Содержание к диссертации
Введение
1. Целлюлозосодержащее сырье и проблемы его переработки 7
1.1 Ресурсы полисахаридного сырья в России и Татарстане, перспективные для биотехнологической переработки 10
1.2 Технологические характеристики и аппаратурное оформление процессов гидролиза целлюлозосодержащего сырья 17
1.3 Технологические характеристики процессов ферментолиза целлюлозосодержащего сырья 25
2. Комплекс аппаратуры для исследования процессов гидролиза и ферментолиза целлюлозосодержащего сырья 34
2.1 Установка для исследования кинетики и энергетики низкотемпературного гидролиза целлюлозосодержащего сырья 36
2.2 Установка для исследования кинетики высокотемпературного гидролиза целлюлозосодержащего сырья 40
2.3 Установка для исследования кинетики и энергетики ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья 42
2.4 Эксплуатация и тиражирование установок комплекса по исследованию процессов гидролиза целлюлозосодержащего сырья 42
3. Материалы и методы исследования процессов гидролиза и ферментолиза растительного сырья 51
3.1 Гидролизующие агенты и растворы 51
3.2 Методы технохимического контроля 57
3.2.1 Определение содержания редуцирующих веществ по Бертрану 57
3.2.2 Титриметрический метод определения азота по Къельдалю 60
3.2.3 Методика определения содержания сухих веществ в растворах и осадках (определение концентрации биомассы весовым способом) 65
3.2.4 Фотоколориметрическое определение концентрации биомассы 69
4. Кинетика и эффективность процессов гидролиза и ферментолиза растительного сырья 71
4.1 Предобработка сырья 71
4.2 Выбор гидролизующих агентов 74
4.3 Кинетика низкотемпературного гидролиза растительного сырья 78
4.4 Кинетика высокотемпературного гидролиза растительного сырья 80
4.4.1 Оценка воспроизводимости экспериментов 80
4.4.2 Кинетические закономерности процесса высокотемпературного гидролиза соломы сернистой кислотой 83
4.4.3 Кинетические закономерности процесса высокотемпературного гидролиза отрубей сернистой кислотой 4.5 Кинетика процесса ферментолиза соломы 91
4.6 Оценка энергетических затрат в процессах деполимеризации растительного сырья 4.6.1 Удельные затраты энергии в процессах деполимеризации растительного сырья 97
4.6.2 Методические основы мониторинга препаратов целлюлолитических ферментов на основе оценки энергозатрат
4.7 Оценка степени рекуперации сернистого газа при гидролизе полисахаридного сырья сернистой кислотой 102
4.8 Питательные среды для биотехнологйческих процессов на основе гидролизатов соломы и отрубей 104
Заключение 107
Список использованных источников
- Технологические характеристики и аппаратурное оформление процессов гидролиза целлюлозосодержащего сырья
- Установка для исследования кинетики и энергетики ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья
- Титриметрический метод определения азота по Къельдалю
- Кинетические закономерности процесса высокотемпературного гидролиза соломы сернистой кислотой
Введение к работе
Актуальность работы. Возрождение крупнотоннажной промышленной биотехнологии в Российской Федерации непосредственно связано с освоением сырьевой базы на основе возобновляемого растительного сырья. Целлюлозосодержащее сырье в стране имеется практически в неограниченных количествах в виде древесины, соломы, твердых бытовых отходов и т.д. Однако его эффективное превращение в биологически усвояемые сахара – сложная задача, над которой работают научные коллективы во всем мире. При этом исследуются возможности использования непосредственно микроорганизмов, комплексов целлюлолитических ферментов, химических гидролизующих агентов для эффективного превращения непищевого сырья в усвояемые сахара.
В настоящее время отсутствует исследовательское технологическое оборудование, позволяющее на лабораторной стадии оценить технико-экономические характеристики, энергетические показатели соответствующих технологий, что затрудняет решение вопросов определения перспективы внедрения в производство получаемых научных результатов. Поэтому разработка научного оборудования для осуществления процессов деполимеризации целлюлозосодержащего сырья с возможностью исследования их кинетики и энергоемкости является чрезвычайно актуальной задачей.
Одним из наиболее дешевых и имеющихся в наличии видов целлюлозосодержащего сырья для крупнотоннажного производства энергоносителей, в частности топливного спирта, является солома. Масса производимой ежегодно соломы злаковых и крупяных культур в России составляет 80 – 100 млн. т. В республике Татарстан объем производства соломы достигает 6,6 млн. т. в год, в том числе ржаной соломы – 880 тыс.т в год. Это огромная потенциальная сырьевая база.
Наконец, существующая инфраструктура сельского хозяйства позволяет решить задачу доставки соломы на переработку при условии расположения перерабатывающего предприятия вблизи элеватора.
Учитывая низкую степень эффективного использования соломы зерновых культур в настоящее время, в работе основное внимание уделено проблеме осахаривания данного вида вторичного сырья.
Наконец, учитывая рост требований к ресурсо- и энергосбережению создаваемых технологий, актуальность работы состоит в технологическом решении по рекуперации гидролизующего агента, а также в энергетическом критерии мониторинга новых ферментных препаратов.
Экспериментальная часть работы выполнялась в рамках гранта Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере "Разработка технологического регламента на выращивание чистой культуры дрожжей» (государственный контракт №8187р/7406 от 01.08.2010).
Целью настоящей работы является сравнительное исследование кинетики химического и ферментативного гидролиза целлюлозного сырья на основе удельных энергетических затрат и оценка качества гидролизатов в процессах культивирования сахаромицетов.
В качестве основного объекта исследования выбраны процессы гидролиза и ферментолиза соломы зерновых культур, как одного из перспективных видов возобновляемого сырья.
В соответствии с поставленной целью были решены следующие задачи:
- разработаны экспериментальные установки, исследована кинетика процессов гидролиза и ферментолиза целлюлозосодержащего и крахмалистого сырья на примере соломы и отрубей зерновых культур;
- экспериментально оценены удельные затраты энергии в процессах гидролиза и ферментолиза соломы зерновых культур, в том числе на нагрев и механическое перемешивание гидролизуемой массы.
Научная новизна:
- экспериментально оценены параметры процессов гидролиза соломы и отрубей зерновых культур разбавленной сернистой кислотой при варьировании режимных параметров;
- оценены параметры процесса гидролиза соломы, предложенного в качестве базового для сравнения энергетической эффективности ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих видов вторичного сырья и позволяющего осуществлять мониторинг ферментных препаратов, выводимых на рынок биотехнологической продукции;
- впервые экспериментально показана возможность рекуперации сернистого газа в процессах гидролиза соломы за счет тепла, запасенного в гидролизате;
- предложен энергетический критерий сравнительной оценки альтернативных процессов деполимеризации целлюлозосодержащего сырья, апробированный на примере использовании сернистой кислоты и ферментов фирмы Genencor International;
- предложен и научно обоснован комбинированный состав гидролизатов для приготовления сред, используемых при наращивании биомассы сахаромицетов.
Практическая значимость работы.
Создан комплекс лабораторного оборудования для исследования процессов химического и ферментативного гидролиза возобновляемого целлюлозосодержащего и полисахаридного сырья. Оборудование позволяет осуществлять процессы деполимеризации в широком диапазоне температур: от 30 С до 190 С с возможностью определения их кинетических и энергетических характеристик. Предусмотрена регистрация затрат тепловой и механической энергии при осуществлении указанных процессов. Осуществлено сравнительное исследование процессов гидролиза и ферментолиза соломы зерновых культур, продемонстрировавшее работоспособность созданного оборудования и его соответствие поставленным задачам. Комплекс оборудования внедрен в учебный процесс и используется в исследованиях, проводимых в лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» ФГБОУ ВПО КНИТУ (г. Казань). Предложенный энергетический критерий сравнительной оценки процессов гидролиза может быть использован на стадии ТЭО проектируемых производств, в которых осуществляются гидролитические процессы деполимеризации целлюлозосодержащего сырья. Разработанная аппаратура и методика исследования позволяют осуществлять мониторинг новых ферментных препаратов.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии, производства и переработки продукции сельского хозяйства» (Йошкар-Ола, 2009г.), научно-практической конференции «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию»: (Казань, 2009г), X - ХI Международных конференциях молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009-2010г.г.), XIII Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Полимеры: Синтез исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» – V Кирпичниковские чтения (Казань, 2009г), Республиканскаой школе студентов и аспирантов «Жить в XXI веке» (Казань 2009г.), Международной конференции «Катализ для переработки возобновляемого сырья: топливо, энергия, химические продукты» (Новосибирск, 2010г.), V-VI Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010-2011г.г.), на ежегодных научно-технических конференциях ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» (2009-2012 гг.).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы 8 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, и 11 докладов на всероссийских и международных конференциях и других публикаций.
Личный вклад автора. В диссертации обобщены результаты экспериментальных работ, в которых автор принимал непосредственное участие. Личный вклад автора заключается в комплексировании технических средств исследовательского комплекса, позволяющего реализовать предложенный автором подход к анализу эффективности гидролизующих агентов на основе величины удельных энергозатрат, в проведении экспериментальных исследований процессов гидролиза и ферментолиза отходов зернового хозяйства и процессов культивирования сахаромицетов на средах с гидролизатами соломы, в обсуждении и представлении результатов работы на конференциях, а также в подготовке их к публикации. Соавторы не возражают против использования результатов исследований в материалах диссертации.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка использованной литературы и приложения. Материал изложен на 129 страницах текста и содержит 22 таблицы и 39 рисунков. Список литературы включает 148 источников.
Технологические характеристики и аппаратурное оформление процессов гидролиза целлюлозосодержащего сырья
В условиях рыночной экономики на первый план выходят задачи повышения конкурентоспособности отечественного производства, для чего необходимо увеличить эффективность использования сырья и энергии, в том числе и за счет внедрения современных биохимических и микробиологических технологий [24]. Рыночные конкурентные отношения неизбежно побуждают вести поиск технологических решений производства биопродуктов, обеспечивающих снижение производственных затрат, в частности экономию сырья и энергоресурсов. Особенно это актуально для производства топливных и технических спиртов на основе зерна 4 категории [27].
Одной из проблем спиртового производства является высокая стоимость крахмала, расходуемого не только на производство целевого продукта, но и на наработку биомассы продуцента - спиртовых дрожжей. Известен ряд подходов к экономии сырья на стадии выращивания посевной культуры дрожжей, например переход на аэробную дрожжегенерацию [28 -30]. Однако это позволяет экономить только 5 % крахмала [31]. Замена на стадии дрожжегенерации зернового сусла на гидролиза соломы и отрубей позволит экономить до 12 - 15 % зерна с одновременным повышением интенсивности процесса брожения за счет более плотного засева [32].
Обогащение барды дешевыми гидролизатами органических отходов может в два раза снизить удельные энергозатраты при ее переработке в кормовые белковые концентраты [33].
Биоконверсия возобновляемого растительного сырья в топливо, кормовые и пищевые продукты, полупродукты для химической и микробиологической промышленности рассматривается в настоящее время как одно из ключевых направлений биотехнологии. Повышение рентабельности производств биопродуктов на основе гидролизатов возможно только при переходе на комплексный вариант переработки сырья, в том числе вторичного, с выпуском продуктов фармацевтического, пищевого и кормового назначения при одновременном сокращении отходов за счет создания малоотходных технологических процессов [34 - 36].
Определяющей технологической стадией процесса превращения непищевого сырья, включая отходы сельского хозяйства, в биопродукты является стадия осахаривания. Она может осуществляться с помощью кислот, щелочей или ферментов [17].
Несмотря на интенсивные разработки в области ферментных препаратов, все еще не создано достаточно конкурентных видов целлюлаз. И потому сложность ферментации целлюлозосодержащего сырья является основным барьером для его широкого использования [14]. А задача мониторинга товарных ферментов, поступающих на рынки, а также опытных партий ферментных препаратов является как никогда актуальной.
1.2 Технологические характеристики и аппаратурное оформление процессов гидролиза целлюлозосодержащего сырья
Существующая технология кислотного гидролиза древесного сырья в периодически действующих гидролизаппаратах, разработанная еще в 40-е годы, не отвечает современным требованиям ни в части технологической, ни в вопросе энергопотребления, ни в экологическом отношении. [37]. Это явилось одной из причин свертывания гидролизной промышленности в Российской Федерации. Однако, наличие значительных ресурсов возобновляемого целлюлозного сырья обуславливает возвращение к решению проблем осахаривания целлюлозосодержащего сырья и отходов. И вряд ли следует огульно отрицать перспективность применения гидролитических процессов. Пока еще, как будет показано ниже, нет данных, свидетельствующих о достаточном преимуществе ферментных препаратов.
Процессы гидролиза могут быть классифицированы по типам применяемых химических агентов [38]: - гидролиз разбавленными кислотами - перколяционный, высокотемпературный, автогидролиз; - гидролиз концентрированными кислотами - двухфазный гидролиз серной кислотой (на первой фазе гидролиз концентрированной серной кислотой с непрерывной отдувкой фурфурола паром, на второй фазе гидролиз целлолигнина разбавленной серной кислотой перколяционным методом) и гидролиз галогенсодержащими кислотами; - гидролиз солями: перколяционный, экструзионная обработка с солями; - гидролиз газообразными агентами: предгидролиз в парах СОг, гидролиз в парах S02; - щелочная делигнификация, включая методы выделения целлюлозы, в том числе с использованием парового взрыва.
Гидролиз целлюлозосодержащего сырья в большинстве случаев применялся для производства гидролизного спирта. Для этого используются отходы лесопиления и деревообработки, а также отходы от переработки сельскохозяйственного сырья (жмых, солома, и т.д.). Существует несколько вариантов реализации гидролитических процессов с применением концентрированных и разбавленных кислот. Процессы перколяционного гидролиза (с постоянным отводом раствора Сахаров) проводят в гидролизаппаратах периодического действия. Это полые аппараты с перфорированной центрально-подающей трубой для подачи раствора серной кислоты в толщу сырья, с фильтрующими лучами для выдачи гидролизата и выхлопным устройством для «выстрела» лигнина. Выход РВ в процессе перколяционного гидролиза составляет 41 - 42% от абсолютно сухого древесного сырья смешанных пород, а при переработке древесины хвойных пород выход РВ от абсолютно сухого сырья составляет 37 - 38%.
Процессы перколяционного гидролиза имеют ряд преимуществ, состоящих в следующем: - процессы гидролиза гемицеллюлоз, целлюлозы и фильтрации гидролизата от гидролизуемого сырья и лигнина идут последовательно в одном аппарате; - объединение гидролизатов гемицеллюлоз и целлюлозы позволяет создавать питательные среды различного состава и назначения и обеспечивать наиболее высокий выход продукции; - в процессе подготовки гидролизата за счет снижения давления и самоиспарения воды и летучих компонентов гидролизатов возможна рекуперация тепла, а также очистка гидролизата от летучих примесей; - технологические режимы перколяционного гидролиза и технологические режимы подготовки нейтрализованного гидролизата позволяют обеспечить выход моносахаридов от абсолютно сухого сырья 35 - 39% [39, 40]. В то же время процесс перколяционного гидролиза имеет ряд недостатков: это низкая производительность гидролизаппарата по сахарам (0,045 - 0,05 т/м -ч); высокое значение гидромодуля (1:14) не позволяющее получать растворы моносахаридов с концентрацией более 3,0 % масс. [41], что при дальнейшем получении биосинтетических продуктов ведет к сбросу большого количества жидких отходов (отработанные фильтраты культуральных жидкостей с ХПК = 5000 - 8800 мг 02/л) на очистные сооружения.
Кроме того промышленные процессы гидролиза целлюлозосодержащего сырья, например, реализуемые на Кировском гидролизном заводе, требуют гидромодуля 14 - 17. При меньшем гидромодуле выход РВ заметно снижается. Но при этом, как указано выше, получаются низкоконцентрированные растворы Сахаров, переработка которых экономически мало рентабельна. Выход из этой ситуации нам видится в организации комплексной переработки сырья. В данном случае в двустадийном процессе с последующей переработкой негидролизованных остатков в другие продукты. Поэтому в настоящей работе мы искали величину гидромодуля, обеспечивающую получение гидролизатов с концентрацией РВ 5 - 6 % масс. Наконец, при проведении процессов гидролиза необходимо учитывать следующие требования: уменьшение теплоэнергозатрат, безотходность производства, увеличение выхода и повышение качества промежуточных продуктов гидролиза, простота аппаратурного оформления, возможность автоматизации и компьютеризации.
Наиболее перспективным считают одно- и двухступенчатый гидролиз в аппаратах непрерывного действия с механической обработкой сырья [42]. Для этого используют экструдеры и дефибраторы, в которых за счет механической обработки и парового взрыва интенсифицируют процесс гидролиза полисахаридов растительного сырья. Несмотря на увеличение расхода электроэнергии авторы говорят о снижении суммарных затрат на 1 т редуцирующих веществ [43].
Существует несколько технологических схем получения биоэтанола с использованием экструдеров и дефибраторов. Наиболее простой является схема с использованием двухчервячного экструдера и высокотемпературного режима гидролиза древесных опилок. Этот способ имеет следующие основные преимущества по сравнению с перколяционным гидролизом: 1) снижение расхода пара при быстром нагреве гидролизуемого сырья за счет сил трения и давления; 2) снижение расхода воды в процессе гидролиза, что позволяет получить реакционную смесь с содержанием сухих веществ 33%, фильтрат водного экстракта с концентрацией моносахаридов 10% (общий гидромодуль 1:3); 3) при высокотемпературном гидролизе (Т = 237С, Р = 2,8 МПа, концентрация серной кислоты 3%, время 25 сек) снижается доля распада и каломелизации моносахаридов;
Установка для исследования кинетики и энергетики ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья
Технические характеристики привода устройства перемешивания одинаковые для установок низкотемпературного гидролиза и ферментолиза: - стойка привода в напольном исполнении с поддоном под аппарат из нержавеющей стали; - наличие регулятора скорости вращения в пределах 50 - 1700 об/мин; - электродвигатель постоянного тока; - возможность измерения падения напряжения на двигателе, тока в цепи питания двигателя; - цифровая индикация величины скорости вращения, напряжения и тока; - световая индикация наличия напряжения в сети; - световая индикация включения блока управления двигателем.
В современных биотехнологических процессах необходимо регистрировать и анализировать множество быстроизменяющихся факторов (концентрации субстрата, биомассы и продукта в культуре, рН, температура, парциальное давление кислорода и др.) [114, 115].
Активность ферментов зависит от рН раствора, в котором протекает ферментативная реакция. Для каждого фермента существует значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность. Отклонение от оптимального значения рН приводит к понижению ферментативной активности. Изменение рН среды приводит к изменению степени ионизации кислотных и основных групп как активного центра фермента, так и самого субстрата. Следовательно, изменение рН влияет на сродство субстрата к активному центру фермента и на каталитический механизм реакции. Обычно зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды имеет колоколообразную форму (рис. 2.7), поскольку для каждого фермента существует свое оптимальное значение рН, при котором фермент проявляет наибольшую каталитическую активность (оптимум рН фермента). Значение рН в оптимуме отвечает наилучшему связыванию субстрата ферментом и наибольшей скорости катализа [116]. rA
Для проведения процессов ферментолиза измельченных растительных (целлюлозо- и крахмалсодержащих) материалов ферментными препаратами была разработана система управления процессами ферментолиза растительного сырья [ИЗ, 117], позволяющая управлять процессом как в ручном режиме, так и в автоматическом, задавая параметры протекания процесса с помощью управляющей программы. Основной задачей автоматизированной системы управления (АСУ) лабораторными биореакторами является интеллектуальное поддержание параметров среды на заданном уровне.
В работе применялись следующие приборы и средства измерения:
Мультитест ИПЛ-513 - комбинированный прибор имеющий в своем составе 2 потенциометрических канала повышенной точности. Диапазон измерения: рН от -1 до 20 ед. рН; растворенного кислорода от 0 до 20 мг Ог/дм3; температуры от 0 до 100С. Предел допускаемой основной абсолютной погрешности измерения: 1) рН±0,02 мг/дмЗ; 2) концентрации растворенного кислорода ±0,2 мг/дм3; 3) температуры ± 0,3. Тип интерфейса RS-232.
Для программной реализации управления процессом ферментолиза выбран пакет GENIE 3.04, разработанный фирмой Advantech [118], который является инструментальным средством для создания программного обеспечения сбора данных и оперативного диспетчерского управления (SCADA) .
Драйверы ввода/вывода, входящие в комплект поставки GENIE, обеспечивают поддержку всех аппаратных средств промышленной автоматизации фирмы Advantech, включая модули сбора данных и управления. Перечень подключенных устройств создаваемой системы (табл. 2.2), отображается в окне устройств ввода/вывода.
Основным параметром, управление которым осуществляется в ручном и автоматическом режиме, является уровень рН среды. Основной задачей системы управления является поддержание значения рН на определенном заранее установленном значении, называемом уставкой рН. Для настройки насосов используется понятие дозы, которое включает в себя время дозирования и паузу после дозирования. Таким образом оператор-технолог может устанавливать не только продолжительность дозирования в процентном соотношении, но и точность работы того или иного насоса (режим работы). Например, дозирование может быть установлено «10 сек. через 50 сек» или «1 сек через 5 сек». Очевидно, что в процентном соотношении и в том и в другом случае время работы насоса будет одинаковым, но если в первом случае насос подает большие порции через большие промежутки времени («доливной» режим), то во втором - малые дозы через малые промежутки времени («импульсный» режим).
Использованная система автоматического управления и сбора информации осуществляет управление всеми материальными потоками. Управление осуществляется в ручном и автоматическом режимах. Общий вид интерфейса программы представлен на рисунке 2.8. В ручном режиме задействованы только контрольно-измерительные алгоритмы и блокировки оборудования при возникновении аварийных ситуаций. В автоматическом режиме поддержание pi 1 выполняется автоматически с использованием закона двухпозиционного (On/Off) регулирования.
Алгоритм двухпозиционного регулирования состоит в том. что управляемый объект переводится регулятором в одно из двух СОСТОЯНИЙ (включен или выключен) в зависимости от соотношения между измеряемым значением сигнала обратной связи. уставкой и порогами включения/выключения.
Аварийная сигнализация реализована как в ручном, так и в автоматическом режиме. Программа работает в трех режимах: в норме, выше нормы, ниже нормы. Если текущее значение рН выше верхнею предела, то автоматически включается подача кислоты на заданное время. В ручном режиме подача кислоты и щелочи осуществляется при нажатии соответствующих кнопок «І Іодача кислоты» и «Подача щелочи» 11 19. В программе предусмотрено ведение протокола дозирования титрантов: время подачи, счетчик доз подачи (количество поданных доз) и рассчитывается общее количество поданного титранта в граммах. Ведется запись тренда значений рН. Добавление фермента осуществляется но достижению заданного значения рН (после завершения вывода системы на заданный режим), рис.2.9.
Технически дозирование жидких сред реализовано с использованием перистальтических насосов со свободным натяжением рабочих трубок внутреннего диаметра 2-3 мм, Свободное натяжение рабочих трубок несколько уменьшает объем единичной дозы (количество жидкости, подаваемое за один оборот колеса перистальтического насоса-дозатора), но предотвращает вытягивание трубки при прокатке роликов вдоль прижимной поверхности (характерно для большинства серийно выпускаемых перистальтических насосов). Это уменьшает погрешность дозирования и обеспечивает стабильный объем дозы в течение всего процесса (до нескольких суток). 2.4 Эксплуатация и тиражирование установок комплекса по исследованию процессов гидролиза целлюлозосодержащего сырья
Комплекс введен в эксплуатацию и используется в научных исследованиях и учебном практикуме, реализуемых лабораторией «Инженерные проблемы биотехнологии» Казанского национального исследовательского технологического университета. Техническая документация на экспериментальный образец комплекса передана в малое предприятие ООО «Биотехконсалтинг» для организации его серийного производства. На основании этой документации осуществлен выпуск малой опытной партии лабораторного оборудования (2 гидролизера и 4 ферментолизера). Комплекс отличается максимальным использованием отечественных не дорогих приборных средств и комплектующих изделий и предназначен для оснащения учебных лабораторий вузов и организации мониторинга представленных на рынке и вновь разрабатываемых ферментных препаратов. Акты о тиражировании и использовании установок в Казанском национальном исследовательском технологическом университете прилагаются.
Титриметрический метод определения азота по Къельдалю
Необходимость определения концентрации биомассы микроорганизмов определяется применяемым методом оценки качества гидролизатов по скорости роста сахаромицетов (применялась культура спиртовых дрожжей Saccaromyces cerevisiae, раса 1986).
Концентрацию биомассы определяют высушиванием до постоянного веса осадка, полученного после фильтрации определенного количества культуральной жидкости, определяемого весовым методом [136]. Весовой метод относится к прямым методам измерений [137].
В работе использовался влагомер весовой МХ-50, предназначенный для измерения влажности (массовой доли влаги) твердых, монолитных, сыпучих, пастообразных материалов, водных суспензий и неводных жидкостей.
Влагосодержание можно измерить методом нагрева, методом Карла Фишера, диэлектрическим методом, методом инфракрасной абсорбции, методом нейтронного анализа или кристаллической осцилляции. Из перечисленных методов наиболее часто применяемыми в лабораторных условиях являются методы нагрева и сушки, а также Карла Фишера. Методы инфракрасной абсорбции и диэлектрический подходят для процессов обработки образцов гидролизатов. Метод нагрева предполагает, что уровень влагосодержания рассчитывается по весу воды, выпаренной из твердого или жидкого образца после его нагревания в течение некоторого времени при температуре равной или превышающей температуру испарения воды. Скорость потери веса сначала растет по мере нагрева образца, достигая некоторого постоянного значения, а затем, по мере испарения влаги, стремится к нулю. Образец может пиролизоваться или испаряться в зависимости от его характеристик, а значит, то, что испаряется - это не обязательно вода.
Помимо всего прочего анализаторы влажности, использующие метод нагрева, удобны в работе, благодаря простоте и ясности их принципа действия, а также небольшому размеру. Их эксплуатация и обслуживание не требуют больших затрат, что делает возможным использование этих приборов широким кругом пользователей, тестирующих различные виды образцов. Диапазон измерений - от 0.01/ 0.1% до 100%. Таким образом, даже образцы с влажностью близкой к 100% могут быть измерены легко и точно. Анализаторы влажности, реализующие принцип нагрева, в качестве источника тепла могут использовать галогеновую лампу, инфракрасную лампу, защищенный нагреватель или микроволновый нагреватель. Нагреву подвергается проба образца, находящаяся на электронных весах, которые взвешивают пробу до и после нагрева, чтобы определить потерю влаги. Следовательно, электронные весы должны использовать технологию, которая не допускает нагрева датчика нагрузки и таким образом предотвращает дрейф.
Окончание измерений Стандартный протокол измерения приведен в таблице 3.2. Таблица 3.2. - Стандартный протокол измерения влажности прибора МХ- Входные параметры Значение параметров
Оптическая плотность или мутность культуральной жидкости пропорциональна массе клеток при отсутствии других взвешенных частиц [138, 139]. Применение данного метода представляет собой простой, быстрый и малозатратный путь для оценки массы клеток в оптически прозрачной среде. Биомассу дрожжевой суспензии определяли с помощью фотоэлектроколориметра (КФК-2). На длине волны X = 540 нм, выделенной светофильтром, измеряли оптическую плотность клеточной суспензии и затем по градуировочной кривой определяли концентрацию биомассы дрожжей [140].
В световой поток поочередно помещали контрольную кювету с фильтратом культуральной жидкости, относительно которого проводили измерения, и кювету с исследуемой дрожжевой суспензией. Фиксировали показания регистрирующего прибора в единицах оптической плотности. Измерение проводили в трех последовательностях и результат определяли как среднее арифметическое из полученных значений.
Кинетические закономерности процесса высокотемпературного гидролиза соломы сернистой кислотой
Снижение концентрации сернистой кислоты ниже 1% масс, приводит к смещению максимума концентрации РВ. При 150 С и изменении концентрации сернистой кислоты в пределах 0,59 - 1,18 % масс, максимум концентрации РВ в фугате гидролизата соломы достигается соответственно через 70 и 55 минут после начала процесса гидролиза соломы (рис.4.11).
При более высоких температурах (160 С - 170 С соответственно) максимумы концентрации РВ достигаются примерно через 35 минут (рис.4.12, рис.4.13).
При температуре 170 С зависимость скорости накопления РВ в среде от концентрации кислоты исчезает (рис.4.13), что связано, по-видимому, с десорбцией сернистого газа из жидкой фазы и отсутствием перемешивания гидролизуемой массы внутри капсул. При этом скорость процесса гидролиза определяется фактически удельной поверхностью раздела фаз «газ-жидкость» и в данном частном случае оказывается одинаковой для выбранных концентраций кислоты. При меньших температурах процессы парообразования, диффузии и собственно гидролиза более «разбалансированы» и графики динамики концентрации РВ при варьировании содержания гидролизующего агента расходятся (рис.4.11, рис.4.12). При подъеме температуры выше 170 С возрастает скорость карамелизации и распада Сахаров, что приводит к снижению достигаемого значения концентрации РВ (максимум РВ снизился до 3,7 %). Это согласуется и с известными данными по скорости распада глюкозы [40]. При этом значимой зависимости накопления РВ в среде от концентрации сернистой кислоты в диапазоне 1,18 - 1,77 % масс, не наблюдается (рис.4.14).
При температуре 180 С процесс распада Сахаров возрастает, а концентрация сернистой кислоты падает вследствие перехода диоксида серы в паровую фазу. Скорость гидролиза при этом остается практически такой же, как и при 170 С, т.к. площадь поверхности контакта фаз не изменяется. А скорость распада Сахаров возрастает, что обусловлено в основном действием повышенной температуры [40, 120]. При достаточной концентрации сернистой кислоты (более 1 % масс.) различие в накоплении редуцирующих веществ при варьировании температуры в диапазоне 150 - 180 С незначительно.
Интересным фактом является зависимость концентрации РВ от концентрации кислоты в области ее малых значений. Скорее всего, это объясняется тем, что доля кислоты, химически связываемая в процессах гидролиза при низкой первоначальной концентрации кислоты, является значительной. И при высоких температурах (выше 170 С) концентрации гидролизующего агента становится недостаточно для компенсации скорости карамелизации и распада Сахаров. То же самое наблюдается при гидролизе древесины [40, 120].
В проведенных исследованиях высокотемпературного гидролиза соломы редуцирующие вещества составляли около 31 % от общей массы растворимых веществ (таблица 4.4). Этот факт говорит о том, что, по-видимому, значительная часть Сахаров в полученных гидролизатах представлена дисахаридами и декстриноподобными веществами. Поскольку метод Бертрана дает нам условную концентрацию моносахаров, пропорциональную количеству альдегидных и кетонных групп.
Во всех экспериментах высокотемпературного гидролиза соломы наилучшие результаты достигнуты при концентрации сернистой кислоты около 1,2 % и при температуре 160 - 170 С (рис.4.12, рис.4.13). При этом оптимальная продолжительность процесса гидролиза близка к гиперболической зависимости от температуры (рис.4.16). При этом в диапазоне температур, превышающих 165 С , зависимость оптимальной продолжительности процесса гидролиза от температуры практически исчезает. Это еще раз подтверждает ограничение скорости гидролиза наличной поверхностью контакта фаз «пар-жидкость».
Результаты экспериментов по гидролизу отрубей сернистой кислотой представлены в таблице 4.5. Во всех экспериментах использовался раствор сернистой кислоты с концентрацией 4,03 % масс. Как следует из данных, представленных в таблице 4.3, характер зависимости максимальной концентрации редуцирующих веществ от концентрации кислоты носит экстремальный характер (рис.4.17). Причем максимум достигается при концентрации кислоты около 1,2 % масс.
Динамика концентрации РВ носит экстремальный характер и зависит от температуры процесса (рис.4.18), причем оптимальной является температура 160 С (рис. 4.19). Интересным фактом является и то, что оптимальной температурой для гидролиза зерна также является 160 С [146].
Как следует из рассмотрения зависимостей, представленных на рис. 4.18, происходит нарастание скорости распада Сахаров уже при 170 С [112]. Очевидно, вследствие того, что концентрация РВ, достигаемая в случае гидролиза отрубей, в 1,5 раза выше, чем в случае гидролиза соломы, а скорость распада Сахаров пропорциональна их концентрации и удваивается при увеличении температуры примерно на 10 С.
Таким образом, закономерности процессов гидролиза соломы и отрубей качественно идентичны [27]. Однако, вследствие наличия в составе отрубей относительно легко гидролизуемого крахмала, скорость нарастания концентрации Сахаров в процессах гидролиза отрубей при идентичных режимных параметрах выше, чем в процессах гидролиза соломы. Соответственно, выше примерно в 1,5 раза и достигаемая концентрация Сахаров ( 6,3 % масс, против 4,2 % масс).
Проведены исследования процессов ферментативного гидролиза соломы жидкими целлюлолитическими ферментными препаратами фирмы Genencor International PS АОЗ 143-1.1 EN Optiflow RC 2.0 и PS A03197-1.0EN Acellerase CB100 (с активностью целлюлазы 6200-7580 ед/г) [147, 148].
Модельные эксперименты для изучения ферментативной кинетики осуществляли, используя в качестве источника целлюлозы бумагу и вату. В экспериментальных процессах ферментолиза использовалась предварительно размолотая, просеянная и просушенная до постоянной величины в сушильном шкафу при температуре 120 С в течение 2 часов. Солома предварительно запаривалась в автоклаве при избыточном давлении 0,05 -0,1 МПа в течение 0,5 - 1 часа [142].
Процессы ферментолиза проводили в соответствии с характеристикой применяемых ферментных препаратов при поддержании активной кислотности в диапазоне 4,9-5,0 ед. рН и температуре 49С. Длительность процессов ферментолиза составляла 7-10 часов [113]. Исследования кинетики и стехиометрии реакций ферментативного гидролиза дисперсных твердофазных субстратов растительного происхождения проводили в качалочных колбах объемом 250 мл на качалке со скоростью встряхивания 220 мин" с термостатированием и в лабораторном ферментолизере с автоматизированным регулированием рН и термостатированием.
В качалочных колбах были проведены процессы ферментолиза соломы при различных концентрациях ферментного препарата PS A03197-1.0EN Acellerase СВ100. Результаты эксперимента приведены в таблице 4.6.
Результаты экспериментов в качалочных колбах отличаются чрезвычайно большим разбросом данных. Двукратное изменение концентрации фермента практически не сказывается на кинетике и выходе Сахаров, что, очевидно, не может соответствовать действительности.
Похожие диссертации на Эффективность процессов осахаривания соломы и оценка качества гидролизатов для культивирования сахаромицетов
