Содержание к диссертации
Введение
1. Термостабильная лихеназа clostridium thermocellum как представитель бактериальных гликозилгидролаз: свойства и структура 9
2. Гликозилгидролазы в фундаментальных и прикладных исследованиях 14
2.1. Современные направления белковой инженерии: рациональный дизайн и направленная эволюция ферментов и белков 14
2.2. Изучение молекулярных основ термостабильности и фолдинга белков с использованием ферментов термофильных организмов 18
2.3. Термостабильные гликозилгидролазы в прикладных исследованиях 27
3. Репортерные системы и возможности их применения для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов 31
3.1. Основа методологии репортерных систем 32
3.2. В каких исследованиях используют репортерные системы 33
3.2.1. Изучение активности и индуцибельности промоторов и регуляторных элементов (транскрипционныерепортеры) 34
3.2.2. Поиск новых промоторов и регуляторных элементов 35
3.2.3. Определение локализации продуктов исследуемых генов (трансляционные репортеры) 35
3.2.4. Система доставки генов или продуктов генов к клеткам-мишеням. Генотерапия 36
3.3. Основные репортерные системы: преимущества и недостатки 37
3.3.1. р-глюкуронидаза (GUS) E.coli 39
3.3.2. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) Aequoria victoria 40
3.3.2.1. GFP-подобные белки 43
3.3.3. Термостабильная лихеназа (LicB) С. thermocellum 43
4. Материалы и методы исследований 48
5. Результаты и обсуждения 67
5.1. Термостабильная лихеназа как транскрипционный репортер в оригинальной дрожжевой векторной системе для изучения регуляторных функций некодирующнх последовательностей геномов эукариот 67
5.2. Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер 75
5.2.1. Лихеназа как трансляционный репортер для RecA белка Е. со И. 76
5.2.2. Лихеназа как трансляционный репортер для белка СгуЗА B.thuringiensis 79
5.3. Термостабильная лихеназа как репортерный белок-носитель для случайных и антигенных пептидов 83
Заключение 115
Выводы 117
- Изучение молекулярных основ термостабильности и фолдинга белков с использованием ферментов термофильных организмов
- В каких исследованиях используют репортерные системы
- Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер
- Термостабильная лихеназа как репортерный белок-носитель для случайных и антигенных пептидов
Введение к работе
Впервые термофильная анаэробная бактерия Clostridium thermocellum была описана Viljoen в 1926 году [МсВЕЕ, 1954}. С. thermocellum секретирует белки, V объединяющиеся в высокомолекулярные мул ьти ферментные комплексы, структура которых способствует быстрому гидролизу кристаллической целлюлозы.
Изучением ферментов целлюлолитического комплекса С. thermocellum занимаются во многих странах мира: В Израиле в Вейцмановском институте и в
Биотехнологическом центре Тель-Авивского Университета, во Франции в
Институте им. Пастера, в Германии в Институте Микробиологии Мюнхенского технологического университета, в Англии в Институте животноводства .у (Кембридж). В России эти работы были начаты в начале 80-х годов под руководством профессора Э.С. Пирузян со штаммом Ф7 С. thermocellum и далее продолжены в лаборатории молекулярной генетики анаэробов в Институте молекулярной генетики РАН и в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики РАН [Пирузян и др., 1985; Пирузян и др., 1990; Bumazkin В.К. et al., 1990; Tuka etal., 1992; Голденкова, 2002].
Актуальность темы диссертационной работы. В последние годы уделяется много внимания использованию термостабильных ферментов, особенно гликозилгидролаз, в биотехнологии. Помимо этого, і гликозилгидролазы термофильных бактерий являются удобными моделями и для изучения многих фундаментальных проблем: молекулярных основ термостабильности, укладки (фолдинга) белковых молекул, функциональных элементов каталитических и некаталитических модулей ферментов и рада других. Ранее в нашей лаборатории был клонирован ген, кодирующий термостабильную Р-1,3;1,4-глюканазу (лихеназу) С. thermocellum, и было показано, что ген термостабильной лихеназы является удобным репортерным геном для клеток про- и эукариотических организмов. Ген термостабильной лихеназы транзиентно и стабильно экспрессируется в клетках бактерий, цианобактерий, дрожжей, растений и млекопитающих с образованием активного и термостабильного фермента, а уровень экспрессии бактериального гена лихеназы зависит от регуляторного элемента, контролирующего его экспрессию. Активность термостабильной лихеназы может быть определена простыми, быстрыми, чувствительными качественными и количественными методами, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов.
Области использования термостабильной лихеназы для фундаментальных и прикладных исследований могут быть расширены, поскольку она обладает уникальными свойствами - высокой удельной активностью и термостабильностыо. Поэтому изучение структуры и свойств термостабильной лихеназы, модификация ее последовательности, а также конструирование на ее основе гибридных белков и белков-носителей являются перспективными направлениями исследований.
Цель исследования: изучить возможности использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного, трансляционного репортера и репортер но го белка-носителя случайных или антигенных пептидов. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
1. Изучить возможность использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного репортера для изучения функциональной значимости некодирующих последовательностей геномов, для этого: - разработать дрожжевую векторную конструкцию, содержащую два противоположно ориентированных репортерных гена (термостабильной лихеназы и р-глюкуронидазы) и не кодирующую последовательность генома человека (LTR HERV-K); - изучить экспрессию репортерных генов, находящихся под контролем LTR HERV-K, в клетках низших эукариот - дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
2. Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка для клеток про- и эукариот, для этого: - сконструировать гибридные гены, в которых последовательность гена лихеназы слита в рамки считывания с последовательностями бактериальных генов сгуЗа и сгуЗаМ Bacillus thuringiensis, а также гесА и recAl E.coli; - провести сравнительный анализ экспрессии нативных и гибридных генов в клетках про- и эукариот.
3. Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве репортерного белка-носителя случайных и антигенных пептидов, для этого: провести анализ трехмерной структуры термостабильной лихеназы и выбрать в молекуле лихеназы петлевые участки, которые могли бы использоваться для интеграции последовательностей пептидов; провести молекулярный дизайн последовательности гена термостабильной лихеназы, на основе которого сконструировать модифицированные варианты фермента, у которых в области петлевых участков добавлен линкер, и «циклически перестановленные» варианты, у которых С- и N-концевые области нативного фермента соединены линкером, а новые С- и N-концевые участки сформированы в петлевых участках; провести сравнительный анализ биохимических свойств модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы; сконструировать гибридные гены, в которых последовательность, кодирующая случайный пептид (EGFP), встроена в последовательности модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы как внутренний гетерологичный модуль фермента; провести сравнительный анализ биохимических свойств гибридных белков.
Изучение молекулярных основ термостабильности и фолдинга белков с использованием ферментов термофильных организмов
Важный аспект фундаментальных исследований ферментов из термофильных микроорганизмов - это изучение молекулярных основ их термостабильности. В обзоре Янике (1998) в отношении закономерностей, присущим белкам термофилов, дается следующее обобщение: 1. Белкам термофилов присущ высокий уровень стабильности: стабильность становится ограниченной при оптимальной температуре их функционировании, как и в случае белков мезофиллов. 2. Имеющиеся данные по структуре доказывают, что белки термофилов очень сходны со своими мезофильными аналогами как по топологии, так ферментативному механизму. 3. Корреляция между заменами аминокислотной последовательности и изменениями термостабильности сложна и не позволяет в настоящее время выявить общие закономерности. 4. Данные рентгеноструктурного анализа высокого разрешения и ЯМР подтверждают кумулятивный механизм стабильности, что позволяет в ряде случаев определить некоторые общие принципы термостабильности. Исследования первичной и пространственной структуры термостабильных ферментов выявило ряд существенных особенностей их строения, отличающих эти ферменты от мезофильных гомологов [Патрушев, 2004]. В частности, для ферментов термофилов характерно наличие развитой сети внутримолекулярных ионных взаимодействий, в том числе и между субъединицами [Yip et al., 1998]. Это приводит к формированию у таких ферментов более компактной пространственной структуры. Тем не менее, данный механизм стабилизации термостабильных ферментов не является универсальным, и у гомологов различных видов термофилов могут быть задействованы разные механизмы, например, дополнительные гидрофобные взаимодействия вместо ионных. Так у р-гликозидазы Sulfolobus solfataricus развитая сеть ионных взаимодействий на поверхности молекулы сочетается с наличием гидрофильных каналов, проникающих глубоко в белковую глобулу, что способствует стабилизации этого фермента [Aguilar et al., 1997]. Основываясь на знаниях механизмов функционирования термостабильных ферментов, рядом исследовательских групп, были предприняты попытки увеличить термостабильность ферментов. Эти попытки принесли определенные плоды.
Так, введение в белок «malic enzyme» дополнительных внутримолекулярных ионных связей, путем добавления в полипептидную цепь новых а.о., приводило к увеличению его термо стабильности и повышению устойчивости к действию мочевины, хотя ценой уменьшения активности [Hough et al., 1999]. Подобная работа (введение дополнительной дисульфид ной связи в белковую молекулу) была проведена на термолизинподобной протеиназе умеренного термофила Bacillus stearothermophillus. Это позволило в 340 раз повысить стабильность фермента при 100С по сравнению с исходным белком и сохранить исходную удельную активность [Mansfeld et al., 1997; Van de Burg et al., 1998]. Группа японских исследователей использовала мезофильную щелочную [3-1,4-глюканазу из штамма KSM-64 Bacillus sp. По аминокислотной последовательности этот фермент имеет высокую степень гомологии с термостабильным ферментом Bacillus sp., штамма KSM-S237. Сравнительные исследования мезофильного и термо стабильного ферментов позволили предположить, что остатки лизина в положении 137, 179 и 194 являются необходимыми в проявлении термостабильности. Замена а.о. в этих положения на лизин у мезофильного фермента приводила к увеличению его термостабильности. Было показано, что эти остатки лизина локализованы на поверхности молекулы фермента. Эти экспериментальные данные также свидетельствуют о значимости специфических ионных взаимодействий в термостабильности фермента [Hakamada et al., 2001]. В настоящее время установлено, что термостабильность фермента и его способность катализировать химическую реакцию, по крайней мере, частично не зависят друг от друга, при этом мутации, которые усиливали бы данные свойства, встречаются редко [Hough et al., 1999; Патрушев, 2004]. Весьма интересным является тот факт, что для ферментов психрофильных организмов (ферменты психрофиллов функционируют в условиях низких температур и быстро инактивируются уже при умеренных температурах) характерна более высокая гибкость полипептидных цепей по сравнению с соответствующими функциональными аналогами мезофильных организмов. Кроме того, защита таких ферментов от денатурации в условиях низких температур частично достигается ослаблением гидрофобных внутримолекулярных взаимодействий [Russell et al., 1998]. К началу 1990-х годов группа немецких ученых из Берлинского университета им. Гумбольта осуществила определение трехмерной структуры близкородственных эндо-рМ,3;1,4-глюканаз (лихеназ) семества 16 из B.macerans и В. licheniformis. Эти ферменты являются гликозил гидролазами и имеют высокую степень гомологии (около 66%) аминокислотных последовательностей и близкие физико-химические свойства. В результате рентгеноструктурного анализа были выявлены только не значительные различия между этими белками в укладке полипептидной цепи [Hahn et at, 1995]. Этой группой исследователей были получены гибридные белки, состоящие из частей аминокислотных последовательностей этих двух близкородственных лихеназ. Один из таких гибридов - Н(А16-М) - продемонстрировал (при сохранении высокой активности) несколько увеличенную термостабильность по сравнению с исходными формами [Olsen et al., 1991], Он образован аминокислотными остатками с 1 по 16 зрелой (без лидерного пептида) В-1,3;1,4-глюканазы В. amiloliquefaciens и остатками с 17 по 214 такого же фермента B.macerans.
Гибридная р-глюканаза сворачивается в один компактный глобулярный домен и имеет высокую степень подобия формы молекулы и укладки полипептидной цепи с нативными ферментами. Для проверки гипотезы «векторного сворачивания», предполагающей сворачивание с N-концевого сегмента в виде ядра определенной конформации, которая затем определяет укладку остальной части молекулы, немецкими учеными была использована стратегия «circularly permutated» белков [Hahn et al.s 1994]. «Circularly permutated» белки - это белковые молекулы, у которых N- и С-концы нативной молекулы соединены линкером, а новые концы создаются в той позиции, которая интересует исследователя. В большинстве случаев вновь созданные концы белковой молекулы располагаются в поверхностных петлях или междоменных структурах. В качестве модели использовали гибридную р-1,3;1.4-глюканазу (ЩА16-М)), у которй N- и С-концы пространственно сближены. Такая укладка позволяет выявить влияние «circularly permutated» («круговой перестановки») части полипептидной цепи на формируемую трехмерную структуру молекулы и ее ферментативные свойства. Была создана генно-инженерная конструкция, кодирующая рекомбинантный фермент, в котором фрагмент, соответствующий аминокислотам с 17 по 58 Н(А16-М), переставлен на С-конец того же белка, образуя белок срА16М-59. Подобная же перестановка была проведена для последовательности р-1,3;1,4-глюканазы В. macerans (BGLM) с образованием «circularly permutated» фермента срМАС-57. Экспрессия генов «circularly permutated» ферментов в E.coli продемонстрировала, что такие белки секретируются в периплазму, корректно процессируются и образуют активные и стабильные ферменты [Hahn et al., 1994]. У обоих «circularly permutated» ферментов Km не изменилась, kkat немного уменьшилась, практически не изменились значения оптимальной температуры гидролиза. Однако период термоинактивации значительно уменьшился — продукты «циклических перестановок» стали мене термостабильными. В частности, эта величина (при 70С и рН 5.0) для срА16М-59 составила 46 мин вместо 137 мин у Н(А16-М) и для срМАС-57 около 8 мин вместо 30 у BGLM. Рентгеноструктурный анализ показал, что трехмерная структура срА16М-59 сходна с таковой для ЩА16-М). Незначительные отличия коснулись только локальных боковых петель, не затрагивая фолдинга белка в целом. Эти результаты являются важным вкладом в понимание принципов образования третичной структуры.
В каких исследованиях используют репортерные системы
Методология репортерных систем позволяет осуществлять контроль за временной и пространственной экспрессией генов во время таких сложных процессов как клеточный цикл, при воздействии на клетки гормонами, факторами роста, питательными веществами, факторами внешней среды; изучать механизмы сортировки, транспорта и внутриклеточной локализации белков; проводить проверки большого числа клеточных линий к лекарственной чувствительности или устойчивости; осуществлять слежение за «доставкой» генов (gene delivery), а также использовать их для других целей [Патрушев, 2000; Голденкова, 2002; Патрушев, 2004]. 3.2.1. Изучение активности и индуцибельности промоторов и регуляторных элементов (транскрипционные репортеры) В этой области используются те репортерные системы, которые имеют простые высокочувствительные количественные методы определения активности репортерного белка, и, вместе с тем, позволяют проводить динамические исследования включения и выключения транскрипции (имеют небольшой период полужизни и/или время созревания продукта, чтобы быстрые изменения транскрипции репортерного гена приводили к быстрым изменениям уровня активности репортерного белка). В регуляции транскрипции могут участвовать различные цис- или трансдействующие элементы, такие как энхансеры и репрессоры. Их участие в процессах регуляции экспрессии генов также можно изучать с помощью репортерных генов, располагая эти последовательности перед геном, слитым с промотором [Wang, 2002]. С использованием репортерных систем изучают циркадные ритмы растений [Michelet & Chua, 1997], регуляцию транскрипции целого рада генов насекомых [Brandes et al., 1996] и млекопитающих [Rutter et al.s 1995; Watson et al., 1998; White et al., 1995]. Репортерные системы позволяют точно определять функции регуляторных последовательностей в регуляции экспрессии генов в ответ на действие различных факторов (гормонов, интерлейкинов, транскрипционных факторов и др.), а также идентифицировать гены, продукты которых являются причиной ряда заболеваний человека (галактоцереброзидаза, маммаглобин) [Bamberger et al., 1997; Luzi et al., 1997]. 3.2.2. Поиск новых промоторов и регуляторных элементов Для этих целей используется следующая стратегия: создается конструкция, в которой последовательность репортерного гена не контролируется каким-либо регуляторным элементом.
Данной конструкцией трансформируют клетки исследуемого организма, и присутствие репортерного белка в трансформированных клетках свидетельствует о том, что встройка последовательности репортерного гена произошла таким образом, что его экспрессия контролируется промотором в геноме клетки-хозяина. Анализ размера мРНК репортерного гена позволяет оценить расстояние от точки начала транскрипции, осуществляемой с промотора или регуляторной последовательности, до начала репортерного гена, что позволяет осуществить клонирование этой области [Luzi et al., 1997]. 3.2.3. Определение локализации продуктов исследуемых генов (трансляционные репортеры) Используя репортерные системы, можно определять локализацию продукта изучаемого гена. Благодаря лидерным сигналам клеточные компоненты осуществляют транспорт белкового продукта в соответствующие компартменты клетки или за ее пределы. Использование репортерных систем позволяет не только установить места локализации продуктов генов или их взаимодействие с другими компонентами клетки, но и проследить за изменениями в локализации исследуемых белков в ответ на действие внутри-или внеклеточных факторов [Rossi et al., 1997]. 3.2.4. Система доставки генов или продуктов генов к клеткам-мишеням. Генотерапия Репортерные системы используются как маркеры для мониторинга транспорта и локализации трансгена (генотерапия), т.е. позволяют определять «успешную» доставку генов к тем или иным клеткам и их функционирование. Для этих целей используют бицистронные вектора, которые экспрессируют репортерный ген, и ген, который интересует исследователя (gene of interest). Методология репортерных систем широко используется и для выявления клеток-мишеней, к которым поставляются генные продукты, являющиеся терапевтическими препаратами. Это позволяет не только изучать механизм действия биологически активных веществ, но и разрабатывать новые лекарственные препараты для лечения многих заболеваний (болезнь Паркинсона, онкологические заболевания и др.) [Ferrari et al., 1997; Wiznerowicz et al., 1997; Eastman et al., 1998; Rancourt et al„ 1998]. 3.3. Основные репортерные системы: преимущества и недостатки К репортер ным генам и их продуктам предъявляется ряд требований.
Одно из них - простота и высокая чувствительность количественных и качественных методов определения активности репортерного белка на фоне других клеточных компонентов. Немаловажные факторы - это возможность проводить динамические наблюдения, как увеличения, так и уменьшения экспрессии генов (в этом случае важными характеристиками являются период полужизни и/или время созревания белка), отсутствие схожих активностей в клетках исследуемого организма, а также размер репортерного гена и его продукта (для удобства клонирования и анализа экспрессии репортерного белка) [Jefferson, 1987]. Важным свойством репортерных белков является возможность достроек в N- и С-концевых областях репортерного белка без потери его активности. Практически для всех репортерных белков известна трехмерная структура белковой глобулы, что в свою очередь значительно расширяет область их применения. В таблице 3.1 приведены свойства, преимущества и недостатки основных репортерных систем [Le Grice et al., 1980; Baldwin et al., 1984; Endebrecht & Silverman, 1984; de Wet et al., 1985; Gorman, 1985; Crabb & Dixon, 1987; Pazzagli et al., 1992; Jacobson et al., 1994; Manen et al., 1997, Голденкова, 2002], которые широко используются в научной практике, и более подробная характеристика трех репортерных систем (GUS, GFP и LicB), которые были использованы в нашей работе. Как видно из таблицы ЗЛ ни одна из используемых репортерных систем не является универсальной - все они наряду с преимуществами имеют недостатки, которые ограничивают их применение для целого ряда исследований [Rutter et al.,1998; Naylor 1999; Guivarc h et al., 1996]. Поэтому исследователям важно иметь в распоряжении несколько репортерных систем, которые можно использовать в одних и тех же клетках, либо пользоваться бифункциональными репортерными системами [Мусийчук и д.р., 2000; Голденкова, 2002]. Таблица 3.1. Свойства, преимущества и недостатки различных репортерных
Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер
Как уже упоминалось выше, используя репортерные системы, можно определять как уровень экспрессии исследуемых генов, так и локализацию их продуктов. Такие исследования проводятся с использованием трансляционных репортеров, последовательности которых слиты в рамке считывания с последовательностями интересующего исследователя гена. В наших исследованиях в качестве трансляционного репортерного белка была выбрана термостабильная лихеназа C.thermocellum (LicBM2). Основанием для этого послужили результаты ранее проведенных исследований по созданию и экспрессии бифункциональных репортерных систем на основе термостабильной лихеназы [Голденкова, 2003]. В работе использовали модельные гены: гесА, продукт, которого играет ключевую роль в процессах гомологичной рекомбинации и рекомбинационной репарации у E.coli; recAl, который имеет мутацию (замена глицина в 160 положении полипептида на аспарагин), приводящую к тому, что белковый продукт с низкой эффективностью связывается с ДНК [Bryant, 1988; Lauder et al., 1993]; нативный сгуЗа B.thuringiensis var. tenebrionis, кодирующий 5-эндотоксин токсичный для некоторых видов насекомых; ген сгуЗаМ, который кодирует 5- эндотоксин с оптимизированным кодоновым составом для эффективной экспрессии в клетках эукариот. 5.2.1. Лихеназа как трансляционный репортер для RecA белка Е. coli Ранее было показано, что белок recA E.coli стимулирует гомологичную рекомбинацию в растениях табака [Reiss et al, 1996; Reiss et ah, 2000]. Это позволяет полагать, что экспрессия в растениях гена гее А может изменить уровень и спектр генетической рекомбинации у растений. Для определения экспрессии гена recA в растениях требуется наличие специфических антител к RecA белку, либо использование трансляционного репортерного белка, по активности которого можно судить об экспрессии гетерологичных генов. В качестве репортерного белка для RecA нами было решено использовать термостабильпую лихеназу. Для этого нами были клонированы гены гее А и recAl. Эти гены использовались для получения гибридных генов гесА-ПсВЫ2 и гесА1-НсВМ2, в которых последовательности гее А и recAl генов слиты в рамке считывания с последовательностью репортерного гена ЯсВМ2, кодирующего термостабильную лихеназу (рис. 4.2 «Материалы и методы»).
Нативный (recA), мутантный (recAl) и гибридные гены были использованы для получения рекомбинантных плазмид, сконструированных на основе вектора рЕТ22Ь(+), и обозначены нами рЕТ22-п?сА, рЕТ22-гесА1, рЕТ22-гесА-//сВМ2 и рЕТ22-гесА1-/(сВМ2. Для изучения свойств нативного, мутантного и гибридных белков были получены соответствующие бактериальные трансфоманты, проведена ИПТГ- индукция и белковые лизаты были проанализированы методом электрофореза (рис. 5.3а). Как видно из представленных результатов в бактериальных трансформантах происходит образование белковых продуктов с молекулярными массами, которые соответствуют теоретически рассчитанным, а именно, RecA и RecAl - белки имеют массу около 40 кДа, гибридные белки RecA-LicBM2 и RecAl-LicBM2 — около 67 кДа. Методом энзимограмм было показано, что лихеназа в составе гибридных белков сохраняет свои свойства, а именно термостабильность и активность (рис. 5.36, просветленные пятна активности на энзимограмме на месте гибридных белков). Для того чтобы проверить сохраняются ли свойства RecA-белка в составе гибридного белка RecA-LicBM2, мы определили способность нативного, мутантного и гибридных белков связываться с одноцепочечной ДНК (оцДНК), и предохранять ее от расщепления нуклеазой SL Полученные результаты (рис. 5,3в) свидетельствуют о том, что только нативный RecA и гибридный RecA-LicBM2 белки способны связываться с одноцепочечной ДНК и предохранять ее от действия нуклеазы S1, тогда как мутантный RecAl и гибридный RecAl-LicBM2 белки такой способности не проявили. Открытие в начале XX века инсектицидного действия токсинов B.thuringiensis имело важные последствия в вопросе защиты растений от насекомых-вредителей. В настоящее время получены трансгенные растения кукурузы, картофеля, хлопка и т.д., экспрессирующие cry гены. Однако показано, что экспрессия нативных cry генов Bacillus в растениях, даже при переносе делеционных вариантов нативных генов, которые кодируют только токсическую часть белка, малоэффективна [Евстратова и д.р., 1988; Perlak et al., 1990; Perlak et al., 1993]. Причина низкого уровня экспрессии этих генов обусловлена, прежде всего, тем, что они содержат кодоны, которые редко используются в эукариотических клетках, а также потенциальные сайты деградации и полиаденилирования мРНК. Для определения экспрессии Сгу-белков обычно используют специфические антитела. В нашей лаборатории было предложено использовать для определения экспрессии Сгу-белков термостабильную лихеназу, в качестве трансляционного репортера. Ранее нами был клонирован ген сгуЪь. из В. thuringiensis и определена последовательность нативного гена. Для эффективной экспрессии в клетках эукариот мы оптимизировали кодоновый состав гена сгуЗа, модифицированный ген был обозначен нами сгуЗаМ [Салехи Джузани Г.Р. и др., 2004].
Далее были сконструированы гибридные гены сгуЗа-ИсВЫ2 и сгуЗаМ-//сВМ2, которые были клонированы в бактериальные и дрожжевые экспрессионные вектора, и получены рекомбинантные плазмиды рЕТ32-сгуЗа, рЕТ32-сгуЗаМ, рЕТ32-стуЗа- /; cBM2, рЕТ32-сгуЗаМ-Л сВМ2, pGal-cry3a-//cBM2 и pGal-cry3aM-/z cBM2 (рис. 4.2 «Материалы и методы»). Полученными плазмидами были трансформированы клетки бактерий и дрожжей. Бактериальные и дрожжевые трансформанты, экспрессирующие гибридные гены, были отобраны на соответствующих селективных средах и затем проанализированы методом чашечного теста по активности лихеназы (рис. 5.4). Как видно из рис 5.4, лихеназная активность выявлена только у трансформантов, несущих репортерный ген лихеназы или гибридные гены, в состав которых входит лихеназа. Для того чтобы доказать, что в бактериальных и дрожжевых трансформантах происходит синтез рекомбинантных белков, соответствующие белковые лизаты были проанализированы методом энзимограмм. Этот метод, наряду с возможностью определения активности лихеназы в составе гибридных белков, позволяет определять и молекулярные массы исследуемых белков. Несмотря на то, что в клетках Е. coli молекулярная масса белков Cry3a-LicBM2 и Cry3aM-LicBM2 составляет 105 кДа (рис. 5.5а, дорожки 2 и 3), а в клетках дрожжей - около 91 кДа (рис. 5.56, дорожки 1 и 2), молекулярные массы гибридных белков соответствуют теоретически рассчитанным. Различие в молекулярных массах гибридных белков на гелях обусловлены тем, что в бактериальных экспрессионных векторах рЕТ32-сгуЗа, рЕТ32-сгуЗаМ, рЕТ32-cry3a-frcBM2 и рЕТ32-с/73аМ-//сВМ2 между инициирующим ATG-кодоном и последовательностями, кодирующими гибридные белки, содержаться последовательности, кодирующие ряд пептидов (рис. 4.2 «Материалы и методы»), которые используются для очистки и выявления рекомбинантных белков. В дрожжевых экспрессионных векторах pGal-cry3a-//cBM2 и pGal-сгуЗаМ-#сВМ2 последовательности, кодирующие такие пептиды, отсутствуют. Для подтверждения того, что рекомбинантные белки Cry3a-LicBM2 и Cry3aM-LicBM2, проявляющие лихеназную активность, содержат последовательность Cry-белков, белковые экстракты бактерий и дрожжей были проанализированы методом Вестерн-блоттинга (рис. 5.5в). Было показано, что молекулярные массы гибридных белков, выявляемых с помощыо антител к СгуЗа-белку, соответствуют молекулярным массам гибридных белков, выявляемых на энзимограммах.
Термостабильная лихеназа как репортерный белок-носитель для случайных и антигенных пептидов
Эта часть работы посвящена использованию термостабильной лихеназы в качестве удобного репортерного белка-носителя для встраивания последовательностей случайных и антигенных пептидов. Поиск таких белков-носителей является актуальным, поскольку существуют проблемы при исследовании пептидных библиотек, например, при поиске изучении эпитопов и создания на их основе вакцин. Созданию и скринингу пептидных библиотек посвящено много работ [Davies, 2000; Farris et al., 2000; Gordon, 2002]. Эпитопы - это пептиды небольших размеров (от 6-10 а.о.), которые представляют собой часть антигена, взаимодействующую с паратопом (гипервариабельная часть антитела). Если эпитопы включают аминокислотные остатки, которые находятся далеко друг от друга в первичной последовательности, но собраны в один эпитоп в результате упаковки полипептидной цепи в нативном белке, то в этих случаях принято говорить о прерывистых или комбинированных эпитопах в отличие от непрерывных или секвенциальных эпитопах. Совокупность антигенных детерминант (эпитопов) вызывают наиболее сильный иммунный ответ, что предохраняет организм от повторной инфекции данным возбудителем. Определение вирусных антигенов в крови и других биологических жидкостях широко используется при диагностике вирусных инфекций. Наиболее имму ноге иные, защитные пептиды вирусов используются для создания синтетических вакцин. По строению они вариабельны даже у одного вида вирусов. В связи с этим изучение структуры и свойств эпитопов являются важными, поскольку проливает свет на понимание механизмов иммунного ответа [Geysen et ah, 1987; Geysen et al., 1988; Rodda, 1996], позволяет использовать эти данные для разработки новых вакцин [Viudes et al„ 2001], диагностических наборов [Vanniasinkam et al., 2001], в изучении онкологических и аутоиммунных заболеваний [Ward et al., .1997; Lane et al., 1996]. Картирование эпитопов позволило выяснить участки некоторых белков, ответственных за антигенность [Atassi & Lee, 1978]. Первоначально использовали следующие стратегии: гидролиз антигенных белков протеолитическими ферментами [Atassi & Saplin, 1968] и химическое «разрезание» белков на определенные участки [Atassi & Singhal, 1970].
Хотя использование таких стратегий привело к определенным положительным результатом, однако не позволяло проводить быстрый скрининг большого числа эпитопов. Это связано с тем, что в неочищенных препаратах пептидов через некоторое время большинство из них разрушаются. Помимо этого, необходимо проводить скрининг перекрывающихся пептидов, имеющих различную длину, для выяснения последовательности, которая может быть названа эпитопом (т.е. минимальный размер пептида, который вызывает максимальный ответ). Еще одна проблема в изучении эпитопов - это антигенность, т.е. способность этих пептидов, использованных как иммуногены, стимулировать образование антител, которые будут связываться с нативным белком. Многие пептиды могут проявлять иммуногенность, но многие и не проявляют таковой. Для усиления антигенности пептидов разработан следующий подход: пептидные препараты готовят таким образом, что каждый индивидуальный пептид имеет остаток цистеина на линкере, образованном дикетопиперазином. Такой «защищенный» пептид затем пришивают на белок-носитель с высокой иммуногенностью, и таким образом каждый индивидуальный пептид будет связан с иммуногенным белком-носителем [Maeji et al., 1990; Triantafyllou et al., 1992]. В дальнейшем была предложена концепция фагового дисплея, которая позволила создавать огромное число пептидных библиотек. Были разработаны следующие стратегии: экспрессия каждого индивидуального пептида на поверхности филаментных фагов [Scott & Smith, 1990]; «одна бусина - один пептид» [Lam et al., 1991] и ряд других [Houghten et al., 1991; Fodor et al., 1991; Frank, 1992]. Все вышеперечисленные подходы позволяют создавать пептидные библиотеки. Однако, использование пептидов как для фундаментальных исследований, так и в практических целях, например, для разработки вакцин и диагностических наборов, требует детального изучения каждого индивидуального пептида. Основными трудностями, с которыми сталкиваются исследователи при тестировании биологической активности различных белков или пептидов являются сложности в определении уровня их экспрессии в гетерологичном организме, стабильность соответствующих белковых продуктов in vivo и in vitro, а часто и токсичность исследуемого пептида или белка для клеток гетерологичного органиЗхМа. Кроме этого мРНК некоторых белков и пептидов имеют небольшой размер и могут восприниматься клеткой-хозяином как абберантные и подвергаться деградации. Для того чтобы преодалеть существующие трудности используют различные подходы. Одним из таких подходов может быть экспрессия изучаемого пептида в составе белка-носителя. Такое «сшивание» может стабилизировать структуру исследуемого пептида и его мРНК. На основании трехмерной структуры молекулы и основных свойств лихеназы С. thermocellum (высокой удельной активности и термостабильности) в нашей лаборатории была выдвинута гипотеза, что, термостабильная лихеназа может использоваться в качестве удобного репортерного белка-носителя для случайных и антигенных пептидов, а именно: 1. молекула лихеназы имеет на своей поверхности неструктурированные участки, в которые возможны достройки последовательностей случайных или антигенных пептидов, без потери основных свойств фермента; 2. по активности фермента можно судить о концентрации белка или о его сохранности; 3. свойство термостабильности может использоваться при очистке рекомбинантных белков.
Для того, что бы использовать лихеназу как репортерный белок-носитель, нужно было подобрать оптимальный делеционный вариант, который бы при сохранении своих основных свойств (активности и термостабильности) имел бы оптимальную молекулярную массу и достаточный уровень экспрессии в гетерологичном организме. Ранее в нашей лаборатории были получены и биохимически охарактеризованы два делеционных варианта лихеназы: LicBMI и LicBM2 (рис. 5.6 а) [Мусийчук и др., 2000]. Как видно из рисунка они содержали каталитический модуль, а также Про-Тре последовательность или ее часть (LicBM2) и «Dockerin» модуль (LicBMl). Как было показано ранее, Про-Тре последовательность и «Dockerin» модуль не оказывают значительного влияния на свойства фермента [Мусийчук и др., 2000]. Однако не исключено, что эти структурные элементы могут оказывать влияние на свойства лихеназы, как белка-носителя. Поэтому, интересным представлялось получить делеционный вариант, который содержал бы только исключительно каталитический модуль и выяснить его основные биохимические показатели. Методом молекулярного клонирования был получен соответствующий делеционный вариант, который получил название ЬісВМЗ (рис. 5.6 б). Первоначально, делеционный вариант ЬісВМЗ был экспрессирован в клетках E.coli и методами электрофореграмм и энзимограмм было показано, что в клетках бактерий происходит синтез соответствующего белкового продукта, молекулярная масса которого соответствует теоретически рассчитанной (25kDa) для делеционного варианта ЬісВМЗ, кроме того, данный вариант сохранил лихеназную активность (рис. 5.7).
