровой мельнице МВ-0,05, образующийся порошок представляет собой полидисперсную волокнистую систему, которая наряду с цельными волокнами содержит фрагменты волокон различной формы и размеров. Размеры подобных разрушенных частиц составляют от 5 до 100 мкм. Как видно из микрофотографий (рис.129), на поверхности частиц измельченного хитозана обнаружены мелкие и крупные поры, в основном, двух типов: узкие трещины вдоль волокна и поры овальной формы (снимок 1) При совмещении в процессе измельчения хитозана с многоосновными кислотами частички последнего адсорбируются, в основном, в трещинах и на поверхности волокон (снимок 2). Дальнейшее внесение в данную композицию биоактивного аддукта БААД приводит к адсорбции его частиц преимущественно в межцепных порах (снимок 3).
На дифрактограмме исходного измельченного хитозана имеется два больших аморфных гало при 10 и 20, а также небольшой пик при 29,5. На диффрактограмме данного образца не обнаружено присутствие узких линий, характерных для кристаллических веществ (рис.130, образец 1). В результате экструзионного совмещения хитозана последовательно с янтарной и глутаминовой кислотами на дифрактограмме полученной композиции (образец 2) на фоне хитозана виден ряд узких линий, принадлежащих кислотам. Предположительно наиболее интенсивные линии соответствуют янтарной кислоте. Аморфная составляющая в образцах 1 и 2 практически идентична, что свидетельствует о сохранности исходного состояния хитозанового каркаса. На дифрактограмме образца 3, представляющего собой комплексное соединение кислотной композиции с биоактивным аддуктом (БААД), появляется пик в районе 28,5 .
На основе сравнения дифрактограмм 3 и 4, где на фоне образца 3 показана дифрактограмма одного БААД, данный пик может быть приписан аддукту БААД (ввиду малого содержания БААД в Фитохите остальные более слабые пики в образце 3 не выявлены).
Оценка фитотоксичности препарата Фитохит.
Оценка проводилась на примере растении огурца в соответствии с методом [403 ], касающимся оценки культуральных жидкостей грибов
Семена огурца сорта Феникс намачивали в растворах препарата Фитохит в течение 4 час. из расчета 1 л рабочего раствора на 1 кг семян. Рабочие растворы готовили путем разведения 10 г препарата в 100, 500, 1000, 1500 мл воды, получая соотношения 1:10, 1:50; 1:100; 1:150. Обработанные семена подсушивали на воздухе, а затем помещали во влажные камеры (стерильные чашки Петри со слоем ваты и фильтровальной бумаги, стандартно увлажненные стерильной водой). В каждую чашку помещали по 20 семян в 6-ти повторностях. Чашки инкубировали в термостате при Т= + 25С. Воздействие препарата оценивали по энергии прорастания и всхожести семян, а также по развитию корней и проростков (табл. 99).
Из данных таблицы 99 следует, что намачивание семян в растворах препарата Фитохит в разведениях: 1:10; 1:50; 1:100; 1:150, в целом, не оказьюает отрицательного действия на прорастание семян огурца, а также развитие корней и проростков, т.е. данный препарат не является фитотоксичным для растений огурца. Можно считать, что наиболее оптимальной концентрацией препарата, положительно сказывающейся на всхожести и развитии проростков огурца, является разведение препарата фитохит 1:100.
Оценка антигрибной активности фитохита в опытах in vitro.
Антигрибную активность препарата Фитохит в разных разведениях (1:10; 1:50; 1:100; 1:150) оценивали в соответствии с методом [404]. В теплую агаризованную среду Чапека вносили такое количество препарата, чтобы получить вышеперечисленные разведения. Питательную среду, содержащую препарат, разливали в стерильные чашки Петри и после застывания на поверхность агара помещали блоки (о!=бмм) из 5-6 суточных чистых культур испытуемых грибов и инкубировали при Т= +25С. Контролем служили чашки со средой без препарата. На 5-е и 10-е сутки инкубации проводили измерение диаметра колоний и по разнице роста в контроле и в вариантах с препаратом по формуле Эббота рассчитывали антигрибную активность препарата:
П=Дк-До/Дкх100, где: П - подавление роста гриба по сравнению с контролем;
Дк - диаметр колоний в контроле;
До - диаметр колоний в опыте.
Данные по антигрибной активности фитохита к фитопатогенным грибам: Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Helminthosporium sativum, Rhizoctonia solani, Pythium sp., приведены в таблице 100.
Из таблицы 100 видно, что препарат Фитохит характеризуется высокой антигрибной активностью к перечисленным патогенам. На 5-е сутки ингибирование роста мицелия грибов составляет от 60,7 до 100%. Такой эффект подавления роста грибов препарат в большинстве случаев сохраняет и на 10-е сутки опыта. При этом, следует отметить, что разведение препарата 1:100 можно считать нижней границей для проявления высокой антигрибной активности Фитохита в проведенных опытах in vitro.
Оценка защитного действия препарата Фитохит против фитопатогенов в опытах in vivo в системе: растение - патоген на овощных и зерновых культурах.
Проведена оценка биологической эффективности Фитохита в лабораторных, вегетационных и полевых условиях на овощных и зерновых культурах. В вегетационных опытах в теплицах ВИЗР изучали влияние обработки семян огурца Фитохитом на поражаемость растений почвенной фузариозной инфекцией (возбудитель F. oxysporum, штамм ЛС, выделенный из пораженных растений огурца).
Опыты проводили на жестком инфекционном фоне. С этой целью инфекцию F. oxysporum выращивали на стерильном зерне в течение 3-х недель. Затем подсушивали, измельчали и вносили в почву одновременно с высевом семян. Инфекционная нагрузка составляла 5г инфекции на 1 кг почвы. Семена огурца сорта Монастырский намачивали в растворах Фитохита в течение 4 час, подсушивали на воздухе и затем высаживали в инфицированную почву. В ходе опыта проводили измерение высоты и учет массы растений, а также оценивали поражение растений корневой гнилью (табл.101).
Из данных таблицы 101 следует, что намачивание семян огурца в растворах Фитохита в течение 4 час. существенно снижает число пораженных растений (в 1,7-2,1 раза). На основании данных таблицы 101, касающихся высоты и массы растений, также наблюдается тенденция ростстимулирующего действия Фитохита.
Наиболее четко ростстимулирующий эффект препарата был выявлен при высеве семян огурца в почву, не содержащую фузариозной инфекции (табл.102).
