Содержание к диссертации
Введение
Глава І Общие принципы биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения
1.1. Современные представления о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения 11
1.2. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения для коррекции критических состояний организма 16
Глава 2 Состояние воды и биохимические характеристики тканей животного происхождения при терминальных состояниях организма 21
2.1. Общие закономерности взаимодействия воды с биополимерами тканей 21
2.2. Роль воды в регуляции биологических процессов 28
2.3. Изменение биохимических характеристик тканей при терминальных состояниях 37
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3 Материалы и методы исследования 45
3.1. Материалы исследования 45
3.2. Методика применения He-Ne лазера 46
3.3. Акваметрические и калориметрические методы определения содержания воды в биополимерах 49
3.3.1, Титриметрическое определение воды с
реактивом К.Фишера 49
3.3.2. Калориметрический метод оценки состояния
воды в тканях экспериментальных животных 50
3.4. Биохимические методы исследования 51
3.4.1, Определение уроновых кислот 51
3.4.2, Определение супероксид-перехватывающей активности 52
3.4.3, Определение продуктов окисления липидов 53
3.5. Статистическая обработка результатов 53
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 4 Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на состояние воды и биохимические характеристики миокарда и печени животных при массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.) 54
4.1. Особенности состояния воды в тканях животных при массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.) 54
4.2. Органопротекторное действие низкоинтенсивного лазерного излучения при массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.) 60
4.3. Влияние НИЛИ на биохимические характеристики тканей при массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.).... 63
4.3.1. Корригирующее действие НИЛИ на уровень ПОЛ в тканях животных при массивной кровопотере 63
4.3.2. Влияние НИЛИ на содержание уроновых кислот в миокарде и печени при массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.) 68
Глава 5 Исследование возможности лазерной коррекции состояния воды и биохимических характеристик миокарда и печени при массивной кровопотере (АД 25 мм рт. ст., преатональное состояние) 71
5.1. Влияние лазера на состояние воды в тканях животных при массивной кровопотере 71
5.2. Влияние НИЛИ на биохимические характеристики тканей животных при массивной кровопотере (АД 25
мм рт. ст.) 76
Глава 6 Лазерная коррекция постреанимационных изменений состояния воды и биохимических характеристик тканей животных (АД 40 мм рт. ст., АГ2 ч) 19
6.1. Закономерности изменения различных форм воды в миокарде и печени в постреанимационном периоде 79
6.2. Закономерности изменения биохимических характеристик миокарда и печени в постреанимационном периоде 85
6.3. Лазерная коррекция постреанимационных изменений содержания различных форм воды и уроновых кислот в тканях 89
Глава 7 Оценка эффективности использования НИЛИ для коррекции постреанимационных изменений состояния воды и биохимических характеристик тканей после кровопотери (АД 25 мм рт. ст., преагональное состояние) 94
7.1. Закономерности изменения различных форм воды в миокарде и печени в постреанимационном периоде и при действии НИЛИ 94
7.2. Закономерности изменения биохимических характеристик в миокарде и печени в постреанимационном периоде и при действии НИЛИ 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110
- Современные представления о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения
- Общие закономерности взаимодействия воды с биополимерами тканей
- Материалы исследования
Введение к работе
Актуальность исследования. Многообразие биологических эффектов, направленных на мобилизацию компенсаторных реакций организма и широта терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) обусловили его применение во многих областях медицины [27,56,75,80,90,115]. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что НИЛИ может быть эффективным средством профилактики морфофункциональных и метаболических нарушений в организме, наблюдаемых при массивной кровопотере [84,86,95,172]. При критических состояниях в организме возникают значительные гемоциркуляторные нарушения, создающие предпосылки для изменения водно-электролитного обмена и биохимических показателей тканей организма [101,128,268]. Среди ключевых механизмов патогенеза при массивной кровопотере нарушению состояния воды в организме придается особое значение. Как известно, вода является обязательной составляющей всех биологических систем и согласно существующим представлениям воздействует на формирование и стабилизацию структуры макромолекул биополимеров, биомембран и более сложных надмолекулярных образований [7,124]. Сдвиги соотношения свободной и связанной воды в тканях могут в значительной степени отражать изменения функционального состояния организма, позволяют вскрыть механизмы развития некоторых патологических состояний и дать научное обоснование методов диагностики и коррекции метаболических нарушений, возникающих при этом [110,136,181]. Существенную роль в развитии критических состояний, в том числе острой массивной кровопотери, играет активация процессов перо кс ид ного окисления липидов (ПОЛ), которые оказывают повреждающее действие на все компоненты клеточных мембран [101,246]. Известно так же, что по мере увеличения тяжести кровопотери в организме происходит последовательное переключение биоэнергетического обеспечения клеток с углеводов на продукты жирового обмена [120].
Однако, состояние воды и взаимосвязь процессов гидратации тканей с изменением содержания продуктов ПОЛ и уроновых кислот при массивной кровопотере, постреанимационном периоде и при использовании НИЛИ не изучена. Несмотря на то, что в последние десятилетия проводятся интенсивные и разносторонние исследования возможности использования лазера для коррекции патологий, развивающихся при различных заболеваниях, до сих пор остается недостаточно изученным вопрос о корригирующем действии НИЛИ на организм при массивной кровопотере.
Изучение механизмов изменения таких параметров, как баланс свободной и связанной воды, содержание ПОЛ и продуктов углеводного обмена в миокарде и печени при кровопотере и действии лазера позволяет дать научное обоснование для использования НИЛИ в качестве одного из методов биомедицинской технологии восстановления жизненных функций организма при массивной кровопотере и помочь в выборе оптимальных условий его применения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование низкоинтенсивной лазерной коррекции состояния организма животных при массивной кровопотере.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
Оценить возможность использования низкоинтенсивного лазерного излучения в качестве биотехнологического метода восстановления жизненных функций организма при массивной кровопотере;
Исследовать влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на содержание свободной, связанной воды и биохимические характеристики тканей животных в преагональном состоянии (с артериальным давлением АД 25 мм рт. ст.);
Изучить особенности состояния различных форм воды, содержание продуктов ПОЛ и уроновых кислот в миокарде и печени животных при массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.);
Исследовать влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на состояние воды и биохимические характеристики тканей животных при массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.);
Изучить характеристики содержания связанной и свободной воды, продуктов ПОЛ и уроновых кислот в миокарде и печени животных в постреанимационном периоде (после реинфузии крови) в зависимости от уровня артериального давления и степени тревожности животных;
Оценить эффективность корригирующего действия НИЛИ на состояние воды и биохимические характеристики миокарда и печени в постреанимационном периоде.
Основные положения, выносимые на защиту.
Получены данные позволяющие рассматривать низкоинтенсивное лазерное излучение, как перспективный биотехнологический метод восстановления жизненных функций организма при массивной кровопотере.
Установлены пороговые значения потери крови (близкие к преагональному), за пределами которых НИЛИ не способствует адаптации организма, что необходимо учитывать при разработке научно обоснованных методов лазерной коррекции организма.
Одним из механизмов нарушения гомеостаза организма при массивной кровопотере наряду с активацией процессов ПОЛ и снижением содержания продуктов углеводного обмена в тканях, является дисбаланс свободной и связанной воды.
Использование НИЛИ при острой массивной кровопотере (АД 40 мм рт. ст.) предупреждает изменение содержания различных форм воды, уроновых кислот и продуктов ПОЛ в миокарде и печени животных.
При массивной кровопотере и в постреанимационном периоде выявлены новые ранее неизвестные механизмы патологических последствий, проявляющихся в изменении состояния воды, уровня ПОЛ и содержания уроновых кислот, характер которых зависит от тяжести кровопотери и степени тревожности животных.
Использование НИЛИ в комплексе с реинфузией крови способствует нормализации баланса свободной и связанной воды и
Научная новизна. Получена новая информация о механизме биологического действия НИЛИ, направленного на поддержание гомеостаза организма при массивной кровопотере.
Использование комплекса акваметрических и биохимических методов исследования позволило установить, что НИЛИ при массивной кровопотере предотвращает изменение баланса связанной и свободной воды, продуктов углеводного обмена и инактивирует процессы пероксидного окисления липидов, т. е. оказывает цитопротекторное, мембран остабилизирую щее действие.
Впервые обнаружено существование пороговых значений потери крови, близких к преагональному (АД 25 мм рт. ст.), за пределами которых НИЛИ не только не способствует адаптации организма, но и приводит к дальнейшему повреждению биоструктур тканей.
Дана количественная оценка различных форм воды, содержащихся в миокарде и печени животных, соотношение которых специфично для каждого органа и меняется при массивной кровопотере и реинфузии крови.
Результаты исследования имеют большое значение для понимания общебиологических закономерностей функционирования организма и его отдельных органов в процессе массивной кровопотери, в постреанимационном периоде и в результате лазерной коррекции.
Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют рассматривать НИЛИ, как эффективный компонент комплексного метода восстановления жизненных функций организма при массивной кровопотере и расширяют современные представления о патогенезе критических состояний и механизме действия лазерной коррекции нарушений гомеостаза организма.
Результаты этих исследований вносят определенный вклад в выяснение механизмов действия НИЛИ на состояние воды и биохимические характеристики миокарда и печени.
Выявленный факт существования порогового значения потери крови, за пределами которого НИЛИ не способствует адаптации организма, следует учитывать при разработке и внедрении новых лазерных технологий коррекции организма при кровопотере.
Установленная в работе высокая чувствительность соотношения свободной и связанной воды к метаболическим нарушениям, происходящим в организме при кровопотере и лазерной коррекции, позволяет предложить этот показатель в качестве биотеста на тяжесть изменений и степень дезадаптации организма при разработке новых методов биомедицинской коррекции патологических изменений на тканевом и организменном уровне.
Результаты комплексного исследования акваметрических и биохимических показателей миокарда и печени животных позволили обосновать целесообразность лазерной коррекции в комплексе реанимационных мероприятий с учетом тяжести массивной кровопотери.
Данная работа соответствует одному из направлений Федеральной целевой программы "Развитие медицинской промышленности в 1998-2000 годах и на период до 2005 года", утвержденной Постановлением Правительства РФ от 26.06.1998 № 650, приоритетному направлению НИР и ОКР отделения медико-биологических наук РАМН № 4 и Межведомственного научного совета Министерства здравоохранения РФ по медицинской биотехнологии № 3, а также плановой тематике Научно-исследовательского центра биомедицинских технологий ВИЛАР.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции "Патофизиология и современная медицина" (Москва, 2000), на научно-практической конференции "Биомедицинские технологии" (Москва, 2002), на IIIРоссийской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2002), на IX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002), на XI Международной конференции по химии органических и элементоорганических пероксидов (Москва, 2003), на Международной конференции "Критические технологии в реаниматологии" (Москва, 2003), на конференции "Основные обще патологические и клинические закономерности развития критических, терминальных и постреанимационных состояний. Принципы их коррекции" (Москва, 2003). По результатам исследований опубликовано 11 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 147 стр. машинописного текста, содержит 20 рисунков и 11 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы (2 гл.), экспериментальной части (1 гл.), результатов исследования и их обсуждения (4 гл.), заключения, выводов и списка литературы, включающего 285 источников, из которых 193 отечественных и 92 зарубежных.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Современные представления о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения
Лазерное излучение (ЛИ) является электромагнитным излучением в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной области спектра. Кванты электромагнитного излучения представляют собой универсальную основу взаимодействия в биологических системах и поддержания их гомеостаза [74]. Энергия кванта света по своему значению очень близка к энергетическому уровню, на котором работают живые организмы. Это энергетическое соответствие и обеспечивает биотический характер действия ЛИ [70].
Для обозначения действия лазерного облучения на биологические объекты был введен термин "фотобиоактивация" [255]. Однако, следует отметить, что до настоящего времени не существует единой теории, объясняющей действие лазерного излучения на биологические объекты.
Лазерное излучение выступает как физиологический раздражитель естественно протекающих биофизиологических изменений в клетке (информационная роль лазерного излучения). С другой стороны, являясь источником электромагнитной энергии, лазерное излучение может осуществлять и энергетические преобразования в клетке. Еще одним из объяснений фотобиоактивации является взаимодействие лазерного излучения и клетки через биологические мембраны. Предполагается, что лазерный луч вызывает конформационные изменения липидного слоя биомембран, тем самым, меняя активность связанных с ней ферментов [211,230,232,248].
Известна роль ионов Са2+ в запуске процессов повреждения мембран кардиоцитов. Обнаружено, что лазерное облучение действует на миокард как блокатор кальциевых каналов [60,119]. Блокируя Са2+ каналы, лазерное облучение предотвращает активизацию амфифильных мембраносвязанных фосфолипаз и гидролаз лизосом, образование амфифильных ферментов и дисбаланс ионов и жидкости в кардиомиоцитах. В связи с этим интересны полученные результаты по изменению Са2+ при воздействии на клетки бычьей спермы лазерного излучения различных длин волн (633 и 780 нм) и интенсивностей. Был сделан вывод, что свет влияет на клетки через митохондрии. Ускорение потока Са может быть связано с активацией (Са2+- Mg2+) АТФ-синтетазы, которая регулирует внутриклеточную концентрацию кальция [238].
По мнению ряда авторов НИЛИ влияет на регуляторную систему клетки, которая работает в слабых световых потоках [24,122].
Изучение степени связывания флуоресцентного зонда белками и клетками крови показало, что облучение светом с длиной волны 632,8 нм вызывает процессы, приводящие к изменению заряда белков крови [41].
Обнаруженное снижение агрегации тромбоцитов и нормализация эритроцитов связывается с лазерной инактивацией мембранных рецепторов вследствие структурно-функциональной перестройки мембран [90,92]. Результаты исследований воздействия низкоитенсивного лазерного излучения (X = 890 нм) подтверждают его мембранотропное действие [87].
Показано, что облучение низкоинтенсивным инфракрасным лазером в течение 5-7 минут (632,8, 0,1-22 мВт) увеличивает количество тучных клеток близких к дегрануляции, концентрацию гепарина и других гликозаминогликанов в соединительно-тканном основном веществе и кровяной плазме [46,154].
По мнению ряда авторов, одним из механизмов стресс-лимитирующего действия ЛИ является снижение активности каллекреин-кининовой системы. Кроме того, обнаружено, что увеличение антипротеазного потенциала сыворотки крови при действии ЛИ предотвращает развитие в тканях деструктивных процессов, связанных с действием лизосомальных протеаз на такие гуморальные факторы, как компоненты каллекреин-кининовой системы и системы комплемента, иммуноглобулины, структурные элементы соединительной ткани [65].
Обнаружено, что внутрисосудистое лазерное облучение крови увеличивает активность плазмина. По клиническим данным, полученным у больных с различными заболеваниям, авторы связывают активацию плазминогена со стимуляцией калликреиногенеза [92,164].
Лазерное облучение повышает количество фосфолипидов, содержащихся в мембране эритроцитов, что приводит к уменьшению вязкости мембран и улучшению микроциркуляции [35,78,84,90,159]. При этом уменьшается вязкость, агрегация эритроцитов и тромбоцитов [4,27,49,118,131,149].
Поиску возможных хромофоров в инфракрасной области спектра и механизму их участия в реализации стимулирующих эффектов низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) посвящен ряд работ. Так, выявлено повышение функциональной активности миелопероксидазы полиморфно-ядерных лейкоцитов при лазерном облучении (X = 540 нм) крови [14,275]. НИЛИ оказывает стимулирующее действие на метаболизм и функцию полиморфоядерных лейкоцитов и моноцитов периферической крови, увеличивает их антимикробный потенциал, повышая тем самым неспецифическую резистентность организма. Лазерное излучение стимулирует выработку интерферона [27].
Общие закономерности взаимодействия воды с биополимерами тканей
Вода является одним из основных компонентов биологических тканей и составляет около 70 % их веса. Ее содержание и характер связей с биополимерами в значительной мере определяет функциональные свойства тканей [99,166].
Обмен веществ неразрывно связан с явлениями микроциркуляции и микродвижений различных субстанций в жидких средах организма, при взаимодействии которых осуществляются сложные биохимические процессы [106]. Интерес к взаимодействию между водой и биополимерами, содержащимися в тканях, вызван многими причинами. Однако, главная из них заключается в том, что такое взаимодействие играет важную роль в процессах, протекающих в живом организме. Наличие большого количества воды в живой клетке позволяет предполагать, что многие физиологические явления могут отражать не только молекулярные особенности растворенного вещества, но в равной степени и молекул растворителя [7,173].
Переходя к эффектам взаимодействия воды с биологическими структурами, следует коротко остановиться на особенностях структуры самой воды. Обсуждение структуры воды, начатое еще в 1933 году, до сих пор далеко до своего завершения [76]. Установлено, что молекула воды четырежды координирована, что позволяет предположить ее тетраэдрический характер [192]. Несмотря на различия в высказываниях ряда авторов по поводу структуры воды, все они сводятся к двум основным положениям: структура воды может быть либо гомогенной, либо гетерогенной. Большое распространение получила модель, согласно которой вода представляет собой полиэдрические клатраты с распределенными внутри них свободными молекулами, либо льдоподобную структуру, состоящую из двух форм кварца и тридимита, либо совокупность кластеров (связанных водородными связями молекул) и свободных молекул воды [127]. Предполагается, что в воде сохраняется "ближнее упорядочение" льдоподобного каркаса, а часть его пустот заполняется молекулами воды [212]. Эта идея была впоследствии подтверждена и показано, что количество подобного рода молекул воды составляет около 20 % [192].
Существование в воде двух разновидностей молекул, одна из которых образует тетраэдрический каркас, а другая заполняет полости каркаса, представляет собой важнейшую особенность структуры воды [3,218]. Образование относительно прочного каркаса из молекул воды обусловливает сравнительно высокую температуру замерзания, а также частичное сохранение такого каркаса после плавления льда [212]. Специфическая структура воды, сохраняющая участки, связанные четырьмя водородными связями, безгранична в пространстве, и ее нельзя прервать, не нарушив водородные связи между соседними молекулами воды. Поэтому, изменение структуры воды вблизи других структурных образований возникает не только за счет непосредственного взаимодействия воды с ионами, заряженными группами и так далее, но и вблизи любой другой границы [281]. При этом вода, неспособная образовывать 4 водородные связи, будет замерзать при более низких температурах по сравнению с водой в объеме. Здесь проявляется еще одна аномалия воды, заключающаяся в том, что вода, изменяющая свою структуру вследствие взаимодействия с другим веществом - "связанная" вода, при 0 С обладает более низкой подвижностью по сравнению со свободной водой.
Согласно современным представлениям вода в биологических структурах находится в свободном и связанном состояниях. Свободная вода определяется как фракция воды, которая по своим свойствам не отличается от обычной воды. Связанная или гидратная вода отличается тем, что она не растворяет электролиты, не удаляется под давлением или при центрифугировании, не способна замерзать при минусовых температурах [8,124,182].
Процесс гидратации белков протекает в несколько стадий. Согласно исследованиям с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР), адсорбция воды первоначально происходит на активных центрах белков [173], Эта вода наиболее прочно связана и присоединяется к белку с выделением тепла. В процессе молекулярной гидратации происходит образование водородной связи. Активными группами белков, способными к связыванию воды являются: пептидные, гидроксильные, карбоксильные, амино- и иминогруппы и др. Прочно связанная вода энергетически неоднородна, что зависит от типа активных центров. В основе современных представлений о гидрофильности биополимеров лежит учение о различных типах связанной воды.
Материалы исследования
Эксперименты выполнены в осенне-зимний период на 177 белых беспородных наркотизированных и гепаринизированных крысах-самцах массой 230-330 г, выращенных в виварии ГУ научного центра биомедицинских технологий РАМН "Андреевка" и содержащихся в одинаковых условиях.
Крыс " наркотизировали нембуталом (25 мг/кг массы внутрибрюшинно), катетеризировали хвостовую артерию и через нее для предупреждения свертывания крови за 15 мин до кровопотери вводили гепарин (500 МЕ/кг).
Эксперименты выполнены на модели артериальной гипотензии (АГ). В течение всех сроков артериальной гипотензии регистрировали объем кровопотери (мл/кг), средний уровень артериального давления (мм рт.ст.), частоту сердечных сокращений (ЧСС).
В качестве базовых были использованы общепринятые в мировой практике наиболее устойчивые модели гипотензии при среднем артериальном давлении 40 и 25 мм рт. ст. При артериальном давлении 40 мм рт. ст. поддерживается кровоток на уровне жизнедеятельности организма и сохраняются все основные рефлексы. Эта модель позволяет получать стабильные результаты при биохимических исследованиях. Модель АД 25 мм рт. ст. ниже уровня ауторегуляции, при этом затухают все функции организма. Это более тяжелое состояние, которое встречается в практике реаниматологии.
В эксперименте животные были разделены на группы: контрольная (наркотизированные, ложнооперированные); с артериальной гипотензией (АГ); с АГ и НИЛИ; с АГ и реинфузией крови; с АГ, реинфузией крови и НИЛИ. В опытах продолжительность АГ составляла 10 мин, 30 мин и 2 ч после чего животных выводили из эксперимента (рис.1).
Для достижения необходимого артериального давления (АД 40 мм рт. ст. и АД 25 мм рт.сг.) кровь забирали через катетер в хвостовой артерии. Объем кровопотери составлял в среднем 10 мл/кг массы тела и 20 мл/кг массы тела животного, соответственно. Затем животным проводили возмещение кровопотери путем переливания собственной крови (реинфузия). Продолжительность постреанимационного периода (после реинфузии крови) составляла: 30 мин, 3 ч и 7 сут. Перед началом опытов животных с продолжительностью постреанимационного периода 7 сут разделили на высоко- и низкотревожных по тесту в лабиринте [18].
Материалом исследования служили образцы ткани миокарда, печени и плазма крови экспериментальных животных. Использование экспериментального материала в разделах исследования представлено в табл.1.
