Введение к работе
Актуальность работы
Ферментативная деградация нерастворимых полисахаридов - одна из наиболее важных реакций на земле. Гликозил-гидролазная атака таких полисахаридов относительно неэффективна, так как ее цель - гликозидные связи - часто недоступна для активного сайта соответствующего фермента. Многие гликозил-гидролазы, разрушающие нерастворимые субстраты, состоят из нескольких модулей - функционально и пространственно обособленных глобулярных доменов. Такие гликозил-гидролазы включают в себя каталитический модуль в сочетании с одним или более некаталитическими, в основном, углевод-связывающими модулями (сокращенно СВМ). В виду центральной роли, которую СВМ играют в ферментативном гидролизе структурных и резервных полисахаридов, лиганд-специфичность, проявленная этими модулями, и механизм, посредством которого они узнают свою цель, привлекают пристальное внимание исследователей с момента их открытия, около 30 лет назад. Сотни СВМ на данный момент идентифицированы экспериментально, несколько тысяч СВМ могут быть идентифицированы на основании анализа аминокислотных последовательностей. Аналогично каталитическим модулям гликозил-гидролаз, СВМ распределены по семействам исходя из гомологии их аминокислотных последовательностей. Сформировано более 60 семейств СВМ, и эти СВМ демонстрирует значительное различие в субстратной специфичности. Были охарактеризованы СВМ, связывающие кристаллическую и аморфную целлюлозу, хитин, глюканы с различными Р-связями, ксилан, галактан и крахмал. Изучение свойств разных СВМ важно как для понимания фундаментальных механизмов гидролиза сложнейших природных полисахаридов, так и для биотехнологии. Особый интерес для биотехнологического использования имеют СВМ из термофильных гликозилгидролаз, сохраняющие свою стабильность при температурах 70-90 С.
В последние годы отмечен большой рост числа публикаций, посвященных прикладному использованию СВМ. Можно выделить следующие свойства СВМ, позволяющие использовать их как универсальный инструмент в молекулярной биотехнологии: автономность в составе исходных гликозил-гидролаз и сохранение свойств после отделения от остальной молекулы, а также в составе химерных белков, способность к специфическому связыванию с полисахаридами - дешевыми и экологически безопасными носителями.
Основным направлением в исследованиях, посвященных практическому использованию СВМ, является разработка способов иммобилизации на полисахаридах гибридных
белков на основе промышленно значимых ферментов и СВМ. Основными достоинствами метода является дешевизна и нетоксичность природного сорбента, специфичность взаимодействия и высокий выход активного белка при иммобилизации, а также одностадийность очистки и иммобилизация целевого белка.
Существенна также возможность использования СВМ в иммунохимии для очистки или детектирования интересующих химических соединений с помощью антител с СВМ. Гибридный белок из СВМ и антитела, специфичного в отношении определенных биологических соединений, иммобилизованный на субстрате, может быть использован для высокоэффективной очистки этих соединений.
Работа поддержана грантами РФФИ: 03-04-48610-а «Изучение структуры и свойств новых мультимодульных гликозилгидролаз; исследование субстрат связывающих модулей и их использование в генной инженерии и биотехнологии»; 06-04-483 51-а «Структура и функции бактериальных мультимодульных ферментов, гидролизующих растительные субстраты; изучение и использование изолированных модулей»; 09-04-00204-а «Поиск и исследование новых гликозид гидролаз; изучение свойств вспомогательных модулей мультимодульнх ферментов». Цели и задачи исследования
Целью работы являлось изучение свойств некаталитических модулей, входящих в состав ламинариназы Licl6A (номер по классификации ферментов КФ 3.2.1.6) из термофильного микроорганизма Clostridium thermocellum. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Получить делеционные производные, содержащие помимо каталитического модуля прилегающие к нему субстрат-связывающие модули и изучить влияние, которое они оказывают на свойства каталитического модуля.
-
Получить изолированный N-концевой модуль ламинариназы Licl6A и исследовать его свойства.
-
Получить изолированные С-концевые СВМ, а также тандем этих модулей, изучить их субстрат-связывающие свойства, а также их взаимодействие друг с другом.
Научная новизна
В представленной работе охарактеризован неизвестный ранее СВМ с широкой субстратной специфичностью, обладающий сродством к нерастворимым полисахаридам. Найдены гомологи к этому белку и сформировано новое 54-е семейство СВМ, зарегистрированное на сайте, посвященном углевод-активным ферментам (CAZY). СВМ54 расположен в N-концевой области Lie 16А, ранее представлявшим собой участок с неизвестными функциями.
CBM54 содержит не менее двух сайтов связывания, один из которых локализован на N-конце СВМ54, является кальций-независимым и специализируется на связывании глюкозидов; второй расположен на С-конце, кальций-зависимый, с более широкой субстратной специфичностью, связывает помимо глюкозидов, глюкозаминозиды (хитин и хитозан) и пентозиды. Показано, что расположенные тандемом на С-конце Licl6A СВМ, относящиеся к 4 семейству, способны связывать кристаллическую целлюлозу, что является нетипичным для этого семейства. Наибольшее сродство С-концевые модули проявляют к Р-глюкану клеточной стенки дрожжей, ксилану, бактериальной кристаллической целлюлозе и пустулану - тем субстратам, которые не гидролизуются каталитическим модулем Licl6A. В то же время отсутствует сродство к лихенану и ламинарину - субстратам, на которых ламинариназа Licl6A имеет наивысшую активность. Обнаружен синергизм при связывании тандема С-концевых модулей с авицелом, Р-глюканом и пустуланом. Константа связывания тандема превышает константы связывания отдельных модулей на этих субстратах в 100-1000 раз. Обнаруженный в данной работе синергизм свидетельствует о биологической целесообразности наличия у многих гидролаз прокариот повторов двух и более СВМ. Практическая значимость работы
Определены свойства перспективных для биотехнологии СВМ 4-го и 54-го семейств. Изучены их субстратная специфичность и константы связывания. Полученные в работе данные позволяют использовать эти СВМ в биотехнологии для иммобилизации и очистки широкого спектра биологических соединений, включая ферменты, а также в иммунологии и медицине для создания нового поколения высокоочищенных поливакцин и поливалентных лекарственных средств. Для СВМ 54 показана широкая субстратная специфичность в отношении ряда нерастворимых полисахаридов, в том числе способность связываться с хитином и хитозаном. Хитозан давно используется в качестве лекарственного препарата, на его основе с использованием СВМ54 возможно создание поливалентных лекарств и вакцин. Апробация работы
Результаты работы были представлены следующих конференциях: IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 2008), Международная Научная Конференция «Фундаментальные и прикладные достижения в биологии», (Донецк, 2009), V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011). Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации
