Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 13
1.1. Биотехнологические методы защиты растений от болезней и повыше ния урожайности сельскохозяйственных культур. 13
1.1.1. Бактерии родов Pseudomonas и Azotobacter — антагонисты фитопатогенных грибов и бактерий. 14
1.1.2. Бактерии родов Pseudomonas и Azotobacter как представители группы PGPR. 18
1.1.3. Колонизация ризосферы растений бактериями-антагонистами родов Pseudomonas и Azotobacter. 30
1.1.4. Применение биопрепаратов на основе псевдомонад и азотобак тера для защиты растений от болезней. 39
1.2. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения . 45
1.2.1. Влияние нефтяного загрязнения на микробиологические процесссы в почве. 46
1.2.2. Микроорганизмы - деструкторы нефти и нефтепродуктов. 50
1.2.3. Бактериальные препараты для интродукции микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений. 57
И. Объекты и методы исследований 65
2.1. Объекты исследований. 65
2.2. Скрининг штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов среди бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter. 67
2.3. Скрининг микроорганизмов-нефтедеструкторов. 69
2.4. Изучение фенотипических характеристик выделенных культур. 70
2.5. Определение у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к синтезу фитогормональных веществ. 71
2.6. Определение нитрогеназной активности штаммов псевдомонад и азотобактера. 71
2.7. Определение у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к разложению соединений фосфора . 72
2.8. Изучение влияния железа на антифунгальную активность штаммов пседомонад и азотобактера. 72
2.9. Исследование хитинолитической активности штаммов псевдомонад и азотобактера. 73
2.10. Изучение антагонистического воздействия штаммов псевдомонад и азотобактера на развитие грибных фитопатогенов. 73
2.11. Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. 74
2.12. Выделение метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. 74
2.13. Методы изучения состава и структуры метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью. 75
2.14. Комплексообразование метаболитов Pseudomonas с углеводами, определение стехиометрии комплексов. 76
2.15. Изучение ростстимулирующей активности штаммов псевдомонад и азотобактера. 77
2.16. Изучение оптимальных способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов pp. Pseudomonas и Azotobacter и консорциума микроорганизмов-нефтедеструкторов. 78
2.17. Исследование эффективности применения штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter против корневых гнилей пшеницы в лабораторных экспериментах. 80
2.18. Оценка эффективности применения штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях полевого эксперимента. 81
2.19. Оценка эффективности применения штаммов бактерий рода Pseudo-monas против твердой головни пшеницы в условиях закрытого и открытого грунтов. 82
2.20. Оценка эффективности применения штаммов бактерий родов Pseudo-monas и Azotobacter в качестве агентов биологического контроля заболеваний овощных культур в лабораторно-вегетационных опытах. 84
2.21. Характеристика агроклиматических условий вегетационных сезонов. 87
2.22. Получение антибиотикрезистентных модификаций штаммов Pseudo-monas aureofaciens ИБ 51 и Azotobacter vinelandii ИБ 4. 88
2.23. Изучение способности к колонизации корней растений у антибиотик-резистентных штаммов Ps. aureofaciens ИБ 51str и Az. vinelandii ИБ 4amp. 90
2.24. Исследование окислительной активности микроорганизмов — деструкторов нефти и нефтепродуктов. 93
2.25. Изучение эффективности процесса биодеструкции нефти в лабораторных и полевых экспериментах. 94
2.26. Исследование процесса концентрирования биомассы микроорганизмов в лабораторных условиях. 95
2.27. Математическая и статистическая обработка результатов. 96
III. Скрининг природных бактерий родов pseudomonas и azotobacter - антагонистов фитопатогенов и их характеристика в аспекте основы биопрепаратов сельскохо зяйственного назначения . 97
3.1. Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter - антагонистов фитопатогенных грибов. 97
3.2. Характеристика выделенных культур по наличию свойств, положительно влияющих на растение. 114
3.2.1. Фитогормоны, синтезируемые штамхмами псевдомонад и азотобактера. 114
3.2.2. Нитрогеназная активность штаммов псевдомонад и азотобактера. 115
3.2.3. Исследование у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к разложению фосфатов. 121
3.3. Особенности антагонистического действия штаммов псевдомонад и азотобактера на фитопатогенные грибы. 123
3.4. Изучение ростстимулирующей активности штаммов псевдомонад и азотобактера. 134
3.5. Выделение, очистка и характеристика метаболитов, обладающих фунгицидной активностью, продуцируемых бактериями pp. Pseudomo-nas и Azotobacter. 141
IV. Оценка эффективности применения новых штаммов бактерий родов pseudomonas и azotobacter для защиты растений от болезней и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. 160
4.1. Изучение влияния интродукции штаммов-антагонистов родов Pse-udomonas и Azotobacter на аборигенную почвенную микробиоту и колонизирующей способности интродуцированных штаммов. 160
4.1.1. Изучение влияния интродукции штаммов-антагонистов родов Pseudomonas и Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы. 160
4.1.2. Изучение колонизирующей способности штаммов Pseudomonas aureofaciens ИБ 51str и Azotobacter vinelandii ИБ 4amp. 164
4.2. Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад и азотобактера для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза, твердой головни в условиях вегетационных, полевых и производственных испытаний. 171
4.3. Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад и азотобактера в качестве агентов биологического контроля заболеваний овощных культур. 193
V. Разработка и испытания нового биопрепарата-нефтедеструктора «ленойл» . 201
5.1. Характеристика нового консорциума микроорганизмов-нефтедеструк-торов. 201
5.2. Исследование окислительной активности консорциума микроорганиз
мов. 204
5.3. Испытания биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации нефтезагрязненных объектов. 208
5.4. Разработка способов ремедиации природных объектов с использованием биопрепарата «Ленойл». 217
5.5. Разработка нормативно-технической документации на биопрепарат «Ленойл». 232 CLASS VI. Разработка технологии опытно-промышленного производства биопрепаратов на основе бактерий-антагонистов и микроорганизмов-нефтедеструкторов . 235 CLASS
6.1. Исследование процесса выделения биомассы микроорганизмов из куль-туральной жидкости. 235
6.2. Разработка твердых препаративных форм биопрепаратов. 240
6.3. Технологическая схема опытно-промышленного производства биопрепаратов. 248 Заключение 252
Выводы 257
Практические предложения и рекомендации 259
Список литературы 261
Пложения
- Биотехнологические методы очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения
- Определение у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к разложению соединений фосфора
- Характеристика выделенных культур по наличию свойств, положительно влияющих на растение.
- Изучение влияния интродукции штаммов-антагонистов родов Pseudomonas и Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы.
Введение к работе
Актуальность темы. Техногенная нагрузка на почву, интенсивность которой имеет тенденцию к возрастанию, оказывает негативное влияние на функционирование агроэкосистем. Одним из ведущих факторов, ухудшающих агроэкологические свойства почв, является их загрязнение различными ксенобиотиками. Интенсификация сельскохозяйственного производства предполагает широкое применение пестицидов, что увеличивает опасность загрязнения продуктов растениеводства. Развитие биотехнологических способов защиты сельскохозяйственных растений от болезней связано с разработкой новых биопрепаратов, не только функционально эффективных, но и экологически безопасных как для человека, так и для почвенной микробиоты.
Известно, что некоторые представители бактерий родов Pseudomonas и
Azotobacter выступают в качестве антагонистов широкого спектра
фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания зерновых и овощных культур. Значительный интерес исследователей вызывает также способность этих микроорганизмов стимулировать рост и развитие растений, усваивать атмосферный азот в процессе своей жизнедеятельности. В связи с этим, разработка и внедрение в сельскохозяйственную практику биологических препаратов и биологических удобрений на основе бактерий Pseudomonas и Azotobacter, приобретает особое значение.
Среди высоко токсичных загрязнителей окружающей среды выделяются нефтепромысловые поллютанты (нефть и продукты ее переработки, нефтяные шламы и т.д.). Наиболее перспективные методы биоремедиации загрязненных объектов основаны на способности различных микроорганизмов усваивать углеводороды нефти. Поэтому поиск их отдельных видов и консорциумов, обладающих высокой скоростью роста, возможностью деструкции различных углеводородов и разработка экономичных, технологически простых в использовании биопрепаратов остается актуальной проблемой.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка новых биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и восстановления окружающей среды от последствий нефтяного загрязнения. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1. Выделить и охарактеризовать новые штаммы бактерий-антагонистов
грибных фитопатогенов родов Pseudomonas и Azotobacter.
-
Определить химическую структуру метаболитов с антибиотическими свойствами, продуцируемых бактериями-антагонистами родов Pseudomonas и Azotobacter.
-
Оценить эффективность применения новых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter для улучшения развития сельскохозяйственных растений и защиты их от болезней.
-
Выделить из нефтезагрязненных почв наиболее активные штаммы аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов.
-
Разработать биопрепарат на основе этих штаммов и оценить его эффективность для ремедиации почв и водных поверхностей, загрязненных нефтью.
-
Разработать технологическую схему производства биопрепаратов для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды.
Научная новизна. Из природных и техногенных местообитаний выделена и идентифицирована группа новых штаммов родов Pseudomonas и Azotobacter , проявляющих антагонистическую активность в отношении аэрогенных и почвообитающих фитопатогенных грибов. Штаммы Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Pseudomonas putida ИБ 17, Azotobacter vinelandii ИБ 1 и Azotobacter vinelandii ИБ 4 запатентованы в Российской Федерации в качестве основы биопрепаратов для защиты растений от грибных инфекций. Показано, что все вьщеленные штаммы микроорганизмов продуцируют фитогормоны, а штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 предложен в качестве продуцента цитокининов. Штамм Pseudomonas species ИБ 182, обладающий
5 высокой хитинолитической активностью, может быть использован для получения хитиназ (Пат. РФ № 2187553).
Впервые показано, что бактерии штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, являющиеся основой биопрепарата «Елена», способны продуцировать новый антибиотик, представляющий собой трипептид глицерина и подавляющий развитие фитопатогенных микромицетов.
Впервые определена химическая структура нового антибиотика, продуцируемого бактериями штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4, являющихся основой биопрепарата «Азолен» и представляющего собой политиофосфат тетрааминосахарозы.
Выделен и идентифицирован природный консорциум микроорганизмов-нефтедеструкторов, содержащий штаммы бактерий Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3. Указанный консорциум микроорганизмов, являющийся основой биопрепарата «Ленойл», обладает высокой деструктивной активностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (Решение Роспатента от 14.01.2004 о выдаче Патента РФ по заявке № 2002121985/13).
Разработаны новые способы очистки водных поверхностей от нефти и нефтепродуктов, биологической рекультивации отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, основанные на использовании биопрепарата «Ленойл» (Решение Роспатента от 10.06.2004 о выдаче Патента РФ по заявке № 2002132519/13; Решение Роспатента от 21.04.2004 о выдаче Патента РФ по заявке № 2002135839/13).
Практическая значимость. Разработаны для защиты сельскозяйствен-ных растений и повышения их урожайности новый биопрепарат «Елена» и новое микробиологическое удобрение «Азолен». Проведен комплекс производственных испытаний в условиях открытого и закрытого грунтов, подтвердивших эффективность новых разработок. Разработан для восстановления окружающей среды биопрепарат-нефтедеструктор «Ленойл», биопрепарат используется в настоящее время в ОАО «Орскнефтеоргсинтез» в процессе
биологической рекультивации отбеливающей земли, являющейся крупнотоннажным отходом нефтепереработки. Разработан и внедрен на ГУЛ «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан» технологический регламент опытно-промышленного производства новых биопрепаратов. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
новые штаммы бактерий Pseudomonas aureofaciens и Ps. putida, обладающие комплексом свойств, положительно влияющих на развитие растений;
новые штаммы бактерий Azotobacter vinelandii, обладающие совокупностью полезных свойств, стимулирующих развитие растений;
- структура и свойства новых метаболитов PGPR микроорганизмов,
обладающих антагонистической активностью по отношению к фитопатогенам;
новый природный консорциум микроорганизмов-нефтедеструкторов, способный окислять углеводороды как алифатического, так и ароматического ряда;
- методы концентрирования биомассы в процессе производства биопрепаратов
для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды.
Апробация результатов. Основные результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Хозяйственно-питьевая и сточные воды: проблемы очистки и использования» (Пенза, 2000), Всероссийской конференции «Почва, жизнь, благосостояние» (Пенза, 2000), Международной научно-практической конференции «Промышленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля» (Пенза, 2000), II Всероссийской научно-практической конференции «Огходы-2000» (Уфа, 2000), XIV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2001), VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001), XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), Все-
7 российской научно-практической конференции «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (Уфа, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), Семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (Пушино, 2003), II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), II Всероссийской научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2003), научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Ханты-Мансийск, 2003).
Публикации. Основные результаты исследований изложены в 62 научных публикациях, включая 10 патентов Российской Федерации.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из двух томов. Том I содержит введение, обзор литературы, экспериментальную часть (5 глав), заключение, выводы, список цитируемой литературы; том II содержит 36 приложений. I том работы изложен на 296 страницах, содержит 72 таблицы и 22 рисунка. Список цитируемой литературы включает 343 наименования, из них 199 на русском языке.
Биотехнологические методы очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения
Одним из типичных антропогенных воздействий на окружающую среду стало загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами. По экспертным оценкам масштабы загрязнения почвы в результате деятельности нефтедобывающих и транспортных предприятий на территории России достигают сотен тысяч гектаров. Разливы нефти вследствие аварий на нефтепроводах оцениваются миллионами тонн (Глазовская, 1988). Существующие механические, термические и физико-химические методы очистки почв от нефтяных загрязнений дорогостоящи и эффективны только при определенном уровне загрязнения (как правило, не менее 1% нефти в почве). Микробиологические методы способны дополнять указанные технологии, а в определенных ситуациях не имеют альтернативы.
Биотехнологические методы защиты окружающей среды от техногенных загрязнений основаны на использовании микроорганизмов-деструкторов. Способность утилизировать трудноразлагаемые вещества антропогенного происхождения (ксенобиотики) обнаружена у многих микроорганизмов. Это свойство обеспечивается наличием у микроорганизмов специфических ферментных систем, осуществляющих катаболизм таких соединений. Поскольку микроорганизмы имеют сравнительно высокий потенциал разрушения ксенобиотиков, проявляют способность к быстрой метаболической перестройке и обмену генетическим материалом, им придается большое значение при разработке путей биоремедиации загрязненных объектов. Биоремедиация — это применение технологий и устройств, предназначенных для биологической очистки почв и водоемов, т.е. для удаления из почвы и воды уже находящихся в них загрязнителей. Разработка и совершенствование технологий биоремедиации, особенно почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в настоящее время является областью активных фундаментальных и прикладных исследований. Биоремеднация включает в себя два основных подхода: 1) биостимуляцию (активизация деградирующей способности аборигенной микрофлоры внесением биогенных элементов, кислорода, кометаболизируемых субстратов); 2) биодополнение (интродукция природных и генноинженерных штаммов-деструкторов чужеродных соединений) (Бельков, 1995).
Существующие два пути интенсификации биодеградации ксенобиотиков в окружающей среде - стимуляция естественной микрофлоры и интродукция активных штаммов, по мнению Т.В.Коронелли (1996) не только не противоречат, но и дополняют друг друга. Наиболее широкое распространение получили методы биоремедиации, основанные на активизации аборигенной почвенной микрофлоры, потенциально способной утилизировать загрязнитель за счет применения ряда агротехнических мероприятий (рыхление почвы, увлажнение, применение удобрений и др.), а также на интродукции в места загрязнения специально отобранных микроорганизмов, активно утилизирующих загрязнитель, что значительно ускоряет процессы восстановления почвы.
Процесс естественного фракционирования и разложения нефти начинается с момента ее поступления на поверхность почвы. Выделяют три наиболее общих этапа трансформации нефти в почвах: 1) физико-химическое и частично микробиологическое разложение алифатических углеводородов; 2) микробиологическое разложение, главным образом, низкомолекулярных структур различных классов, образование смолистых веществ; 3) трансформацию высокомолекулярных соединений: смол, асфальтенов, циклических углеводородов (Исмаилов, Пиковский, 1988). Длительность процесса трансформации нефти в разных почвенно-климатических зонах может быть различной - от нескольких месяцев до нескольких десятков лет (Бочарникова, 1990).
Загрязнение нефтью оказывает отрицательное воздействие на химические, физические и биологические свойства почв. Под влиянием нефти и ее компонентов изменяется численность микроорганизмов основных физиологических групп, ухудшаются агрофизические, агрохимические свойства почвы, снижаются активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, обеспеченность почвы подвижными формами азота и фосфора.
На разложение нефти в почве решающим образом влияет функциональная активность комплекса почвенных микроорганизмов, обеспечивающих полную минерализацию нефти и нефтепродуктов до углекислого газа и воды. На первой стадии изменение почвенной биоты характеризуется массовой гибелью мезо- и микрофауны; на второй стадии - «бумом» микробиологической активности специализированных микроорганизмов и последующей постепенной эволюцией биоценоза, коррелирующей с постоянно изменяющейся геохимической ситуацией в почве (Solnseva, 1995).
Органическая природа нефти определяет специфику гумусного состояния загрязненных почв. Изменение гумусовых веществ в нефтезагрязненных почвах исследовано в работах Орловой с соавторами (1996). Изучали изменение фракционно-группового состава и свойств гумуса подзолистой суглинистой, дерново-подзолистой почвы и типичного чернозема под влиянием загрязнения нефтью. Как в природных условиях, так и в модельном опыте при загрязнении почвы резко менялись состав и свойства гумуса, происходило увеличение абсолютного содержания всех фракций гумусовых веществ, что свидетельствовало о включении легких фракций нефти в состав их молекул. Во всех вариантах снижалось общее содержание углерода и азота в почве. Превращение нефти в почве, как отмечают авторы, идет по трем направлениям, т.е. путем минерализации, консервации и трансформации.
Н.А.Киреевой (1995) показана токсичность ароматических углеводородов для микроорганизмов почвы и их негативное воздействие на ферментативную активность. Наиболее чувствительными к загрязнению ароматическими углеводородами являются нитрифицирующие и целлюлозоразрушающие микроорганизмы, которые могут служить индикаторами загрязнения почв. В полевых условиях исследовано влияние нефтяного загрязнения (8, 16, 25 л/м ) на морфологические, физиологические характеристики ячменя двурядного — детерминанта консорции и на ризосферные микроорганизмы - консорты в серой лесной почве. Нефтяное загрязнение, как следует из результатов экспериментов, приводит к нарушению консортивных связей: отрицательно действует на ячмень, снижая его фотосинтетическую активность и продуктивность; ризосферные микроорганизмы заменяются нетипичными для этих почв видами. В результате снижается продуктивность агроценозов.
Загрязнение нефтью существенно изменяет комплекс почвенных акти ном ицетов, снижая их численность и обедняя видовой состав (Киреева, 1995, 1996). Кроме того, показано, что в загрязненной нефтью почве возрастает число фитопатогенных и фитотоксичных видов микроскопических грибов. Развитие фитотоксичных форм грибов может усилить отрицательное воздействие на почву нефтяного загрязнения (Киреева, Галимзянова, 1995).
Показано, что загрязнение нефтью приводит к существенному (на два порядка) снижению численности гетеротрофной части микробного комплекса, отмеченного на начальных этапах воздействия нефти. Через три месяца происходит восстановление численности гетеротрофов (Сидоров с соавт., 1997).
Однако другие авторы, изучавшие сапротрофные бактерии в почвах, загрязненных нефтью (чернозем, серозем и дерново-подзолистая почва), показали, что в условиях хронического нефтяного загрязнения происходило увеличение численности и биомассы бактерий в два раза, очевидно, это связано с развитием в почве устойчивых к нефти популяций бактерий (Волде, 1996). Выявлены перестройки в структуре сапротрофного бактериального комплекса: в сероземе представители p. Arthrobacter из доминантов переходили в группу минорных компонентов, а в черноземе p. Bacillus уступал место стрептомицетам. Наиболее устойчивыми оказались представители родов Rhodococcus, Micrococcus, Myxococcus, Spirillum. В почвах, загрязненных нефтью, происходило активное развитие ассоциаций бактерий, состоящих из скользящих бактерий (p.p. Myxococcus, Cytophaga), коринеподобных (p. Rhodococcus) и грамотрицательных (p. Spirillum). Изучение сапротрофного бактериального комплекса дерново-подзолистой почвы, находящейся в условиях хронического нефтяного загрязнения, показало активное развитие в ней бактерий p.p. Rhodococcus, Myxococcus и Spirillum. Полученные данные позволяют предположить, что разложение нефти в почве наиболее активно осуществляют ассоциации микроорганизмов, состоящие из скользящих бактерий (p. Myxococcus и Cytophaga), родококков и спирилл.
Определение у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к разложению соединений фосфора
Для выявления у псевдомонад и азотобактера способности к растворению неорганических фосфатов использовалась среда, предложенная Пиковской Р.И. (Большой практикум.., 1962), а также среда Муромцева. Фосфат кальция вносили в питательную среду Муромцева методом осаждения, предложенным Герретсеном, в модификации Муромцева (Методы..., 1991). Приготовленные питательные среды разливали по чашкам Петри, подсушивали в термостате и сажали уколом исследуемые культуры микроорганизмов. Чашки инкубировали в термостате при 28С в течение семи суток. О растворении фосфатов судили по образованию вокруг колоний бактерий зон просветления питательной среды.
Для того чтобы выявить у изучаемых штаммов микроорганизмов способность к расщеплению органических соединений фосфора, микроорганизмы высаживались уколом на среду МПА либо среду 40 с добавлением 2,0% мела и органического фосфора в виде натрия аденозинтрифосфата в количестве 0,005%. В случае гидролиза фосфатов вокруг колоний бактерий образуются прозрачные зоны, т.е. происходит растворение мела под влиянием отщепившейся фосфорной кислоты.
Известно, что антибиотические свойства многих видов бактерий р. Pseudomonas связаны с синтезом ими железотранспортирующих агентов-сидерофоров, конкурирующих с сидерофорами фитопатогенных микроорганизмов за необходимое для последних железо.
Для исследования влияния железа на антифунгальные свойства выделенных штаммов псевдомонад и азотобактера сравнивали их антагонистическую активность на среде Кинг В в отсутствии железа и с добавлением 100 мкг/мл FeCb (Смирнов с соавт., 1990).
Для определения хитинолитической активности выделенных штаммов р. Pseudomonas их выращивали на среде с 1,5% агара следующего состава, (г/л): дрожжевой экстракт - 0,5; (NHOzSC - 1,0; MgS04-7H20 - 0,3; КН2Р04 - 1,36; дистиллированная вода-1 л. В качестве источника углерода в среду вводили коллоидный креветочный хитин в количестве 0,5%). Культивировали штаммы на чашках Петри при 28С.
Способность псевдомонад к синтезу хитинолитических ферментов определяли по наличию вокруг колонии бактерии зоны просветления мутной среды. Эффективность гидролиза хитина определяли по величине отношения диаметра зоны просветления мутной среды вокруг колонии к диаметру колонии (мм/мм).
Морфологические изменения, происходящие с фитопатогенными грибами под воздействием метаболитов штаммов-антагонистов pp. Pseudomonas и Azotobacter изучали в условиях совместного роста микромицетов и бактерий на плотных средах ГПА либо КГА. Наблюдения за развитием микроорганизмов проводили под микроскопом марки AMPLIVAL 30-G048-1 (Carl Zeiss Jena, Германия) после инкубации в течение 48 ч. 2.11. Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью
При исследовании физико-химических факторов, влияющих на титр клеток и секрецию метаболитов с фунгицидной активностью, переменными величинами являлись концентрации углерода, органического азота и температура культивирования.
Время культивирования - 72 ч. Отбор проб для анализа антигрибной активности и титра клеток осуществляли через каждые 8-12 ч.
Выделение метаболитов с антигрибной активностью Pseudomonas проводили следующим образом. После удаления биомассы на центрифуге "К23 D" (3000 мин"1 , 20 мин) супернатант подвергали ультрафильтрации на модулях волоконного типа "Amicon ЗР-10 " (США), отбирая фильтрат, содержащий НМ фракцию ( 3 кДа) внеклеточных метаболитов исследуемых штаммов. Фильтрат упаривали на вакуумном роторном испарителе при 35С, примеси осаждали метанолом и отделяли центрифугированием в тех же условиях. После отгонки метанола из супернатанта, изучаемые вещества осаждали ацетоном.
Чистоту и гомогенность выделенных метаболитов проверяли при помощи ВЭЖХ в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572Р ("Gasukuro Kogyo", Япония), ультрафиолетового детектора ("Du Pont", США). Для разделения использовали колонку из нержавеющей стали с сорбентом (размер зерна 5 мкм) Zorbax-ODS (250x4,6 мм, "Shimadzu", Япония). Образцы вводили с помощью дозатора модели 7125 ("Rheodyne", США) с петлей объемом 20 мкл. В качестве элюента использовали воду, подверженную дополнительной очистке (Сакодынский, 1993; Стыскин, 1986). Расход подвижной фазы 1,0 мл/мин. Пики регистрировали при 254 нм.
Молекулярную массу выделенных метаболитов оценивали при помощи эксклюзионной хроматографии в системе, описанной выше, на колонке TSK G2000SW (300x7,8 мм, "Тоуо Soda", Япония) при элюировании смесью 0,1 М NaH2PC 4 и 0,3 М хлорида натрия (рН 7,0) с расходом 1 мл/мин с УФ -детектированием при 254 нм. В качестве маркеров молекулярной массы использовали инсулин (Mr 5,8 кДа, "Lilly", Франция) и витамин В12 (Mr 1355 Да, ЗАО "Верофарм", Россия).
Характеристика выделенных культур по наличию свойств, положительно влияющих на растение.
Известно, что микроорганизмы синтезируют ряд веществ, являющихся регуляторами роста растений. Установлено, что ростстимулирующая активность некоторых штаммов p. Pseudomonas связана с продуцированием ИУК (Forlani et al., 1995). Способность продуцировать цитокининоподобные вещества и гетероауксины выявлена также у бактерий p. Azotobacter (Rosario, Barea, 1975; Nair, Chandra, 1997; Ожиганова и др., 1993).
С помощью метода ИФА у выделенных штаммов псевдомонад и азотобактера была изучена способность к синтезированию ИУК и цитокининоподобных веществ. Определение концентрации гормонов в КЖ щ штаммов-антагонистов проводили в фазе стационарного роста культур. Результаты оценки иммунореактивности образцов КЖ штаммов приведены в таблице 3.11. Как видно из таблицы 3.11, все штаммы-антагонисты обладают способностью к синтезу фитогормонов. Способностью к продуцированию ИУК обладают 4 из 5 штаммов псевдомонад и только один из исследуемых штаммов азотобактера. В данном случае фитогормональная активность возрастает в ряду ф P.putida ИБ 56 - P.putida ИБ 17 - Az. vinelandii ИБ 1 - P.aureofaciens ИБ 6 P.aureofaciens ИБ 51. Другая закономерность выявлена при изучении синтеза 115 цитокининоподобных веществ: значительная иммунореактивность отмечена у штамма P.aureofaciens ИБ 6, а также у штаммов P.aureofaciens ИБ 51 и Az. vinelandii ИБ 1. Таким образом, среди исследуемых изолятов наибольшая фитогормональная активность выявлена у штаммов P.aureofaciens ИБ 51, P.aureofaciens ИБ 6 и Az. vinelandii ИБ 1. Данные штаммы обладают способностью к синтезу как ИУК, так и цитокининоподобных веществ. Для штамма P.putida ИБ 17 и Az. vinelandii ИБ 4 также отмечены довольно высокие значения концентраций ауксинов и цитокининов в КЖ. В КЖ штаммов P.putida ИБ 56, Pseudomonas sp.182 и Az. vinelandii ИБ 3 также присутствуют либо цитокинины, либо ауксины, но по их концентрации данные штаммы уступают остальным изолятам почти на порядок.
Изучение особенностей биологической азотфиксации имеет большое значение для функционирования наземных экосистем. Растения потребляют в основном почвенный азот, причем, даже в том случае, когда в почву вносятся высокие дозы минерального азота. Основная масса азота содержится в органическом веществе почвы, которое состоит из гумусовых и негумифицированных веществ растительного и животного происхождения. Лишь незначительная часть азота входит в состав неорганических соединений в нитратной и аммонийной формах, способной усваиваться растениями. За счет ассоциативной азотфиксации в фитоплану луговых и зерновых злаков в зоне умеренного климата поступает 30-40 кг азота на гектар за вегетационный период, тогда как в почве без растений только 10-13 кг азота/га/год. Растения стимулируют деятельность диазотрофных бактерий и определяют суточную и сезонную динамику ассоциативной азотфиксации. Наиболее важную роль в стимуляции играют продукты экзоосмоса и корневой опад, являющиеся энергетическим субстратом для диазотрофов. Высокая поглотительная деятельность корней способствует быстрому оттоку азотсодержащих продуктов метаболизма бактерий и поддерживает высокую активность нитрогеназы. Метаболитами азотфиксирующих бактерий являются аминокислоты, аминосахара и продукты их частичной амонификации, которые потребляются растениями. Оптимальный уровень параметров среды для роста растения соответствует и ее оптимуму для ассоциативной азотфиксации (Умаров, 1986).
К настоящему времени доказано, что некоторые микроорганизмы р. Pseudomonas также принимают участие в фиксировании молекулярного азота, что положительно влияет на развитие и урожайность сельскохозяйственных культур (Бурлуцкая с соавт., 1991; Лукин с соавт., 1995; Шабаев, Смолин, 1999). Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик культур-антагонистов проводили стандартными методами Целью наших исследований было изучение нитрогеназной активности выделенных штаммов псевдомонад.
По результатам проведенных экспериментов установлено, что на агаризованной среде Эшби хорошо растут штаммы P. aureofaciens ИБ 51 и Р. aureofaciens ИБ 6. Следует отметить, что при росте на безазотистой среде данные микроорганизмы не образуют характерного ярко-оранжевого пигмента. В то же время было показано, что наибольшей ацетиленредуктазной способностью в жидкой культуре обладает штамм Pseudomonas sp. ЦБ 182, который характеризовался слабым ростом при выращивании на плотной среде Эшби (табл.3.12).
Изучение влияния интродукции штаммов-антагонистов родов Pseudomonas и Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы.
Ризосфера растений представляет собой специфическую эконишу, характерной особенностью которой является поступление питательных веществ за счет экзоосмоса корней. Корневые выделения содержат небольшие количества разнообразных соединений, включая сахара, аминокислоты, пептиды, ферменты, витамины, органические кислоты и др. Постоянное поступление питательных веществ стимулирует развитие микроорганизмов в зоне ризосферы.
Известно, что PGPR-бактерии влияют не только на рост и развитие растений, но и могут принимать участие в формировании микробных ассоциаций (Калько, Воробьева, 2001). Для успешной борьбы бактерий-антагонистов с почвенными возбудителями грибных болезней растений необходимо, чтобы интродуцируемые в ризосферу полезные микроорганизмы обладали способностью к формированию стабильной популяции.
Нами была поставлена задача, определить влияние интродуцированных штаммов антагонистов pp. Pseudomonas и Azotobacter на численность аборигенной микрофлоры ризосферы пшеницы сорта Жница. В эксперименте изучалось также воздействие на микробиоценоз со стороны биопрепаратов: Агат - 25 К и Фитоспорин, а также фунгицида широкого спектра действия Феразим.
Изучение динамики численности микроорганизмов ризосферной зоны пшеницы показало, что предпосевная обработка семян пшеницы всеми видами препаратов, за исключением Фитоспорина, привела к снижению численности грибов в ризосфере в начальной фазе развития растений (табл. 4.1). Причем, показано, что препараты на основе изучаемых псевдомонад и азотобактера сопоставимы по эффективности подавления развития микромицетов с известным биопрепаратом Агат-25 К и химическим фунгицидом Феразим. Отмечено, также влияние псевдомонад и азотобактера на увеличение численности в ризосфере микроорганизмов p. Bacillus (табл. 4.1). Для штамма Az. vinelandii ИБ 4 в фазе третьего листа и в фазе восковой спелости выявлено превышение количества спорообразующих микроорганизмов в ризосфере пшеницы в 5 раз по сравнению с контрольным вариантом. Подобную стимуляцию популяции p.Bacillus можно объяснить наличием механизма положительного взаимодействия по типу комменсализма, т.е. взаимно благоприятного влияния сопутствующих бактерий. В частности, для бактерий Az. vinelandii, был отмечен такой специфический механизм отношений с Bacillus circulans, при котором наблюдалось увеличение численности бацилл и увеличение азотфиксации в 2-3 раза (Белимов, 1992). Биопрепараты Фитоспорин и Агат-25К также способствовали увеличению в ризосфере пшеницы численности бацилл в середине вегетации.
Анализ динамики численности групп гетеротрофных микроорганизмов, актиномицетов, олигонитрофилов не выявил достоверных отличий между контролем и опытными вариантами (табл. 4.1). Только для штамма Az. vinelandii ИБ 1 было отмечено достоверное увеличение популяции олигонитрофильных микроорганизмов на начальной стадии роста растений.
Таким образом, можно сделать вывод, что интродукция штаммов антагонистов pp. Pseudomonas и Azotobacter в прикорневую зону пшеницы сорта
Жница не угнетает жизнедеятельность аборигенной бактериальной микрофлоры и оказывает негативное влияние только на представителей группы микромицетов — фитопатогенов растений, что, по-видимому, объясняется спецификой действия метаболитов, вырабатываемых штаммами-антагонистами.
Наличие у бактерий, относящихся к группе PGPR, способности к активной колонизации корней растения-хозяина дает им заметное преимущество среди микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами, но не конкурентных в новых условиях обитания (Caponlgro, Contillo, 1986; Кравченко, Макарова, 1993). Приживаемость в ризосфере интродуцированного микроорганизма зависит от многих факторов, но в первую очередь определяется самим бактериальным штаммом, видом и сортом растения.
Целью исследования было изучить колонизирующую способность штаммов-антагонистов P. aureofaciens ИБ 51 и Az.vinelandii ИБ 4. В экспериментах использовали штамм P. aureofaciens ИБ 51str, устойчивый к стрептомицину, и ампициллинрезистентный штамм Az.vinelandii ИБ4атр.
В начальной серии экспериментов была поставлена задача, изучить выживаемость клеток штаммов-мутантов P. aureofaciens ИБ 51&1ги Az.vinelandii ИБ4штф на поверхности зерен пшеницы. Установлено, что срок жизнеспособности клеток на зерне крайне ограничен. В течение 1,5 недель после инокуляции зерен численность популяции штамма-антагониста P. aureofaciens ИБ 51str на их поверхности снижается в 50 раз, а через 20 дней после бактеризации вообще не удалось обнаружить на семенах жизнеспособных клеток штамма (табл.4.2).
Для продления срока выживания штамма псевдомонады на посевном материале пшеницы была использована обработка семян суспензией клеток штамма-антагониста совместно с растворами сахарозы в различных концентрациях (табл.4.2).
