Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Молекулярно-генетические методы исследования полиморфизма ДНК 9
1.2 Селекция на основе молекулярных маркеров MAS 20
1.3 Генетический полиморфизм белков молока 26
1.3.1 Роль аллельных вариантов каппа казеина при переработке молока 32
1.4 Краткая характеристика черно-пестрого скота России 36
2. Материалы и методы исследований 47
3. Собственные исследования 56
3.1 Генотипирование популяции черно-пестрого скота по каппа казеину 56
3.1.1 Генотипирование быков-производителей по каппа-казеину 59
3.1.2 Генотипирование первотелок по каппа казеину 62
3.2 Хозяйственно-полезные признаки 63
3.2.1 Молочная продуктивность коров черно-пестрой пород с разными генотипами по каппа казеину 63
3.2.2 Качественные показатели молока коров разных генотипов каппа казеина 68
3.2.3 Технологические свойства молока. Сыр 72
3.2.4 Генотипирование молодняка по каппа казеину 76
3.2.5 Анализ наследуемости генотипов каппа казеина 79
3.2.6 Живая масса телят разных генотипов по каппа казеину 83
4.. Экономическая эффективность 90
Обсуждение полученных результатов 93
Выводы по
Предложения производству 112
Список литературы 11 з
Приложения
- Молекулярно-генетические методы исследования полиморфизма ДНК
- Материалы и методы исследований
- Генотипирование популяции черно-пестрого скота по каппа казеину
Введение к работе
Актуальность темы. В результате экономических преобразований в сельском хозяйстве России, за несколько последних лет, произошли радикальные перемены, носящие в основном негативный характер. Во всех отраслях животноводства, в том числе и молочном скотоводстве, резко снизилось количество животных, что привело к снижению их продуктивности, ухудшению показателей воспроизводства, увеличению подверженности к заболеваниям, рождению молодняка с пониженной жизнеспособностью как в ранние, так и в более поздние периоды роста и развития, что, в свою очередь, привело к значительному экономическому спаду отрасли.
Поэтому одной из актуальных проблем современной науки и практики продолжает оставаться поиск надежных, высокочувствительных методов оценки функционального состояния организма животных в раннем возрасте, с целью прогнозирования их продуктивной ценности в будущем.
Традиционные зоотехнические методы оценки сельскохозяйственных животных, основанные на анализе фенотипических признаков, не всегда обеспечивают объективность суждения о селекционной перспективности животных и не могут в полной мере удовлетворить требования, предъявляемые к селекции.
Большинство хозяйственно-полезных признаков имеют непрерывную фенотипическую изменчивость и находятся под контролем многих генетико-физиологических систем, а также различных факторов внешней среды. В связи с этим методы биохимической и молекулярной генетики, основанные на использовании генетических маркеров, находят все большее применение в практической селекции.
Беспрецедентные возможности открыло использование ДНК-маркеров для генетического маркирования локусов, сцепленных с хозяйственно-ценными признаками.
Особо актуальным в теоретическом и практическом отношении является исследование полиморфизма молочных генов, как маркеров молочной продуктивности. Преимущество генетических маркеров заключается в том, что они неизменяемы в онтогенезе, независимы от условий внешней среды и имеют кодоминантный тип наследования, а значит и четкий генетический контроль.
Использование генетических маркеров молочной продуктивности в практической селекции крупного рогатого скота, позволит более достоверно оценивать генетический потенциал пород, популяций и отдельно взятых особей, контролировать селекционные процессы и корректировать их направленность.
В настоящее время проблема качества молока и других продуктов животноводства приобрела крайне острый характер. В связи с низким качеством кормов и несбалансированным кормлением, несоблюдением ветеринарно-санитарных требований к технологиям и гигиене содержания коров снижается не только их продуктивность, но и качество молока, его биологическая полноценность. Одновременно наблюдается снижение содержания в молоке жира, белка и витаминов. Оценка молока, исходя из требований ГОСТ Р 52054-2003, показывает, что в последние годы резко снизилось производство молока высшего сорта (О.В. Сычева, 2004).
Опыт многих стран мира свидетельствует о важности селекции коров по белковомолочности, так как это во многом определяет технологические свойства молока и его пищевую ценность. Возрастающий интерес к молочной продукции с пониженным содержанием жира и более высоким содержанием белка, диктует необходимость использования объективных молекуляр-но-генетических методов в практической селекции, прежде всего - методов ДНК-ди агности ки.
Работами ряда ученых доказана связь генотипических вариантов каппа-казеина с качественными и технологическими показателями молока, которая является однонаправленной у всех исследованных пород крупного рогатого скота.
Ранее генотипы молочных белков не включали в показатели селекции, так как полиморфизм молочных белков можно было оценить только у лакти-рующих животных. Благодаря методу ДНК - диагностики стало возможным идентифицировать генотипы молочных белков у всех половозрастных групп животных (быки-производители, коровы, молодняк), что позволяет эффективно использовать генотипирование по локусу гена каппа-казеина в селекции и ускорить процесс создания высокопродуктивных стад и популяций животных (В.Г. Шевченко, 1997).
В течение последних 20 лет в нашей стране интенсивно создаются новые молочные типы скота преимущественно с использованием голштинской породы (П.Н. Прохоренко, Ж.Г. Логинов, 1986; А.К. Митюков, 1989; И.М. Дунин, 1994; Р.А. Хаертдинов и др., 2000; П.Н. Прохоренко, 2001). Поэтому современные стада молочного скота представлены высокопродуктивными помесями разных генотипов. В сравнении с исходными отечественными породами, отмечено значительное превосходство помесных животных по уровню молочной продуктивности, качественным показателям и технологическим свойствам молока (И.К. Медведев, 1986; А.А. Снопова, 1986; G. Berg et al., 1987; A. Neimann-Sorenson et al., 1987; K.G. Breitenstein et al., 1989; J.P. Gibson et al., 1990; Р.А. Хаертдинов, 1990, 1992; N. Antunac et al., 1992; D. Samarzija et al, 1992; E. Jakob, 1994; W. Michalak, 1994).
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение взаимосвязи молочной продуктивности и технологических свойств молока коров черно-пестрой породы (ленинградская селекция) и их потомства с разными генотипами по гену каппа-казеина в условиях Ставропольского края.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Оценить частоту встречаемости аллельных вариантов гена каппа-казеина у быков-производителей, коров и потомков черно-пестрого скота с использованием методов ДНК-диагностики.
Изучить молочную продуктивность коров с различными генотипами каппа-казеина.
Изучить основные качественные показатели и технологические свойства молока, а также физико-химические показатели сыра, изготовленного из молока коров с различными генотипами по каппа-казеину.
Изучить и дать анализ наследуемости генотипов каппа-казеина потомками от различных вариантов скрещивания.
На защиту выносятся следующие положения: использование полиморфных белков молока коров черно-пестрой породы в качестве генетических маркеров молочной продуктивности; взаимосвязь аллельных вариантов гена каппа-казеина с качественными и количественными характеристиками молочной продуктивности коров; использование генотипов каппа-казеина для подбора родительских пар, прогнозирование молочной продуктивности в раннем возрасте.
Научная новизна. Впервые применен комплексный подход в оценке племенной, продуктивной ценности быков-производителей, коров на основе данных ДНК-диагностики локуса каппа-казеина, показателей молочной продуктивности, качества молока. Выявлен полиморфизм и определена частота встречаемости аллельных вариантов по гену каппа-казеина у скота черно-пестрой породы. Доказана взаимосвязь количественных и качественных характеристик мягкого сыра «адыгейский» с технологическими свойствами молока коров с различными генотипами каппа-казеина. Обоснована возможность использования полиморфных белков молока в качестве генетических маркеров хозяйственно-ценных признаков в селекционно-племенной работе. Изучена наследуемость аллельных вариантов каппа-казеина потомками, полученными от различных сочетаний генотипов каппа-казеина у родительских особей.
Практическая значимость. Использование методов ДНК-диагностики для прогнозирования продуктивности крупного рогатого скота позволяет повысить эффективность селекции. Проведение отбора и подбора животных с учетом генотипов каппа-казеина, позволило выявить такие сочетания родительских пар, которые наиболее благоприятно влияют на продуктивность молодняка. Полученные данные о наличии взаимосвязи генотипов коров по локусу гена каппа-казеина с составом молока и его технологическими свойствами открывают возможность использования генетических методов для совершенствования черно-пестрого скота по качеству молока. Показана возможность повышения частоты встречаемости аллеля В каппа-казеина в популяции - путем отбора животных с желательным генотипом и использования быков-производителей, имеющих аллельный вариант В каппа-казеина в своем геноме.
Разработаны научно-обоснованные рекомендации для использования в практической селекции крупного рогатого скота.
Настоящая работа является одним из разделов научно-исследовательской работы, проводимой в соответствии с Государственным тематическим планом научных исследований ГНУ СНИИЖК по теме: «Разработать системы генетического мониторинга и программы разведения сельскохозяйственных животных на основе молекулярно-генетических исследований генофонда пород, типов, линий и кроссов» - № Госрегистрации 01.200.1 10987.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследований доложены и обсуждены на ежегодных заседаниях ученого совета СНИИЖК в 2003-2005 гг., в ежегодных отчетах лаборатории иммуно генетики, биохимии и общей химии СНИИЖК в 2003, 2004, 2005 годах, на межвузовской конференции Ставропольского аграрного университета (СГАУ) в 2003 году; на Международной конференции в Дон ГАУ (2004), на научно-практической конференции по животноводству и кормопроизводству ГНУ СНИИЖК в 2005 году.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы: 3 статьи и одни методические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Диссертация включает в себя разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, содержащий наименование 143 работ отечественных и 83 работы зарубежных авторов, приложения. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 23 таблицами, 18 рисунками, 2 приложениями.
Молекулярно-генетические методы исследования полиморфизма ДНК
ДНК - технологии внесли существенный вклад в развитие целого ряда направлений классической генетики, в представления о структурно-фунциональной организации живой материи, нового подхода к пониманию окружающего мира. Бурному прогрессу ДНК - технологий способствовало то, что сразу же была осознана их огромная важность и перспективность в решении накопившихся проблем окружающей среды и разнообразных задач биологии и сельского хозяйства. Кроме того, впервые исследователям представилась возможность не только изучать механизмы жизнедеятельности организмов, но и сознательно планировать изменения в них (В.И. Глазко; В.Н. Балацкий; Л.А. Калашникова, 1998).
С развитием иммунологических и биохимических методов к концу 60 г. XX в. сформировалась биохимическая генетика популяций, открывшая недоступные ранее возможности изучения внутри- и межвидовой генетической изменчивости, решения широкого круга теоретических и прикладных проблем биологии. На основе нескольких сотен открытых иммуногенетических и биохимических маркеров, различающихся по локализации и функциям, была обнаружена скрытая ранее гигантская наследственная изменчивость (генетический полиморфизм), позволивший дать оценку основных популя-ционно-генетических параметров около 2000 видов животных, растений, микроорганизмов, а также человека (Ю.П. Алтухов и соавт., 2002).
Новый класс генетических маркеров появился в середине 80-х годов после открытия полиморфизма ДНК благодаря развитию методов молекулярной генетики - выделения, клонирования и разрезания (рестрикции) генов.
Изучение генетического полиморфизма стало одним из наиболее важных и плодотворных направлений как фундаментальной генетики, так и прикладных исследований. Ряд разработок в этой области успешно используют для повышения эффективности селекции сельскохозяйственных животных (В.Г. Шевченко, 1997; В.И. Глазко, Т.Н. Дымань и др., 2000).
Современные методы исследований ДНК и генов позволяют надежно регистрировать их полиморфизм. Результаты исследования полиморфизма ДНК и отдельных генов достаточно широко используются для повышения эффективности селекции. Они дают возможность определять с высокой степенью достоверности происхождение, типы генов, участвующих в формировании определенных видов продуктивности (В.П. Терлецкий, Н.В. Дементьева, Е.С. Усенбеков, 2001).
Наиболее эффективными оказались молекулярные методы, позволившие создать тест-системы на уровне продуктов генов (белковый полиморфизм), а позднее на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК). Более 25 лет наиболее широко использовались маркеры на основе белкового полиморфизма (В.И. Глазко, И.М. Дунин, Г.В. Глазко, Л.А. Калашникова, 2001).
Изучение полиморфизма ДНК животных позволяет выявлять различия в структуре генома между отдельными индивидуумами, определять происхождение, гетерозиготность и генетические расстояния между популяциями. Новые методы позволяют надежно идентифицировать как отдельные особи, так и целые группы животных, например, породы сельскохозяйственных животных (Н.В. Дементьева, В.П. Терлецкий, В.И. Тыщенко, А.Ф. Яковлев, 2003).
Последние разработки в области молекулярной генетики позволили значительно расширить набор ДНК - технологий, среди которых можно выделить следующие методы: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ или RFLP); анализ полиморфизма случайно ампли-фицированной ДНК (RAPD); анализ полиморфизма определенно амплифи-цированных фрагментов ДНК (AFLP) (В.И. Глазко, 1997).
ПДРФ. Классический метод анализа полиморфизма ДНК по длине рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorph і sm-RFLP) и широко использовался на ранних этапах исследований ДНК для идентификации и установления различий в генотипах животных на уровне вида.
Эффективность анализа иммуногенетических маркеров и полиморфных белков ограничивается экспрессируюшимися генами, например, полиморфизм молочных белков можно оценить только у лактирующих коров. Генетическое маркирование на уровне ДНК позволяет тестировать животных любого пола и возраста и оценивать полиморфизм некодирующих участков генома.
Материалы и методы исследований
Экспериментальная часть работы выполнялась с 2003 по 2005 год в ООО «Кисловодский» Предгорного района Ставропольского края. Объектом исследований стал крупный рогатый скот (первотелки и молодняк) черно-пестрой породы ленинградской селекции (помеси с голштинской породой разной кровности). Генетические, физико-химические и другие анализы проводились в лаборатории иммуногенетики, биохимии и общей химии Ставропольского научно-исследовательского института животноводства и кормопроизводства (СНИИЖК). Изучение технологических свойств молока и изготовление сыра с последующей оценкой его качественных показателей проводились в экспериментально-производственной лаборатории ФГУП Ставропольского научно-исследовательского института комплексного использования молочного сырья (НИИКИМ).
Для проведения научно-производственного опыта и оценки животных на носительство аллельных вариантов гена каппа-казеина было отобрано 304 головы крупного рогатого скота черно-пестрой породы. Из них первотелок -224, телят - 80 голов. В ходе всего эксперимента подопытные первотелки, и их потомство, содержались в одном стаде в одинаковых условиях кормления и содержания.
Генотипирование опытных животных проводили при помощи ПЦР -диагностики аллельных вариантов гена каппа-казеина. Из образцов крови первотелок, а в последующем, и их телят, выделяли ДНК с использованием набора реагентов DIAtom DNA Prep. Принцип выделения ДНК DIAtom DNA Prep основан на способности буфера с гуанидинтиоцианатом лизиро-вать клетки и солюбилизировать клеточный дербис. Из лизированных клеток ДНК сорбируется на NucIeoS, (суспензию сорбента) и затем отмывается от белков и солей спиртовым раствором.
Генотипирование 3 быков-производителей, принадлежащих ФГУП «Невское», проводили по образцам криоконсервированной спермы.
Выделение ДНК из криоконсервированной спермы быков-производителей проводили следующим образом. Сперму размораживали. В чистую пробирку объемом 1,5 мл вносили 300 мкл спермы, центрифугировали 5 минут при 4000 g. К осадку добавляли 1 мл промывочного раствора, суспендировали на вортексе до полного гомогенного состояния. Центрифугировали 5 минут при 4000 g. Удаляли супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку добавляли 400 мкл лизирующего реагента. Суспендировали на вортексе и термостатировали смесь при 65С 40 минут. В пробирку с лизатом, объемом 1,5 мл, вносили 20 мкл суспензии сорбента NucleoS . Пробирку ротировали 10 мин при 20 об/мин, центрифугировали 10 сек при 5000 g. Осторожно, не задевая осадка, удаляли надосадочную жидкость. К осадку добавляли 200 мкл лизирующего реагента, перемешивали на вортексе. Затем, к содержимому пробирки добавляли 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешивали переворачиванием 5-Ю раз и центрифугировали смесь 10 сек при 5000 g. Удаляли супернатант. К осадку добавляли 1 мл промывочного раствора, перемешивали на вортексе, центрифугировали 10 сек при 5000 g. Повторяли отмывание осадка солевым буфером и промывочным раствором. Затем выделение ДНК проводили аналогично методике выделения ее из крови.
Для амплификации фрагмента 4 экзона гена каппа-казеина использовали следующие праймеры (D. Denicourt et al., 1990):
Bocas A: 5 -ATAGCCAAATATATCCCAATTCAGT 3 Bocas B: 5 TTTATTAATA AGTCC ATG AATCTTG 3 Праймеры синтезированы в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Амплификацию проводили в объеме 31,5 мкл, содержащем 4,0 мкл ІхПЦР-буфера, по 2,5 мкл динуклеотидтрифосфатов, по 0,75 мкл каждого из двух праймеров, 1,0 мкл ДНК, 12,0 мкл бидистиллированной воды. Смесь прогревали 1 мин при температуре 95 С, охлаждали, вносили 0,5 мкл Tag-полимеразы, после чего наслаивали 10,0 мкл минерального масла. ПЦР включала следующие три этапа — денатурацию при 94 С 1 мин, отжиг прай-меров - при 62 С 1 мин и полимеризацию - при 72 С 1мин. Все три этапа повторялись 35 циклов. ПЦР проводилась на амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-технология», имеющего программное обеспечение.
Генотипирование популяции черно-пестрого скота по каппа-казеину
В настоящее время, особую актуальность приобретают исследования с использованием новых методов и приемов, в том числе и ДНК-диагностики, с целью выявления уникальных генов в качестве маркеров количественных и качественных признаков в селекции животных.
Методы диагностики полиморфизма гена каппа-казеина на основе ПЦР-ПДРФ просты в исполнении, достоверны и отличаются хорошей воспроизводимостью результатов. Они могут быть с успехом использованы для тестирования крупного рогатого скота в рамках популяционно-генетических исследований для сохранения генетического разнообразия, а также в качестве дополнительных критериев оценки животных.
Наличие фенотипических полиморфных вариантов белков молока было впервые обнаружено исследователями методом электрофореза в полиакри-ламидном геле. Так, было обнаружено несколько аллельных вариантов каппа-казеина, из них наиболее распространенными являются два - А и В (F. Grosclaude et al., 1972). Отличаются эти белки аминокислотными заменами в разных позициях, которые приводят к изменению свойств белковых молекул. Аллельные варианты А и В белка каппа-казеина отличаются двумя аминокислотными заменами и соответственно кодируются разными аллелями гена каппа-казеина.
Генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ) продуктов амплификации основано на изменении нуклеотидной последовательности в аллельных вариантах гена, что в свою очередь приводит к появлению или исчезновению сайтов рестрикции эндонуклеаз (D. Denicourt et al., 1990; S.J. Pinder, 1991). Определение аллельных вариантов гена каппа-казеина методом ДНК-диагностики позволяет анализировать генотипы животных любого пола и возраста непосредственно на уровне генома. В данной работе нами проведено исследование популяции крупного рогатого скота черно-пестрой породы (N=304) на наличие в геноме аллель-ных вариантов А и В каппа-казеина, ассоциированных с качеством молока и его технологическими свойствами.
Из образцов отобранного биоматериала, от 224 коров и 80 телят (кровь), а также от 3 быков-производителей (криоконсервированная сперма) черно-пестрой голштинской породы, были выделены и очищены препараты ДНК.
Для амплификации гена каппа-казеина использовались праймеры Bocas А и Bocas В. Праймеры синтезированы на основе нуклеотидной последовательности ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота и гомологичны высококонсервативным зонам этого гена. В результате ПЦР амплифицирует-ся фрагмент гена каппа-казеина с 10565 по 10589 нуклеотид. Продукт амплификации представляет собой фрагмент 4 экзона гена.
С помощью ПЦР, из всех препаратов ДНК коров, быков-производителей и телят получили специфические фрагменты гена каппа-казеина длиной 883 п.н.
Данные проведенного электрофоретического анализа всех проб ДНК указывают на идентичность длин полученных амплификатов во всех образцах, их гомогенность и высокую специфичность (рис. 6).
