Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика объекта исследования 11
1.2. Современные методы исследования генетического полиморфизма растений
1.2.1. Молекулярно-генетический анализ ДНК с помощью RAPD-маркеров 16
1.2.2. Молекулярно-генетический анализ ДНК с помощью ISSR- и SSR маркеров 20
1.2.3. Другие молекулярно-генетические мультилокусные методы анализа полиморфизма растений 26
1.3. Методы паспортизации сортов растений 31
1.4. Маркирование видов и сортов люпина 35
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Исходный материал 39
2.2. Выделение геномной ДНК люпина 39
2.3. Определение качества и количества ДНК 43
2.4. Полимеразная цепная реакция 43
2.5. Электрофоретический анализ ДНК 44
2.6. Обработка результатов генетического анализа 44
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Выбор метода выделения ДНК люпина 46
3.2. Оптимизация условий PCR 50
3.3. Характеристика праймеров для RAPD-и ISSR-PCR 54
3.4. Характеристика полиморфных фрагментов, амплифицируемых при ISSR-PCR 60
3.4.1. Межвидовой полиморфизм
3.4.2. Внутривидовой полиморфизм 62
3.5. Генетическое сходство сортов люпина по ISSR-маркерам 72
3.6. Разработка системы паспортизации сортов люпина 75
3.7. Дихотомический ключ определения сортов люпина 84 Выводы 88 Рекомендации производству 89
Список использованной литературы 90
- Современные методы исследования генетического полиморфизма растений
- Другие молекулярно-генетические мультилокусные методы анализа полиморфизма растений
- Полимеразная цепная реакция
- Характеристика полиморфных фрагментов, амплифицируемых при ISSR-PCR
Введение к работе
Актуальность исследования. В последние десятилетия биотехнологические методы широко используются для проведения исследований в смежных областях науки, в частности, в селекции растений, растениеводстве и семеноводстве (Шевелуха, 2008; Харченко, Глазко, 2009). При этом особое значение имеет разработка современных методов на основе полимеразно-цепной реакции, поскольку метод ПЦР имеет высокую чувствительность, точность и воспроизводимость результатов, скорость и производительность анализа, достаточно прост в исполнении и не требует сложного дорогостоящего оборудования (Сулимова, 2004; Карлов, 2009). ПЦР широко используется в медицине для экспресс-диагностики инфекционных и генетических заболеваний, в исследованиях по филогенетическому анализу разных таксонов животных и растений (Кочиева, 2004; Лукашов, 2009), в генетике и селекции для определения генетического родства сортов разных видов растений (Зайцев, 2001; Нам, 2004), является неотъемлемой частью работ по генетической инженерии (Голденкова, 2003).
Большое значение для современных биотехнологических исследований, а также селекции хозяйственно-ценных культур и семеноводства имеет разработка методов паспортизации сортов растений на основе молекулярных маркеров. Предложенный ранее для анализа генотипов и сортов разных культур метод белковых маркеров (Созинов, 1985; Конарев, 1993) может быть сопряжен с недостаточным полиморфизмом белков, в частности, альбуминов или глобулинов. Для сортовой идентификации некоторых видов растений, в том числе для люпина, метод белковых маркеров оказался непригоден из-за низкого уровня межсортового разнообразия.
Люпин является важной кормовой и сидеральной культурой, характеризуется высоким качеством запасных белков. Для ускорения работ по разработке инновационных биотехнологий создания высокопродуктивных
и устойчивых сортов люпина актуальна разработка метода молекулярных маркеров на основе ДНК и паспортизация сортов и гибридов.
Применение ДНК-маркеров на основе полимеразно-цепной реакции (ISSR-PCR, RAPD-PCR, AFLP, MFLP) позволило расширить возможности для разработки методов молекулярного маркирования с целью паспортизации сортов различных сельскохозяйственных культур, в частности были разработаны молекулярные маркеры хозяйственно-ценных признаков люпина узколистного (Yang, 2004, 2008) и способ идентификации ряда австралийских сортов узколистного люпина (Yuan, 2005). В России подобные исследования на люпине разных видов не проводились.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка метода паспортизации сортов люпина разных видов на основе методов ISSR-PCR и RAPD-PCR.
Для достижения цели решались следующие задачи:
-
выбор метода выделения ДНК из образцов люпина;
-
подбор оптимальных условий проведения ISSR-PCR и RAPD-PCR на ДНК люпина;
-
подбор праймеров, обеспечивающих достаточный полиморфизм и стабильную амплификацию полиморфных фрагментов люпина;
-
изучение генетического полиморфизма сортов, сортообразцов и гибридных форм люпина;
-
составление генетических паспортов сортов люпина узколистного, желтого и белого;
-
изучение генетического сходства сортов и сортообразцов люпина узколистного;
-
разработка схем дихотомического ключа для идентификации сортов люпина по генетическим паспортам. Научная новизна и значимость работы. Впервые разработан метод
паспортизации сортов люпина трех видов на основе ISSR-PCR. Метод
паспортизации сортов люпина включает протокол выделения ДНК, набор праймеров и условия проведения ISSR-PCR. Составлены паспорта сортов трех видов люпина, возделываемых в России, установлено генетическое сходство сортов. Установлены уровни внутривидового разнообразия, степень генетической дифференциации сортов.
Практическая ценность исследований. Полученные в данной работе паспорта сортов люпина белого, желтого и узколистного будут использованы в селекции, а также для поиска маркеров хозяйственно-ценных признаков при разработке биотехнологий получения высокопродуктивных сортов этого ценного растения. Составленные паспорта могут быть использованы при передаче сортов в Госкомиссию и для контроля чистоты посевного материала.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Метод паспортизации сортов трех видов люпина.
-
Паспорта сортов люпина узколистного, желтого и белого.
-
Дихотомический ключ идентификации сортов люпина.
-
Генетическое сходство сортов люпина узколистного.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
были доложены на международной научно-практической конференции
молодых ученых «Теоретические основы применения биотехнологии,
генетики и физиологии растений в современной селекции растений и
растениеводстве» (Брянск, 2009), международной конференции молодых
ученых «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы,
инновационные аспекты в биотехнологии» (Брянск, 2010), III Всероссийском с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-2010» (Нижний Новгород, 2010), международной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Ялта, 2010), VI международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, одна из них в издании, рекомендованном ВАК.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав – обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, и выводов. Список литературы включает 131 источник, в том числе 36 публикаций отечественных авторов и 95 публикаций иностранных авторов. Диссертационная работа изложена на 145 страницах, из которых 105 страниц основного текста и 40 страниц приложений, содержит 18 рисунков и 12 таблиц.
Современные методы исследования генетического полиморфизма растений
Наряду с очевидными достоинствами метод обладает рядом недостатков. Информационная способность отдельных RAPD-праймеров очень низкая, поэтому для полноценных исследований необходимо использовать большое количество праймеров. Этот метод требует тщательной оптимизации для-обеспечения воспроизводимости в разных лабораториях (Penner et al., 1993а; Gillings, 1997). Здесь имеют значение два фактора. Первый заключается в том, что в разных лабораториях получают различные наборы фрагментов ДНК по размерам амшшконов, следовательно, самые большие и самые малые фрагменты не всегда воспроизводятся. Второй фактор: даже если с некоторыми праймерами удается получить стабильные результаты, с другими при тех же условиях это не происходит, при этом не наблюдается заметных различий в протоколах PCR, которые могли бы коррелировать с такими различиями (Penner et al., 1993а). Поэтому метод сложно стандартизировать. В частности, на воспроизводимость реакции влияют качество и концентрация образцов ДНКУ характеристики используемой ДНК-полимеразы, температура отжига, условия проведения электрофореза, а также качество агарозы (Yu, 1992, Jones et al., 1997; Penner et al., 1993a). Воспроизводимость метода в разных лабораториях находится на неудовлетворительном уровне (Jones et al., 1997). Считается, что главную роль в вариабельности результатов играют различные термоциклеры (Penner et al., 1993а).
Jones et al. (1997) в нескольких лабораториях провели ряд экспериментов для проверки воспроизводимости метода. Каждая команда проводила реакцию по своему собственному методу на разных видах. Затем каждая лаборатория пыталась воспроизвести результаты других. При этом обнаружили очень высокий уровень вариабельности. Только 2 профиля из 81 (9x9) были повторены. А воспроизводимость праймеров в этих экспериментах составила лишь 75%.
Полилокусные спектры RAPD-PCR зависят от нуклеотидной последовательности декануклеотида; распределение инвертированных декануклеотидных повторов для отдельных видов и таксонов имеет выраженные таксон-специфичные черты; спектры продуктов амплификации в основном определяются 6 нуклеотидами- на 3 -конце; отмечается широкая изменчивость динамики накопления продуктов амплификации с разных участков генома при одних и тех же условиях PCR (Глазко, 2008).
Существует несколько модификаций! метода RAPD-PCR, разработка которых была направлена на устранение его недостатков. Например, воспроизводимость и эффективность технологии RAPD-PCR можно улучшить использованием пар праймеров по 18-24 нуклеотида. Такая модификация метода называется LP-RAPD (Long primer random amplified polymorphic DNA). Gillings (1997) утверждает, что при использовании этого метода образуется до 30 фрагментов, которые можно разделять стандартными агарозными гелями. Метод позволяет учитывать полосы до 2000 п.н., что невозможно в случае использования RAPD-PCR. Технология обладает хорошей воспроизводимостью, о чем говорят схожие результаты, получаемые на разных термоциклерах.
При использовании RAPD-PCR для выявления межсортового полиморфизма сортов некоторых культур, в частности самоопылителей, наблюдались трудности, связанные с высокой консервативностью генома культуры. Для решения этой проблемы в RAPD-реакциях иногда используют не один, а одновременно два праймера с целью обогащения спектра1 (Кочиева, 1999а; Ни et al., 1995). Так, Ни с соавторами (1995) показано, что использование двухпраймерной системы в RAPD-реакции может значительно увеличить потенциал метода по выявлению полиморфизма. Примерно у половины амплифицируемых фрагментов на концах находятся разные праймеры.
С помощью RAPD-метода были достигнуты существенные успехи в получении различных молекулярно-генетических маркеров для идентификации геномов видов и сортов в исследованиях по эволюции, филогении и таксономии, для создания генетических карт растений, включая такие основные сельскохозяйственные культуры как картофель, пшеница, рис, кукуруза, соя, и др. (Кочиева, 1999а), цветная капуста (Astarini et al., 2004), Oxytropis chankaensis Jurtz. {Fabaceae) (Артюкова, 2004), виды рода Arachis и сорта вида Arachis hypogaea (Raina et al., 2001).
Праймеры для RAPD-PCR могут быть с легкостью генерированы, по сравнению с методом SSR-PCR (этот метод будет рассмотрен ниже). Однако они имеют доминантный характер, а амплифицирующиеся локусы хуже определяются (Langercrantz et al., 1993).
RAPD-анализ был успешно использован для поиска полиморфизмов, связанных с генами устойчивости к заболеваниям у томатов (Martin et al., 1991), овса (Penner et al., 1993b), салата (Michelmore, 1991; Paran et al., 1991), для картирования генома Arabidopsis thaliana (Reiter et al., 1992). Метод RAPD-PCR применяли для маркирования признака устойчивости к коккомикозу вишни (Волосевич, 2007). Исследование, проведенное Вишняковой и др. (2008) выявило, что возможность использования 22 праймеров серии 0РА, OPD, ОРЕ, ОРН, ОРК, OPN (Operon Technologies), эффективно выявляющих полиморфизм представителей Solanaceae, Lemnaceae и Роасеае, для анализа представителей Fabaceae ограничена. Лишь девять из них могли выявить межвидовой полиморфизм и только три праймера были способны выявить внутривидовой полиморфизм генома у анализируемых представителей рода Lathyrus L
RAPD-маркеры все еще применяют для генетического картирования, в селекции животных и растений (Ferreira et al., 2000). Частично они могут быть применены для исследований популяционной генетики. RAPD-маркеры эффективны в исследованиях полиморфизмов, позволяя проводить быструю и эффективную идентификацию хромосом-специфичных фрагментов ДНК.
Другие молекулярно-генетические мультилокусные методы анализа полиморфизма растений
Молекулярно-генетические исследования рода Lupinus большей частью сводились к филогенетическим работам. В них были изучены полиморфизмы нуклеотидных последовательностей некодирующих внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 (Amoche, Bayer, 1999; Amoche et al., 2004), рестрикционных фрагментов хлоропластной ДНК (Badr et al., 1994), хлоропластные rbcL (Kass, Wink, 1997) и trnL- trnT гены (Amoche et al., 2003) и изозимы (Wolko, 1995). Talhinhas et. al. (2003) оценили возможность использования методов AFLP, ISSR, RAPD для изучения межвидового разнообразия рода Lupinus. Независимо от используемой техники, количество мономорфных маркеров оказалось слишком низким для межвидового анализа, были получены низкие значения генетического сходства. Однако все использованные методы позволили провести генетический анализ внутривидового полиморфизма. RAPD-анализ большого количества образцов белого люпина провели Qiu et al. (1993), обнаружив заметные различия между ними. Заметно отличались от остальных три французских сорта. Vas А.С. et al. (2004) исследовали вариабельность фракций белков семян португальских сортов L. albus и обнаружили высокий уровень различий. Кроме того, они выявили высокую корреляцию между рано цветущими сортами и более высоким уровнем белков в семенах. Raman et al. (2008) применили ITAP/SSR (Intronarget Amplified Polimorphism) и DArT- (Diversity Array Technology) маркеры для определения генетического разнообразия белого люпина среди сортообразцов из Австралии и других , стран. Последние маркеры являются доминантными. Они высокопроизводительны при генотипировании. Технология отличается дешевизной и удобством при анализе большого количества объектов. Полиморфными оказали 295 DArT-маркеров и 20 ITAP/SSR, давшие в сумме 50 аллелей. На дендрограмме, построенной по результатам данного исследования, сорта из Эфиопии оказались выделенными в отдельный кластер. Эти сорта являются генетическим источником устойчивости к антракнозу. Австралийские сортообразцы оказались кластеризованы вместе с европейскими, что объясняется их происхождением.
Австралийские ученые проделали большую работу по маркированию люпина, маркированию хозяйственно-ценных признаков. С использованием метода MFLP была создана молекулярная карта L. angnstifolius (Boersma et al.. 2005, 2007d). Было картировано несколько генов. Однако MFLP маркеры не могут быть непосредственно использованы в селекции, так как они требуют слишком больших затрат времени и дорогого оборудования. Поэтому обнаруженные MFLP-маркеры переводят в сайт-специфические.
Boersma et al. (2007а) создали маркер гена mollis, которому дали название МоА. Этот ген контролирует состояние покоя семян L. angustifolius. При рецессивном аллеле гена оболочка семян проницаема для воды, что обеспечивает дружные всходы и хороший урожай в год посева. Дикие формы этого вида, несущие доминантный вариант гена, в засушливые годы формируют непроницаемую для воды оболочку, что вызывает состояние покоя и предотвращает прорастание всех семян в один год. Этот ген был маркирован методом MFLP (Boersma et al., 2005).
Этим же методом авторы создали кодоминантный сайт-специфический маркер KuHMl к гену Ки. Этот ген устраняет необходимость яровизации узколистного люпина, ускоряя его цветение (Boersma et al., 2007b). Маркер устойчивости к фомопсису PhtjM используется в MAS люпина Австралии (Yang, 2008). Boersma et al. (2007c) разработали два сайт-специфических PCR маркера к гену lentus (le), который снижает преждевременное (до созревания) растрескивание бобов узколистного люпина. Созданы маркеры AntjMl (Yang et al., 2004) и AntjM2 (You et al., 2005) к гену Lanrl, определяющему устойчивость к антракнозу Lupinus angustifolius.
Были созданы генетические карты узколистного люпина. Первая попытка картирования была предпринята в Польше на основе морфологических признаков, 4 изозимных маркеров и 60 RAPD-маркеров (Wolko, Weeden, 1994; Kruszka, Wolko, 1999). Авторы выделили всего 17 групп сцепления. Brien et al. (1999), генерировав 705 AFLP-маркеров, получили 52 группы сцепления. Первую полную первую генетическую карту сцепления узколистного люпина составили Boersma et al., (2005). Также карта сцепления была составлена Nelson et. al (2006). Было выявлено разное количество групп сцепления: 21 и 20 соответственно. Данные картирований были объединены и дополнены (Nelson et. al 2010).
Первую генетическую карту сцепления белого люпина составили Phan et al. (2007) на основе AFLP. Эта карта состоит из 28 групп сцепления, 7 пар и 15 несвязанных маркеров. Картировали три важных генетических признака: устойчивость к антракнозу, время цветения и содержание алкалоидов. Для времени цветения и устойчивости к антракнозу выявили по два QTL (Quantitative Trait Loci, локусы количественных признаков). Содержание алкалоидов оказалось менделевским признаком.
Phan et al. (2007) локализовали 105 генетических маркеров для картирования белого люпина. Эти маркеры основаны на intronargeted amplified polymorphisms (ITAPs) и EST-SSR мотивах (Nelson, Phan et al., 2006). Большинство этих маркеров — локус-специфичны.
Полимеразная цепная реакция
Количество ДНК менее существенно влияло на результаты PCR. При концентрации от 20 до 500 нг на пробу качественный состав ампликонов с большинством праймеров оставался неизменным (рис. 4), однако при высоком количестве ДНК в пробе, как правило, на фоне фрагментов появлялся шлейф, а при низких - полосы были бледными.
Для праймеров UBC810 (приложение 4), UBC826, IS3 при снижении концентрации ДНК наблюдалось изменение диапазона размеров ампликонов: отсутствовали высокомолекулярные фрагменты. Внесение 500-300 нг ДНК на пробу позволяло амплифицировать максимальный набор фрагментов. При использовании праймера UBC809, уменьшение количества ДНК до 150 нг и ниже вызывало значительное снижение содержания, вплоть до исчезновения, ряда фрагментов на электрофореграммах (приложение 5). 2 3 4 Рис. 4. Продукты ПЦР ДНК люпина белого (сорт Дега) с праймером UBC840 при различных концентрациях ДНК: 1 - 500 нг, 2 - 400 нг, 3 - 350 нг, 4 - 300 нг, 5 - 250 нг, 6 - 200 нг, 7-150 нг, 8 - 100 нг, 9-50 нг, 10 - 20 нг Оптимальным оказалось внесение в пробу 300 нг НК при ISSR-PCR и 100HrnpHRAPD-PCR. Использование при PCR 2 единиц Тод-полимеразы в случае ISSR-PCR позволяло получать максимальный диапазон фрагментов, по сравнению с меньшими количествами фермента. При этом появления дополнительных или невоспроизводимых полос не наблюдалось.
Для анализа материала в больших масштабах важно, чтобы условия его проведения с использованием разных праймеров были максимально стандартизированы. Это позволит существенно экономить время и исключить ошибки, которые могут возникнуть при проведении PCR в разных лабораториях.
Воспроизводимость ISSR-PCR для разных праймеров оказалась стабильной в достаточно широких диапазонах концентраций реагентов. Это позволило выбрать условия реакции, одинаковые для всех праймеров (табл. 5).
Количество циклов 35 30 30 RAPD-праймеры разделили на две группы (А и Б) по рассчитанной температуре отжига: выше 18?С и ниже соответственно. Для группы «Б» с целью повышения специфичности анализа увеличили концентрацию буфера и праймеров в два раза по сравнению с группой «А», достигнув, таким образом, увеличения температуры отжига (табл. 5).
При разработке метода паспортизации сортов f важно выбрать праймеры, позволяющие стабильно амплифицировать большое количество полиморфных фрагментов. Для экспериментов по выбору таких праймеров использовали по три сорта люпина каждого вида. Выбирали сорта, максимально различающиеся по происхождению и морфологическим признакам для того, чтобы надежно обеспечить синтез полиморфных фрагментов. Для узколистного люпина это были сорта Сидерат 38, Белозерный121 и Регент, для желтого - Престиж, Парис и Перкоз, для белого - Гамма, Бутан, Луниверс.
Для ISSR-анализа выбрали 22 праймера (табл. 6), состоящих из динуклеотидных мотивов с одним-двумя якорными нуклеотидами на 3 -конце. Для проведения RAPD-анализа было выбрано 14 праймеров (табл. 7).
При использовании RAPD-праймеров RN3, ОРМ16, OPN03 не удалось получить продуктов амплификации, а при использовании ISSR-праймеров К15, К37, К38 на электрофореграммах наблюдался лишь высокомолекулярный шлейф (прил. 6, 7).
В основе указанных ISSR-олигонуклеотидов находится один мотив: GT. Этот тип микросателлитных повторов является одним из наиболее часто встречающихся в геномах растений (Morgante, 2002). Можно предположить, что в геноме люпина расстояние между сайтами отжига указанных праймеров находится вне пределах амплификации ДНК Тод-полимеразой (2500-3000 п.н.) или что у люпина эти повторности собраны в кластеры. Таблица
Праймеры RN1 и 0PJO7 не продуцировали? ни одного полиморфного-фрагмента ДНК внутри видов. Є остальными RAPD-праймерами удалось получить по одному-два полиморфных фрагментов; (табл. 8): Исключением; оказался лишь OPN14:, с которым; было найденої пять полиморфных фрагментов на ДНК люпина узколистного. Все полиморфные; фрагменты Ни один из использованных олигонуклеотидов; этого; типа- не позволял синтезировать полиморфные фрагменты на ДНК всех трех видов.
Уровень, полиморфизма при? RAPD-PCR" оказался. ,16,9% (13 полиморфных фрагментов из 77) для узколистного,. 7,3% (3 из 41) для желтого и 10,6% (5 из 47) для белого; люпина; Результаты RAPD-PCR проиллюстрированы на рисунке 5. Видно, что: на электрофореграмме четко видна меньшая часть фрагментов, ни одиаиз них не является.полиморфным.
Специфика RAPD-PCR состоит в том, что минорные ампликоньг могут быть невоспроизводимыми в; связи с ошибками связывания праймеров (Глазко, Календарь, 2002).
Все выбранные 19 ISSR-праймеров стабильно воспроизводили от 9 (К30, ДНК люпина узколистного) до 31 (UBC840, ДНК люпинаї желтого) фрагментов ДНК (табл. 8) длиной от 100 до 2500 п.н. Шесть праймеров (UBC823, К19, К22, К27, КЗО, К3.4.) не позволили получить полиморфные фрагменты (приложения 8 - 10). Полосы со слабой интенсивностью показали стабильную воспроизводимость.
Характеристика полиморфных фрагментов, амплифицируемых при ISSR-PCR
На основе полученных электрофоретических профилей сортов узколистного люпина составлена матрица исходных данных, в которой присутствие фрагмента обозначено 1, а отсутствие — 0. По этой матрице с использованием процента несовпадения (Халяфян, 2007; Лукашов, 2009) была построена таблица генетических расстояний между сортами. По ней был проведен иерархический кластерный анализ методами взвешенного попарного группирования со средним арифметическим (WPGMA, рис. 12) и невзвешенного попарного группирования со средним арифметическим (UPGMA, рис. 13) и построены дендрограммы.
На обоих типах дендрограмм все четыре австралийских образца не сгруппированы в один кластер и распределены среду других сортов. Это объясняется тем, что в основе сортов люпина австралийской селекции были европейские сорта разного происхождения (Gladstones, 1994).
Формы из коллекции белорусского биологического банка генов узколистного люпина (БГБ) также оказались равномерно распределены по древам. Четырнадцать компонентов БГБ сочетают в себе все идентифицированные хозяйственно-ценные признаки узколистного люпина (Купцов, 2006).
Дикие формы из Испании (ИД) образовали кластер, удаленный на максимальное генетическое расстояние от остальных групп.
WPGMA-дендрограмма узколистного люпина (рис. 12) в целом согласуется с происхождением сортов люпина. Так, в единые кластеры сгруппировались сорта российской (кластер 2) и белорусской (кластер 1) селекции, в кластере 3 собраны 5 из 10 польских сортов. Близкое расположение кластеров белорусских и русских сортов, а также положение сорта Сидерат 38 в кластере 1 и сорта Миртан в кластере 2 согласуется с их происхождением: сорта ВНИИ люпина выводили из белорусского исходного материала. Кроме того, селекционеры Белоруссии и Польши на протяжении многих лет проводят совместные работы. Поэтому нахождение в кластере методом UPGMA польских сортов Борута и Бояр также легко объяснить их происхождением (Агеева П.А., Лукашевич М.И., неопубликованные данные). UPGMA-дендрограмма (рис. 13) содержит лишь один кластер, отражающий селекционное происхождение сортов. В него объединены белорусские сорта и сорт российской селекции Сидерат 38. Все остальные образцы не показывают четкой кластеризации.
Дендрограмма, построенная методом WPGMA, лучше отражает происхождение сортов, именно это метод следует в дальнейшем использовать для анализа генетического сходства сортов люпина. Методом WPGMA построили дендрограммы генетического родства желтого (рис. 14) и белого (рис. 15) люпина.
Паспортизация играет большое значение для решения задач идентификации сортов различных видов культурных растений, особенно в тех случаях, когда они обладают существенным морфологическим сходством.
Паспорта сортов применяют при государственной регистрации, при определении чистоты партий семян, а также для защиты авторских прав на сорта.
По результатам ISSR-анализа сортообразцов люпина были составлены полные генетические формулы, отражающие присутствие или отсутствие в генотипах каждого полиморфного фрагмента (Приложение 32). В таблице 11 указаны праймеры, использованные при анализе межсортового полиморфизма каждого сорта и их обозначения. Престиж 1
Полные генетические формулы сортообразцов были использованы для анализа генетического сходства исследованного материала. В то же время для однозначного определения всех сортообразцов нет необходимости использовать данные ISSR-PCR для всех этих праймеров. Так, для узколистного люпина достаточно 4 реакций PCR с праймерами IS2 (В), IS3 (С), IS6 (F) и UBC810 (С) для желтого - одной с праймером UBC810 (I), а для белого - двух с праймерами IS3(B) и UBC809 (Н). Это минимальные наборы праймеров, достаточные для однозначного определения каждого использованного в работе сортообразца люпина. Генетические паспорта, составленные на основе минимальных наборов праймеров приведены в таблице 12.
