Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Проблема загрязнения почвогрунтов ФОС 10
1.1.1 Оценка экологической ситуации, связанной с накоплением ФОС в почвогрунтах
1.1.2 Запрещенные и непригодные к использованию запасы пестицидов 12
1.2 Методы очистки почв от загрязнений 14
1.2.1 Детоксификация почвогрунтов с использованием ферментов 18
1.2.1.1 Иммобилизация ферментов для детоксификации почвогрунтов 21
1.2.1.2 Фермент органофосфатгидролаза и его физико-химические характеристики
1.2.1.3 Гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза 27
1.2.2 Детоксификация почвогрунтов с помощью клеток микроорганизмов 28
1.2.2.1 Методы стабилизации и повышения эффективности действия клеток микроорганизмов в почвогрунте. Кворум-зависимые бактериальные системы
1.2.2.1.1 Кворум-зависимые системы у грамотрицательных клеток бактерий
1.2.2.1.2 Ферментативное разрушение автоиндукторов «кворумного ответа» у грамотрицательных клеток бактерий
1.2.2.2 Методы стабилизации клеток микроорганизмов в почвогрунте. 39
Иммобилизация клеток микроорганизмов
1.2.2.3 ФОС-деградирующий потенциал клеток бактерий 40
Pseudomonas sp. 78Г
2 Экспериментальная часть 43
2.1 Материалы и приборы 43
2.1.1 Реактивы 43
2.1.2 Бактериальные штаммы 44
2.1.3 Питательные среды 44
2.1.5 Приборы 45
2.2 Методы 45
2.2.1 Экспрессия и выделение His6-OPH 45
2.2.2 Подготовка крио-ПААГ носителей для выделения Hise-OPH 47
2.2.3 Определение концентрации белка
2.2.4 Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле 47
2.2.5 Обработка данных электрофореза 48
2.2.6 Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой His6-OPH
2.2.7 Иммобилизация фермента His6-OPH 49
2.2.8 Определение активности иммобилизованного фермента His6-OPH 49
2.2.9. Исследование термостабильности, температурного и рН-оптимума 50 иммобилизованного ферментного биокатализатора, полученного на основе His6-OPH
2.2.10 Щелочная делигнификация целлюлозосодержащих носителей 50
2.2.11 Разложение ФОС в почвогрунтах под действием иммобилизованной His6-OPH
2.2.12 Хроматографический анализ ФОС 51
2.2.13 Определение концентрации фосфат-ионов в почвогрунте 52
2.2.14 Иммобилизация клеток микроорганизмов в криогель поливинилового спирта
2.2.15 Определение концентрации внутриклеточного АТФ в свободных и иммобилизованных клетках биолюминесцентным методом
2.2.16 Иммобилизованные клетки E.coli SG13009[pREP4] как инокулят для получения клеток с His6-OPH-aKTHBHOCTbK
2.2.17 Определение концентрации глицерина в реакционной среде
2.2.18 Иммобилизованные и свободные клетки бактерий в процессе деградации ФОП и продуктов их разложения
2.2.19 Определение кинетических параметров роста свободных клеток бактерий
2.2.20 Контроль интенсивности аэрации среды 55
2.2.21 Окрашивание клеток микроорганизмов по Граму 57
2.2.22 Функционирование разработанного бактериального консорциума в системе параоксон-гексадекан
2.2.23 Детоксификация песчаного почвогрунта под действием консорциума, составленного на основе клеток бактерий P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
2.2.24 Хроматографический анализ гексадекана 58
2.2.25 Определение влажности экспериментальных образцов 59
2.2.26 Кинетические исследования реакции гидролиза N-ацилгомосеринлактонов под действием фермента Hise-OPH и клеток микроорганизмов
2.2.27 Выравнивания аминокислотных последовательностей белков 61
2.2.28 Получение супернатанта из клеток R. ruber АС-1513D 62
2.2.29 Определение интенсивности биолюминесценции у клеток 62
P. phosphoreum
2.2.30 Определение N-ацилгомосеринлактонов в средах, полученных после культивирования клеток бактерий рода Pseudomonas
3 Результаты и обсуждение 64
3.1 Иммобилизованный биокатализатор на основе фермента His6-OPH для гидролиза ФОС в почвогрунте
3.1.1 Разработка биокатализатора в виде иммобилизованного фермента и исследование его характеристик
3.1.2 Применение иммобилизованного биокатализатора на основе Hise-OPH 74 и делигнифицированной соломы для детоксификации почвогрунтов
3.2. Иммобилизованные клетки E.coli SG13009[pREP4] как инокулят для получения клеток с His6-OPH-aKTHBHOCTbK
3.3 Микроорганизмы и консорциумы на основе микроорганизмов для детоксификации ФОС в почвогрунтах и водных системах
3.3.1 Разложение ФОС под действием свободных и иммобилизованных 85
клеток бактерий
3.3.1.1 Иммобилизованные и свободные клетки Pseudomonas sp. 78Г и 87 Pseudomonas esterophilus в процессе деградации параоксона и п-нитрофенола
3.3.1.2 Иммобилизованные и свободные клетки Rhodococcus erythropolis 94 AC-1514D и Rhodococcus ruber AC-1513D в процессе деградации ФОС
3.3.2 Консорциум на основе клеток бактерий, осуществляющих деградацию ФОС
3.3.2.1 Оптимизация состава иммобилизованного микробного консорциума
3.3.2.2 Оптимизация получения иммобилизованного консорциума на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
3.3.2.3 Исследование постоянства состава консорциума, полученного на основе клеток P. esterophilus HR. ruber AC-1513D
3.3.2.4 Деградация различных ФОП под действием иммобилизованного ПО консорциума на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
3.3.2.5 Функционирование консорциума на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D в системе параоксон-гексадекан
3.3.2.6 Детоксификация песчаного почвогрунта под действием консорциума на основе клеток бактерий P. esterophilus и R. ruber АС 1513D
3.4 N-ацилгомосеринлактоназы из клеток бактерий рода Rhodococcus
3.4.1 Сравнение аминокислотной последовательности ОРН и 116
аминокислотных последовательностей, присутствующих в клетках рода Rhodococcus
3.4.2 Лактоназная активность клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D
3.4.3 Анализ супернатанта, полученного после дезинтеграции клеток R. ruber AC-1513D
ЗАЛ Индукция биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназы в клетках бактерий R. ruber AC-1513D под действием N-ацилгомосеринлактонов
3.4.5 Биосинтез N-ацилгомосеринлактоназ в клетках бактерий рода Rhodococcus в присутствии клеток рода Pseudomonas
3.4.5.1 Определение наличия N-ацилгомосеринлактонов в средах, полученных после культивирования клеток Pseudomonas sp. 78Г и
P. esterophilus
3.4.5.2 Индукция биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназ в клетках Rhodococcus с использованием сред, полученных после культивирования
клеток P. esterophilus и Pseudomonas sp. 78Г
3.5 Принцип функционирования консорциума, состоящего из клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
3.6 Взаимосвязь ОРН и N-ацилгомосеринлактоназ 132
3.6.1 Сравнительный анализ ОРН и N-ацилгомосеринлактоназ 132
3.6.2 Лактоназная активность фермента His6-OPH 136
3.6.3 Гипотеза эволюционного родства N-ацилгомосеринлактоназ из клеток рода Rhodococcus и ОРН
Выводы 151
Список литературы
- Оценка экологической ситуации, связанной с накоплением ФОС в почвогрунтах
- Бактериальные штаммы
- Иммобилизованные клетки E.coli SG13009[pREP4] как инокулят для получения клеток с His6-OPH-aKTHBHOCTbK
- Консорциум на основе клеток бактерий, осуществляющих деградацию ФОС
Введение к работе
Актуальность проблемы. В развитии современного мира большую роль играют фосфорорганические соединения (ФОС*), а также продукты их разложения (Табл. 1). Известно, что применение пестицидов сохраняет значительную часть (-35%) урожая, поэтому они интенсивно используются в сельском хозяйстве. Почти 40% от мирового производства всех пестицидов составляет производство фосфорорганических пестицидов (ФОП) (Табл. 1). Ежегодное применение ФОП в объеме сотен тысяч тонн для нужд сельского хозяйства наряду с низкими скоростями их разложения в условиях окружающей среды приводят к их накоплению в почвогрунтах, откуда далее они вымываются и попадают в грунтовые и речные воды или продукты сельского хозяйства.
Таблица 1. Структурные формулы ФОС.
В почвогрунты также могут попадать фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) во время проведения мероприятий по их уничтожению, а также запрещенные к применению и устаревшие ФОП, длительное хранение которых может приводить к нарушению герметичности их тары.
Список сокращений: ФОС - фосфорорганические соединения; ФОП -фосфорорганические пестициды; ФОВ - фосфорорганические отравляющие вещества; ИФБК - иммобилизованный ферментный биокатализатор; ИМК - иммобилизованный микробный консорциум; ОРН - органофосфатгидролаза; His6-OPH -гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза; ПДК - предельно допустимая концентрация; АГЛ - N-ацилгомосеринлактоны; АЫА - N-ацилгомосеринлактоназа из клеток R. erythropolis W2; Г(-)-клетки бактерий - грамотрицательные клетки бактерий; Г(+)-клетки бактерий - грамположительные клетки бактерий; ПНФ - п-нитрофенол; ПВС -поливиниловый спирт.
ФОС являются высокотоксичными кумулятивными ядами, оказывающими мутагенное воздействие на живые организмы. В процессе биоаккумуляции, как правило, происходит многократное повышение концентрации таких ядов в тканях животных и растений, которые, поступая в качестве продуктов питания в организм человека, вызывают различные заболевания.
В связи с этим разработка эффективных и неагрессивных для человека и окружающей среды способов элиминирования ФОС из почвогрунтов становится чрезвычайно актуальной задачей и представляет большой практический интерес.
Наиболее целесообразным, с экологической точки зрения, является разложение ФОС в почвах in situ с использованием биокатализаторов в виде ферментов и клеток микроорганизмов, обладающих деструктивной активностью по отношению к токсичным ФОС. Интерес к ферментам определяется возможностью их применения для быстрой детоксификации сильнозагрязненных почвогрунтов, а к клеткам микроорганизмов - способностью деградировать ФОС в умеренных концентрациях с одновременной деструкцией продуктов их разложения.
Перспективным ферментным биокатализатором является
органофосфатгидролаза (ОРИ, ЕС 3.1.8.1), содержащая гексагистидиновую последовательность (His6-OPH) на N-конце молекулы белка. His6-OPH осуществляет эффективный гидролиз различных ФОС и обладает значительно улучшенными каталитическими характеристиками по сравнению с нативной ОРИ. Наряду с этим, в лаборатории экобиокатализа Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова были оптимизированы условия получения His6-OPH в высокоактивной растворимой форме [Гудков Д.А., 2009], что обеспечивает возможность масштабной наработки этого фермента для применения на практике.
Потенциальными микробными биокатализаторами разложения ФОС являются бактерии родов Rhodococcus и Pseudomonas, широко распространенные в различных почвогрунтах. Бактерии рода Pseudomonas являются известными деструкторами различных ксенобиотиков, в том числе пестицидов, а бактерии рода Rhodococcus -известными деструкторами углеводородов нефти и продуктов разложения ФОС. В предварительном исследовании было показано, что клетки Pseudomonas sp. 78Г эффективно деградируют продукты разложения ФОВ: метилфосфоновую кислоту и ее эфиры. В связи с этим данный микроорганизм использовался при разработке микробных биокатализаторов для детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС. Помимо этого в работе использовались клетки бактерий Pseudomonas esterophilus, осуществляющие деструкцию эфирных соединений в системах очистки воды, а также клетки Rhodococcus ruber AC-1513D и Rhodococcus erythropolis АС-1514D [Murygina V., 2000], которые разрешены к масштабному применению для очистки почв от нефтепродуктов и могут в потенциале деградировать продукты разложения ФОС.
Применение ферментных и микробных биокатализаторов в иммобилизованном виде выглядит наиболее предпочтительным, поскольку позволяет рассчитывать на увеличение длительности их пребывания в месте введения в почвогрунт, что особенно важно в случае применения на практике при выпадении осадков. При этом иммобилизация направлена на стабилизацию биокатализаторов и часто
обеспечивает возможность их многократного использования в условиях высоких концентраций токсичных субстратов.
Целью данной работы являлась разработка биокаталитических систем на основе иммобилизованных биокатализаторов в виде ферментов и клеток микроорганизмов, предназначенных для деструкции ФОС и продуктов их разложения в почвогрунтах и водных средах.
В ходе работы предполагалось решить ряд основных задач:
разработать иммобилизованный биокатализатор на основе фермента His6-OPH для гидролиза ФОС в почвогрунтах и определить его основные каталитические характеристики;
оценить практический потенциал разработанного иммобилизованного биокатализатора на основе фермента His6-OPH (ИФБК) при проведении детоксификации различных образцов почвогрунтов, сильнозагрязненных ФОС;
разработать иммобилизованный биокатализатор на основе клеток микроорганизмов для детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС, оптимизировать условия, обеспечивающие получение наиболее эффективного микробного биокатализатора, и проанализировать природу ФОС-деградирующей активности клеток микроорганизмов;
показать практический потенциал разработанного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток микроорганизмов при проведении детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС.
Научная новизна работы. Впервые создан оригинальный ИФБК на основе фермента His6-OPH и целлюлозосодержащих материалов, предназначенный для введения в почвогрунты, загрязненные высокими концентрациями различных ФОС, с целью их быстрой и высокоэффективной детоксификации.
Впервые разработан искусственный консорциум на основе грамотрицательных (P. esterophilus) и грамположительных (R. ruber AC-1513D) клеток бактерий, предназначенный для очистки водных систем и почвогрунтов от ФОС. Подобраны условия получения наиболее активной иммобилизованной формы этого консорциума, и впервые показана эффективная деградация разных ФОС под действием такого искусственного консорциума, а на примере параоксона продемонстрировано разложение не только самого пестицида, но и продукта его гидролиза - п-нитрофенола (ПНФ).
Впервые выявлена лактоназная и ОРН-активность у грамположительных клеток
бактерий R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D. Показана возможность
увеличения этих активностей у клеток при внесении
N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ) в среды для их культивирования и при использовании сред, полученных после выращивания грамотрицательных клеток Pseudomonas sp. 78Г и P. esterophilus, продуцирующих АГЛ.
Высказано научно обоснованное предположение о причине успешного действия иммобилизованного микробного консорциума (ИМК), созданного на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D и предназначенного для деградации ФОС и детоксификации экосистем. Причина заключается в индукции лактоназной, а следовательно, и ОРН-активности у клеток R. ruber AC-1513D под действием АГЛ, синтезируемых клетками P. esterophilus при их сокультивировании.
Впервые выявлена лактоназная активность у His6-OPH, проявляющаяся в расщеплении С-0 связи в молекулах АГЛ, и предложен механизм действия фермента по отношению к данным субстратам. Установлено, что константы эффективности действия His6-OPH в этих реакциях выше, чем у большинства известных N-ацилгомосеринлактоназ.
Установленная высокая гомология, идентичность активных центров и перекрестная субстратная специфичность N-ацилгомосеринлактоназ из клеток рода Rhodococcus и ОРН позволили обосновать гипотезу эволюционного происхождения ОРН из N-ацилгомосеринлактоназ и сделать вывод о локализации эволюционно изменчивых областей в молекулах данных ферментов в области субстрат-связывающего сайта.
Практическая значимость работы. Предложен технически легко реализуемый способ получения иммобилизованной формы фермента His6-OPH, эффективно действующей при детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС. Способ представляет собой сорбционную иммобилизацию неочищенного ферментного препарата His6-OPH на целлюлозосодержащих носителях - отходах сельского хозяйства.
Показано, что разработанный ИФБК, полученный на основе делигнифицированной пшеничной соломы и фермента His6-OPH, позволяет эффективно (до 100%) и быстро (< 12,5 сут) проводить разложение различных ФОС (параоксона, диазинона, паратиона, метилфосфоновой кислоты - продукта разложения ФОВ) в концентрации до 850 мг/кг в составе разных по характеристикам природных почвогрунтов. Использование ИФБК предполагает введение в почвогрунты до 59 раз меньшего количества биокатализатора по сравнению с известными аналогами. При этом установлено, что разработанный ИФБК стабилен при длительном хранении в высушенном виде (период полу инактивации 295 сут.).
Показано, что созданный иммобилизованный микробный консорциум (ИМК), состоящий из клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D, осуществляет деструкцию различных ФОП (параоксона, паратиона, малатиона, диазинона, диметоата, деметона-S) как в водных системах, так и в почвогрунтах, содержащих ФОП до 150мг/кгпочвы.
Показано, что разработанный искусственный ИМК способен проводить эффективную комплексную очистку водных систем с двойным загрязнением - ФОС и углеводородом нефти и, в частности, осуществлять одновременную деградацию параоксона, продукта его разложения - ПНФ и гексадекана с высокими степенями конверсии.
Выявленная лактоназная активность у His6-OPH позволяет рассматривать этот фермент не только как биокатализатор для разложения ФОС, но и как потенциальное средство, способное повышать эффективность действия антимикробных препаратов, направленных против ассоциаций патогенных грамотрицательных клеток бактерий, вырабатывающих АГЛ, как фактор собственной устойчивости. Это свойство фермента может быть использовано для целей биомедицины, в ветеринарии и для решения вопросов химической и биологической безопасности.
Обнаруженные N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью,
присутствующие в клетках бактерий рода Rhodococcus, открывают новые возможности активного применения природных штаммов данных микроорганизмов в процессах деградации ФОС. При этом уровень ОРН-активности у клеток бактерий может регулироваться путем внесения АГЛ в среды их культивирования (в том числе и в почвы), как виде чистых веществ, так и в составе сред, полученных после культивирования грамотрицательных клеток бактерий.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанный иммобилизованный биокатализатор на основе His6-OPH с высокой эффективностью действия при детоксификации почвогрунтов, загрязненных ФОС.
-
Разработанный искусственный иммобилизованный микробный консорциум на основе клеток бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas, осуществляющих деградацию ФОС, а также одновременную деструкцию ФОП, продукта его разложения и углеводорода нефти (гексадекана). Наличие внутренней регуляции ОРН-активности консорциума.
-
Наличие лактоназной и ОРН-активности у клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D. Индукция биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназы с ОРН-активностью в клетках бактерий рода Rhodococcus. Способность клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D осуществлять деструкцию различных ФОП.
-
Наличие лактоназной активности у His6-OPH по отношению к различным АГЛ. Гипотеза эволюционного происхождения ОРН от N-ацилгомосеринлактоназ и локализация эволюционно вариабельных областей в молекулах N-ацилгомосеринлактоназ.
Личный вклад автора состоял в планировании экспериментов, обработке экспериментальных данных, их анализе и трактовке. При этом в ходе выполнения работы автор применил различные современные подходы и методы исследования ферментов и клеток микроорганизмов. Также автор принимал активное участие в подготовке к публикации полученных результатов работы и их популяризации на международных научных форумах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: XVIII Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry (Russia, Moscow, 2007), VIII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, Москва, 2009), 6-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Украина, Харьков, 2009), XVIII International conference on Bioencapsulation (Portugal, Porto, 2010), Всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России» (Россия, Москва, 2010), Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Россия, Москва, 2009), Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Россия, Москва, 2010), 5-ой Научно-практической конференции «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия»
(Россия, Москва, 2010), XIX International conference on Bioencapsulation (France, Amboise, 2011), XI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы (Россия, Москва, 2011), Выставке «Технологии специального назначения» МГУ имени М.В. Ломоносова (Россия, Москва, 2012), Девятом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2013). Работа отмечена стипендией Президента РФ в 2012 г.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей из списка ВАК, 2 Патента РФ и 12 тезисов докладов на международных и российских конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 171 страницу печатного текста, 59 рисунков, 44 таблицы, 235 ссылок.
Оценка экологической ситуации, связанной с накоплением ФОС в почвогрунтах
Введение в почвогрунт ферментов в свободном виде, как правило, приводит к быстрому падению его активности [46] и в связи с этим к неэффективной биоремедиации загрязненных территорий. Основными причинами инактивации свободного фермента в почвогрунте, по-видимому, являются его сорбция на почвенных частицах, деградация протеазами, ингибирование различными соединениями (ионами металлов, низкомолекулярными органическими соединениями), высокая кислотность или щелочность почвы.
Эффективность действия ферментов в процессах детоксификации может быть улучшена благодаря использованию иммобилизованной формы фермента, что может обеспечить стабильность его каталитического действия и устойчивость по отношению к физическим, химическим и биологическим инактивирующим агентам, а также может увеличить длительность пребывания фермента в месте введения за счёт удерживания его носителем и продлить, таким образом, срок его каталитического воздействия на загрязнитель. Помимо этого иммобилизованный фермент может быть повторно использован для элиминирования последующих загрязнений [60].
На основании рассуждений, проведенных на начальном этапе выполнения данной работы, был сделан вывод о том, что наиболее приемлемыми носителями для иммобилизации ферментов с целью их последующего введения в почвогрунты являются природные материалы, поскольку они, как правило, экологичны, безопасны и большинство из них биодеградируемы. При этом, использование природных носителей, как правило, подразумевает их невысокую стоимость, а значит экономическую привлекательность для использования на практике. Также подобные носители способны выполнять роль структурообразователей, разрыхляющих и улучшающих структуру почвогрунтов, обеспечивая лучшее проникновение в почвы влаги и воздуха.
Также, был сделан вывод о том, что процесс иммобилизации ферментов должен представлять собой простую и легко реализуемую методику. На основании этого был выбран наиболее подходящий метод иммобилизации - сорбция ферментов на природных носителях. В связи с этим природные носители, выбираемые для иммобилизации, по-видимому, должны обладать высокой сорбционной емкостью.
В качестве перспективных носителей для иммобилизации ферментов и для введения их в почву были рассмотрены следующие: активированный уголь, сибунит, вермикулит, диатомит, древесные опилки, песок. Согласно проведенному анализу литературных данных было установлено, что эти носители применяются для иммобилизации ферментов [93-96].
Активированный уголь представляет собой пористое вещество, которое получают из различных углеродсодержащих материалов органического происхождения. Благодаря большой удельной поверхности, обусловленной огромным количеством пор, активированный уголь обладает высокой сорбционной емкостью [97].
Сибунит относится к мезопористым композиционным углеродным материалам, сочетающим преимущества графита (химическая стабильность, электропроводность) и активных углей (высокая поверхность, адсорбционная емкость). Данные композиты характеризуются узким регулируемым распределением пор по размерам [98].
Вермикулит относится к минералам из группы гидрослюд, которые имеют слоистую структуру, представляющую собой крупные пластинчатые кристаллы золотисто-жёлтого или бурого цвета. При нагревании пластинок вермикулита образуются червеобразные столбики или нити золотистого или серебристого цвета с поперечным делением на тончайшие чешуйки (вспененный вермикулит) [99-100]. Вспененный вермикулит имеет высокий коэффициент водопоглощения - 100 г вермикулита поглощают 400—530 мл воды.
Диатомит - осадочная горная порода, представляющая собой останки диатомовых водорослей. Химически диатомит более чем на 80 % состоит из водного кремнезёма. Он обладает большой пористостью и способностью к адсорбции, которая связана с особенностями его строения: поры составляют до 85% объема материала [101]. 1.2.1.2 Фермент органофосфатгидролаза и его физико-химические характеристики
Органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1) является ферментом, который осуществляет эффективный катализ реакций гидролиза различных фосфорорганических соединений (ФОС) [102].
Согласно данным рентгеноструктурного анализа [103-104] фермент представляет собой гомодимер. Молекулярная масса димера составляет 72 кДа, а каждая субъединица содержит по 336 аминокислотных остатков [105]. ОРН является металл-зависимым ферментом и содержит два иона Zn + или Со + на каждую субъединицу.
Исследования структуры активного центра молекулы ОРН [103-105] показали, что четыре остатка гистидина (Hisss, Hiss7, His2oi и Нівгзо), а также остаток аспарагиновой кислоты Asp3oi, являются лигандами ионов металла (Рис. 1). Два иона металла координированы карбамилированным остатком Lysi69, который образуется в присутствии высоких (более 40 мМ) концентраций бикарбоната в растворе, длительность данного процесса составляет более 100 мин [106]. Методом 13С-ЯМР-спектроскопии было показано, что в образовании карбамилированного остатка Ьувзої может принимать участие диоксид углерода [107]. Вторым мостиковым лигандом между ионами металла служит молекула воды. Координационная сфера одного из ионов металла имеет конфигурацию тригональной бипирамиды, а второго - октаэдрическую. Расстояние между ионами металла в активном центре составляет 3,8 А.
ОРН катализирует реакцию, принципиальная схема которой представлена на Рис. 1. Установлено, что реакция гидролиза ФОС, катализируемая ОРН, протекает по Б -механизму с инверсией конфигурации атома фосфора [108-109]. Согласно существующему представлению о механизме действия ОРН (Рис. 1), субстрат взаимодействует с одним из ионов Со , вытесняя мостиковую молекулу воды. Второй ион Со понижает рІС молекулы воды, способствуя образованию гидроксид-иона при значениях рН близких к нейтральным. Общее заключение о роли ионов металла в активном центре ОРН таково: один из ионов металла за счет координации с неэфирным атомом субстрата (на Рис. 1 обозначен как X) повышает электрофильность фосфорного центра, а второй ион служит промотором атакующего нуклеофила.
Бактериальные штаммы
Вероятно, сорбционная емкость целлюлозосодержащих материалов зависит от структурной организации носителей: размера и количества пор и капилляров. Очевидно, что с увеличением количества пор повышается эффективная площадь поверхности для иммобилизации фермента. Основной характеристикой пористости носителя может быть плотность материала. Согласно Табл. 13, наименьшей плотностью, а значит наибольшей пористостью, обладает солома. Таким образом, эффективная площадь поверхности для сорбции His6-OPH в случае соломы была выше, чем в случае опилок лиственных и хвойных пород деревьев. Стоит отметить, что плотность хвойных материалов ниже, чем лиственных, однако активность ИФБК, полученного на основе опилок березы и дуба, была выше, чем на основе опилок сосны и ели. По-видимому, присутствующий лигнин мог обуславливать получение менее активных ИФБК в этом случае. А поскольку содержание лигнина в целлюлозосодержащих материалах варьируется в зависимости от источника (Табл. 13), то следовало ожидать, что в зависимости от выбранного носителя будет изменяться и НІ5б-ОРН-активность ИФБК. Это предположение подтвердилось полученными результатами (Рис. 12). Активность ИФБК на основе еловых и сосновых опилок, содержащих до 33% лигнина, была наименьшей, а активность ИФБК, приготовленного с использованием пшеничной или рисовой соломы, содержащей 18±2% лигнина, была наибольшей и составляла 160±5 Ед/гсухог0 носителя- Таким образом, гидрофобный лигнин мог оказывать влияние на процесс иммобилизации водорастворимой His6-OPH и активность получаемых ИФБК.
В связи с этим с целью повышения гидрофильности носителей и увеличения эффективной площади иммобилизации была проведена щелочная делигнификация целлюлозосодержащих материалов (Табл. 13).
Характеристики делигнифицированных целлюлозосодержащих носителей и активность ИФБК (в пересчете на вес сухого носителя (остаточная влажность 8±1%)), полученных на их основе.
Носитель Насыпнаяплотность, кг/м(влажность20%) Лигнин[177-178],% Активность ИФБК,ІІД/Гсухого носителя КонцентрацияиммобилизованнойHis6-OPH,МКГ/ГСуХого носителя Дубовые опилки 673-753[178] 23±2 156 ±4 55 ±3 Березовые опилки 608-705[178] 20±1 150±4 48 ±3 Еловые опилки 400-430[178] 30±3 69 ±3 33 ±3 Пшеничная солома 27-62[Ш] 18±2 360 ±5 97 ±4 Такой вид предобработки носителей обладает рядом преимуществ. Во-первых, при делигнификации происходит удаление основной части лигнина из носителей. Во-вторых, щелочная делигнификация приводит к образованию дополнительных пор, что увеличивает эффективную площадь поверхности для иммобилизации фермента. В-третьих, при последующем промывании носителя происходит удаление не только лигнина, но и возможных ингибиторов фермента. При этом в ходе щелочной делигнификации, по сравнению с кислотной, практически не происходит разрушения целлюлозной составляющей носителей, с которой связывается фермент [178].
Одним из важных параметров щелочной делигнификации является длительность ее проведения. Очевидно, что увеличение длительности делигнификации должно способствовать более полному удалению лигнина, однако это также приводит к увеличению энергетических и соответственно экономических затрат на процесс подготовки носителя. В связи с этим на основании литературных данных [163] было выбрано оптимальное время делигнификации, равное 1 ч.
Анализ полученных результатов (Табл. 13, Рис. 12) показал, что все образцы ИФБК, полученные на основе делигнифицированных носителей, обладали в среднем в 2,3-3,4 раза большей активностью по сравнению с лигнинсодержащими носителями. При этом наиболее активный образец ИФБК был получен на основе делигнифицированной пшеничной соломы.
Очевидно, что процесс сорбции His6-OPH на целлюлозосодержащих носителях сопряжен с влиянием различных факторов, в основном, связанных со строением и свойствами материала носителей. Структура носителя определяет его сорбционную емкость по исследуемому ферменту и, в конечном счёте, свойства получаемого иммобилизованного ферментного препарата.
Одной из главных задач при разработке ИФБК для гидролиза ФОС в почвах было определение оптимальных условий его получения. В связи с этим в качестве носителя для иммобилизации His6-OPH была выбрана делигнифицированная пшеничная солома, поскольку ИФБК, полученный на основе данного носителя, обладал наибольшей активностью.
С целью уменьшения расхода раствора фермента, используемого при иммобилизации, была определена влагоемкость делигнифицированной пшеничной соломы (Табл. 14) [181].
Согласно полученным данным был определен оптимальный объем раствора фермента (3 мл), который может быть поглощен 1 г сухого носителя (остаточная влажность 8±1%) в виде делигнифицированной пшеничной соломы.
Исследование зависимости активности ИФБК (Ед/гСухого носителя) от активности иммобилизуемого фермента (Ед/мл) (Рис. 13) показало, что с увеличением активности супернатанта выше 200 Ед/мл активность получаемого ИФБК изменялась незначительно. В связи с этим иммобилизация фермента из раствора с активностью больше 200 Ед/мл представлялась нецелесообразной, поскольку это привело бы к неоправданным затратам, связанным с использованием таких высокоактивных ферментных растворов.
Оптимальная длительность процесса иммобилизации фермента была определена экспериментально. Согласно Рис. 14, максимально активный ИФБК формировался в течение 30 мин Зависимость активности ИФБК (в пересчете на вес сухого носителя, остаточная влажность которого 8±1%), полученного на основе делигнифицированной пшеничной соломы, от активности раствора фермента, иммобилизуемого на носитель. 100 120 140 160 180 200
Время, мин Рис. 14. Влияние длительности процесса сорбционной иммобилизации фермента (200 Ед/мл) на активность получаемого ИФБК в пересчете на вес сухого носителя (остаточная влажность 8±1%). Активность полученного таким методом ИФБК составила 412±10 Ед/гСух0го носителя, при этом рассчитанное количество His6-OPH на носителе было равно Л 08 мкг/г, сухого носителя Стоит отметить, что на практике удобней оперировать характеристиками непосредственно самого ИФБК (то есть влажного носителя, содержащего иммобилизованный фермент). С учетом разработанного метода иммобилизации: 30 мл раствора фермента (плотность 1 г/мл) смешиваются с 10 г сухого носителя, можно заключить, что на основе 10 г сухого носителя может быть получено 40 г влажного ИФБК, активность которого составляет 103±3 ЕД/ГИФБК (РИС. 15). Рис. 15. Внешний вид ИФБК, полученного на основе делигнифицированной пшеничной соломы.
Следует отметить, что метод иммобилизации His6-OPH на целлюлозосодержащем носителе путем сорбции фермента из строго определенного объема супернатанта обладает рядом преимуществ. Во-первых, он прост в реализации, что является важным аспектом при масштабировании процесса с целью детоксификации почвогрунтов; а во-вторых, данный метод позволяет в течение короткого промежутка времени (-0,5 ч) получить высокоактивный ИФБК.
Согласно описанным выше результатам (Рис. 12), в качестве носителей для иммобилизации фермента помимо пшеничной соломы могут быть использованы и другие целлюлозосодержащие материалы. Сорбция фермента на носителе в основном зависит от поверхностных свойств сорбента, таких как, химическая структура, удельная поверхность и пористость носителя.
Иммобилизованные клетки E.coli SG13009[pREP4] как инокулят для получения клеток с His6-OPH-aKTHBHOCTbK
Для определения стабильности состава разработанного консорциума был применен способ совместного культивирования клеток бактерий P. esterophilus и R. ruber AC-1513D. В качестве инокулята использовались гранулы ИМК (0,6 гклеток/л), полученного на третьем цикле функционирования в среде с параоксоном (Рис. 42). Культивирование бактерий проводилось в богатой питательной среде LB в течение 15 ч, а далее образцы полученной биомассы свободных клеток окрашивались по Граму и исследовались под микроскопом с целью определения наличия Г(-) и Г(+) микроорганизмов [170] (Рис. 44).
Результаты микрокопирования образцов клеток, окрашенных по Граму. (А) Клетки бактерий P. esterophilus, (Б)-(Г) Совместное культивирование клеток Р. esterophilus и R. ruber AC-1513D в богатой питательной среде, (Д) клетки бактерий R. ruber AC-1513D. Микроскоп Биомед (Россия) с насадкой БиомедЛюм 206070112209 и цифровой камерой для микроскопа Myscope 500М (увеличение в 100 раз).
Следует отметить, что в процессе раздельного культивирования бактерий в богатой питательной среде в случае клеток P. esterophilus происходило постепенное закисление среды, при котором значение рН среды снижалось с 7 до 6,2, а в случае клеток R. ruber AC-1513D - защелачивание, и значение рН среды повышалось с 7 до 8,2. При совместном культивировании бактерий значение рН среды оставалось нейтральным, что, возможно, благоприятно отражалось на росте и развитии клеток обоих микроорганизмов.
Из Рис. 44 следует, что при использовании ИМК в качестве инокулята в среде культивирования одновременно присутствовали клетки Г(-)-бактерий P. esterophilus (красное окрашивание) и Г(+)-бактерий R. ruber AC-1513D (синее окрашивание). Это свидетельствует о том, что созданный консорциум после многократного использование (Рис. 42) содержит клетки обеих культур, которые далее способны функционировать в богатой питательной среде, по-видимому, не подавляя рост и развитие друг друга.
Также были проведены исследования постоянства состава разработанного консорциума при его функционировании в условиях среды, содержащей только параоксон (0,5 мМ) в качестве единственного источника углерода. Для этого свободные клетки бактерий (1 г/л) P. esterophilus и R. ruber AC-1513D, взятые в соотношении 2:1 (по массе), экспонировали в среде с пестицидом в течение 24 ч. Далее биомассу клеток бактерий высевали на чашки Петри с агаризованной питательной средой LB и анализировали образующиеся колонии. Анализ полученных данных показал, что на агаризованной среде присутствовали плоские белые колонии бактерий P. esterophilus и выпуклые оранжевые колонии бактерий R. ruber AC-1513D.
Поскольку консорциум представлял собой смесь клеток P. esterophilus и R. ruber АС-1513D, взятых в соотношении 2:1 (по массе), то можно было оценить соотношение количества клеток в консорциуме. С учетом того, что масса одной клетки R. ruber АС 1-5 1-5 1513D равна 5 10" г, а масса одной клетки P. esterophilus равна 3 10" г, то в среднем, в разработанном консорциуме на одну клетку R. ruber AC-1513D приходилось три клетки P. esterophilus. Рассчитанное соотношение согласуется с результатами, полученным на основании подсчета колониеобразующих единиц на чашках Петри. Это свидетельствовало о том, что в процессе функционирования разработанного консорциума соотношение количества клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D не изменялось, и состав консорциума оставался без изменений.
Таким образом, клетки бактерий P. esterophilus и R. ruber AC-1513D были способны функционировать в консорциуме, не подавляя рост и развитие друг друга. Также было продемонстрировано постоянство состава разработанного консорциума при его экспонировании в среде с пестицидом.
Разработанный оптимизированный по составу ИМК был использован для деградации различных ФОП в минимальной среде Раймонда (Табл. 25).
Степень деградация и начальная скорость деградации 0,15 мМ ФОП за 24 ч под действием оптимизированного по составу ИМК (20 Гклеток/л) с 30%-ным содержанием биомассы клеток и размером гранул 50±Ю мкл. ФОП Начальная скоростьдеградации, мкМ/ч Степень деградации, % паратион 12,0 ±0,3 96 ±4 метилпаратион 10,2 ±0,3 83 ±5 диазинон 19,2 ±0,3 100 ±4 хлорпирифос 18,0 ±0,3 100 ±4 малатион 24,0 ± 0,4 100 ±4 диметоат 8,4 ± 0,2 74 ±4 деметон-S 13,2 ±0,3 91 ±5 Структуры пестицидов см. Табл. 1. Оказалось, что ИМК, полученный на основе клеток P. esterophilus и R. ruber АС-1513D, осуществлял эффективную деградацию всех исследованных ФОП. При этом в большинстве случаев степень деградации пестицидов за 1 сутки была больше 90%.
Как отмечалось ранее, консорциум микроорганизмов является многофункциональным биокатализатором, обладающим широким спектром активностей, которые складываются из активностей культур, входящих в его состав. Это позволяет консорциуму функционировать в различных многосубстратных системах и осуществлять комплексный подход к решению сложных экологических задач.
Ранее было показано, что разработанный ИМК, обладает ФОС-деградирующей активностью и успешно осуществляет биодеградацию параоксона и ПНФ. Наряду с этим известно, что клетки R. ruber AC-1513D, входящие в состав исследуемого консорциума, являются нефтедеструкторами и способны деградировать углеводороды, проявляя высокую нефтеокисляющую активность [158]. В связи с этим было проведено исследование функционирования ИМК в сложной многосубстратной системе в течение 144 ч. Для этого разработанный консорциум в концентрации 22,5 Гкдеток/л вводился в ПО минимальную среду, одновременно содержащую параоксона, в качестве пестицида, и гексадекан, в качестве углеводорода нефти. Целью данного эксперимента являлось определение влияния исходных концентраций этих соединений на параметры их деградации под действием разработанного ИМК в средах с одновременным присутствием ФОС и углеводорода нефти (Табл. 26).
Консорциум на основе клеток бактерий, осуществляющих деградацию ФОС
Полученное множественное выравнивание характеризовалось высокой степенью согласованности, равной 91% (Рис. 59). При этом области высокой согласованности чередовались с областями с инсерциями и делециями. Основные участки с инсерциями и делециями были обозначены, как Область 1, Область 2, Область 3, Область 4.
При сравнении полученного выравнивания с выравниванием, представленным ранее (Рис. 54), оказалось, что Область 1 соответствует Петле 1, Область 3 - Петле 7, Область 4 - Петле 8. Как отмечалось ранее, Петли 1, 7, 8 отвечают за организацию субстрат-связывающего сайта у ферментов ОРН, SsoPox и, по-видимому, АЫА [104-106, ПО, 214, 220, 223].
Таким образом, наибольшим эволюционным изменениям оказались подвержены Петли, отвечающие за связывание субстрата. Эти изменения могли приводить к возникновению новых ферментов, обладающих другой субстратной специфичностью по сравнению с ферментом-предшественником. Изменения аминокислотного состава, не затрагивающие активный центр ферментов, по-видимому, могут носить компенсаноторный характер или являться координированными заменами, направленными на поддержание целостности структуры фермента и его каталитических свойств после эволюционно-обусловленных замен определенных аминокислотных остатков [233].
Данные предположения коррелировали с результатами известных экспериментов по направленной эволюции in vitro, которые показали возможность быстрого развития «новой» активности у ферментов благодаря ограниченному количеству мутаций в условиях, благоприятных для эволюции [234].
В этой связи лактоназная активность у ферментов ОРН и His6-OPH может являться остаточной чертой «прародителя». Предположение о том, что ОРН могла возникнуть из фермента, принадлежащего к группе PLL («фосфотриэстераз, подобных лактоназам»), ранее высказывалось в литературе [171], но не было экспериментальных фактов, подтверждающих его. Установление наличия лактоназной активности у His6-OPH (и, следовательно, у ОРН) по отношению к АГЛ и ФОС-деградирующая активность клеток R. erythropolis 1514D и R. ruber 1513D (Табл. 22), обусловленная, вероятно, присутствием в них N-ацилгомосеринлактоназ, изменили ситуацию. В этой связи результаты, полученные в данной работе, имеют большую фундаментальную значимость, поскольку АГЛ являются широко распространенными в природе соединениями, а природный субстрат ОРН до сих пор неизвестен [235].
Впервые была показана лактоназная активность His6-OPH, проявляющаяся в расщеплении С-0 связи в различных по структуре молекулах АГЛ. При этом константы эффективности действия Hise-OPH фермента в этих реакциях оказались выше большинства известных лактоназ.
Установление высокой гомологии и идентичности активных центров наряду с установленной перекрестной субстратной специфичностью ферментов АЫА и ОРН позволили обосновать гипотезу эволюционного родства ОРН и N-ацилгомосеринлактоназ из клеток рода Rhodococcus, а также сделать вывод о локализации эволюционно изменчивых областей в молекулах данных ферментов.
Обобщая представленные результаты, можно отметить, что научная новизна работы состоит в следующем: впервые создан оригинальный ИФБК на основе фермента His6-OPH и целлюлозосодержащих материалов, предназначенный для введения в почвогрунты, загрязненные высокими концентрациями различных ФОС, с целью их быстрой и высокоэффективной детоксификации; впервые разработан искусственный консорциум на основе грамотрицательных (P. esterophilus) и грамположительных (R. ruber AC-1513D) клеток бактерий, предназначенный для очистки водных систем и почвогрунтов от ФОС. Подобраны условия получения наиболее активной иммобилизованной формы этого консорциума, и впервые показана эффективная деградация разных ФОС под действием такого искусственного консорциума, а на примере параоксона продемонстрировано разложение не только самого пестицида, но и продукта его гидролиза - п-нитрофенола (ПНФ); S впервые выявлена лактоназная и ОРН-активность у грамположительных клеток бактерий R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D. Показана возможность увеличения этих активностей у клеток при внесении N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ) в среды для их культивирования и при использовании сред, полученных после выращивания грамотрицательных клеток Pseudomonas sp. 78Г и P. esterophilus, продуцирующих АГЛ; S высказано научно обоснованное предположение о причине успешного действия иммобилизованного микробного консорциума (ИМК), созданного на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D и предназначенного для деградации ФОС и детоксификации экосистем. Причина заключается в индукции лактоназной, а следовательно, и ОРН-активности у клеток R. ruber AC-1513D под действием АГЛ, синтезируемых клетками P. esterophilus при их сокультивировании; впервые выявлена лактоназная активность у His6-OPH, проявляющаяся в расщеплении С-0 связи в молекулах АГЛ, и предложен механизм действия фермента по отношению к данным субстратам. Установлено, что константы эффективности действия His6-OPH в этих реакциях выше, чем у большинства известных N-ацилгомосеринлактоназ; S установленная высокая гомология, идентичность активных центров и перекрестная субстратная специфичность N-ацилгомосеринлактоназ из клеток рода Rhodococcus и ОРН позволили обосновать гипотезу эволюционного происхождения ОРН из N-ацилгомосеринлактоназ и сделать вывод о локализации эволюционно изменчивых областей в молекулах данных ферментов в области субстрат-связывающего сайта.
