Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Вторичные метаболиты растений 8
1.2. Сапонины 11
1.2.1. Химическая природа сапонинов 11
1.2.2. Распределение сапонинов в растениях 13
1.2.3. Биосинтез сапонинов 16
1.2.4. Роль сапонинов в растениях 19
1.2.5. Биологическая активность сапонинов 21
1.2.6. Распространение сапонинов в растительном мире 24
1.2.7. Распространение сапонинов в семействе Fabaceae 25
1.3. Молекулярно-филогенетический анализ в систематике 30
1.3.1. Молекулярная филогенетика растений 31
1.3.2. Нуклеотидные последовательности, используемые в молекулярно-филогенетическом анализе 31
1.3.3. Группы генов ядерной рРНК и их изменчивость в эволюции 32
Глава 2. Объекты и методы исследования 37
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Аналитические методики 47
2.2.1. Качественное определение сапонинов в растениях 47
2.2.2. Определение суммы тритерпеновых сапонинов в растениях 50
2.2.3. Спектрофотометрическое определение тритерпеновых сапонинов в растении Anthyllis vulneraria 50
2.2.4. ВЭЖХ-анализ растений Trigonella foenum-graecum при определении содержания диосцина и протодиосцина 52
2.2.5. Определение общего азота и протеиногенных аминокислот 52
2.2.6. Определение содержания макро- и микроэлементов 53
2.3. Методы молекулярно-филогенетического анализа 53
Глава 3. Распространение сапонинов в семействе Fabaceae флоры европейского северо-востока России 56
3.1. Методология скрининга растений на содержание сапонинов 56
3.2. Распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России 57
Глава 4. Оценка представителей родов Hedysarum, Astragalus и Oxytropis по содержанию тритерпеновых гликозидов 75
4.1. Род Hedysarum 76
4.2. Род Astragalus 79
4.3.PoflOxytropis 83
Глава 5. Тритерпеновые гликозиды, аминокислоты и микроэлементы растений Anthyllis vulneraria L 86
5.1. Краткая ботаническая характеристика и практическое использование Anthyllis vulneraria L 86
5.2. Химический анализ растений A. vulneraria L 89
Глава 6. Оценка культивируемых растений Trigonella foenum-graecum L. по содержанию стероидных гликозидов, аминокислот и микроэлементов 93
6.1. Краткая ботаническая характеристика растения Tngonella foenum-graecum L 93
6.2. Опыт выращивания Trigonella foenum-graecum L. в подзоне средней тайги Республики Коми 94
6.3. Динамика содержания диосцина и протодиосцина в растении Trigonella foenum-graecum L. в культуре на Севере 99
6.4. Аминокислотный и микроэлементный состав травы Trigonella foenum-graecum L 104
Выводы 106
Литература 108
Приложение 123
- Вторичные метаболиты растений
- Распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России
- Химический анализ растений A. vulneraria L
- Динамика содержания диосцина и протодиосцина в растении Trigonella foenum-graecum L. в культуре на Севере
Введение к работе
Актуальность темы. Семейство Fabaceae Lindl. является одним из ведущих семейств во флоре европейского северо-востока России и насчитывает 61 вид из 16 родов. Среди бобовых много видов пищевых и кормовых растений, таких как виды рода астрагал (Astragalus L.) - а. альпийский (A. al- pinus Boriss. & Schischk.), а. цицер (A. cicer Boriss. & Schischk.), а. датский (A. danicus Retz.), а. холодный (A. frigidus (L.) A. Gray); рода чина (Lathy- rus L.) - ч. Гмелина (L. gmelinii Fritsch), ч. луговая (L. pratensis L.); рода клевер (Trifolium L.) - к. пашенный (T. arvense L.), к. полевой (T. campest- re L.), к. луговой (T. pretense L.); рода чечевица (Lens L.) - ч. обыкновенная (L. culinaris Medik.); рода горох (Pisum L.) - г. посевной (P. sativum L.) и рода фасоль (Phaseolus L.) - ф. обыкновенная (Ph. vulgaris L.). Благодаря высокому содержанию биологически активных веществ различной природы ряд видов этого семейства входит в Фармакопею Российской Федерации (Государственная фармакопея РФ, 2008) и других государств (Государственная фармакопея СССР, 1990), например, солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.), с. щетинистая (Glycyrrhiza echinata L.), с. уральская (Glycyrrhiza uralensis L.). Имеются многочисленные сведения о применении растений этого семейства в народной медицине: язвенник обыкновенный (Anthyllis vulneraria L.), копеечник альпийский (Hedysarum alpinum L.), пажитник сенной (Trigonella foenum-graecum L.). Несмотря на то, что в литературе имеются обширные сведения о химическом составе представителей данного семейства, данные о содержании стероидных и тритерпеновых сапонинов являются разрозненными и фрагментарными. Актуальность настоящего исследования заключается в необходимости разработки молекулярно- филогенетических и хемотаксономических подходов для установления закономерностей распространения стероидных и тритерпеновых гликозидов в семействе Fabaceae Lindl. Важным направлением исследований является выявление продуцентов тритерпеновых и стероидных гликозидов. Среди тритерпеновых гликозидов интерес представляют производные олеаноло- вой кислоты, среди стероидных гликозидов - диосцин и протодиосцин (производные диосгенина), которые используют в качестве полупродукта для микробиологического синтеза кортикостероидов. Протодиосцин применяют в составе антиатеросклеротических лекарственных препаратов (Авакян, 2006).
Цель работы: установление закономерностей распределения тритерпе- новых и стероидных гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России, а также определение состава и динамики их содержания в Anthyllis vulneraria и Trigonella foenum-graecum.
Задачи исследования:
-
разработать экспериментальные подходы к скринингу растений семейства Fabaceae на содержание сапонинов;
-
изучить распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России;
-
дать количественную биохимическую оценку перспективных представителей семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России по содержанию тритерпеновых гликозидов;
-
определить содержание производных олеаноловой кислоты в различных органах дикорастущих растений язвенника обыкновенного (Anthyllis vulneraria) на разных фазах развития, установить содержание общего азота, протеиногенных аминокислот и микроэлементов в растениях Anthyllis vulneraria;
5) определить содержание стероидных гликозидов в различных органах культивируемых растений пажитника сенного (Trigonella foenum-graecum), установить содержание общего азота, протеиногенных аминокислот и микроэлементов в растениях Trigonella foenum-graecum.
Научная новизна работы
На основании сравнения последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) рРНК исследуемых видов реконструировано филогенетическое древо семейства Fabaceae. С использованием молеку- лярно-филогенетического и хемотаксономического подходов впервые изучено распределение стероидных и тритерпеновых гликозидов в семействе Fabaceae и установлено, что большинство видов изучаемого семейства содержат тритерпеновые гликозиды. Стероидные гликозиды обнаружены только у представителей триб Trifolieae, Loteae и Thermopsideae.
Впервые определенно количественное содержание суммы тритерпено- вых гликозидов (СТГ) у горных видов родов копеечника (Hedysarum), астрагала (Astragalus), остролодочника (Oxytropis) флоры европейского северо-востока России и выявлены виды с наибольшим их содержанием.
Изучена динамика содержания производных олеаноловой кислоты в дикорастущих растениях Anthyllis vulneraria и установлено, что наибольшее количество этих веществ содержат корни и листья в фазу бутонизации (3.20 и 2.60%) и цветения (3.46 и 1.92%), а также семена (2.74%).
Впервые изучена динамика содержания протодиосцина и диосцина у культивируемых растений Trigonella foenum-graecum и установлено, что максимальное количество протодиосцина содержат проростки и семена, а также листья растений в фазе бутонизации. Максимальное содержание диосцина отмечено в листьях в фазе цветения и в семенах.
Практическая значимость работы
Во флоре европейского Северо-Востока выявлены виды растений с высоким содержанием тритерпеновых гликозидов: Hedysarum arcticum, Astragalus subpolaris и A. frigidus.
Anthyllis vulneraria рекомендован для выращивания в Республике Коми в качестве лекарственного и кормового растения.
Для интродукции рекомендован вид Trigonella foenum-graecum, который в подзоне средней тайги Республики Коми за вегетационный период проходит все стадии развития и образует полноценные жизнеспособные семена, применяемые в качестве лекарственного сырья для фармацевтической промышленности.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на XV, XVII и XVIII Всероссийских молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008, 2010, 2011); II ежегодной русско-корейской конференции «Современные проблемы в химии природных соединений и биотехнологии» (2nd Annual Russian- Korean Conference «Current issues of natural products chemistry and biotechno- logy») (Новосибирск, 2010); V всероссийской научно-практической конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2010); «Февральских чтениях» Сыктывкарского государственного университета (Сыктывкар, 2011); научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Украина, 2011); международной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина» (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе три статьи в журналах, входящих в «Перечень российских рецензируемых журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук».
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами, включает одно приложение. Список цитируемой литературы включает 162 наименования, в том числе 66 иностранных источников.
Вторичные метаболиты растений
Началом изучения вторичного метаболизма растений считается 1804 г., когда впервые немецким фармакологом Фридрихом Сертюрнером (1783-1841) из растений мака снотворного (Papaver somniferum L., семейство Papaveraceae Juss.) был выделен алколоид морфин. Позже, в 1981 г., немецкий биолог А. Коссель ввел понятие о первичных и вторичных метаболитах (компонентах) клетки. Он указал на то, что первичные метаболиты присутствуют в любой растительной клетке, способной к делению, а вторичные метаболиты - только в некоторых клетках растений и не участвуют в основном обмене клетки. Поэтому первоначально термин «вторичные метаболиты» подразумевал под собой второстепенные, не являющиеся для растений жизненно необходимыми соединения. Это подчеркивает условность возникшей терминологии. Вторичные метаболиты в литературе тех лет (конец Х1Х-начало XX в.) иногда даже называли «веществами роскоши клеток». Изученная к настоящему времени роль вторичных метаболитов растений указывает на то, что данные соединения представлены неким многообразием химических структур, что весьма расточительно по отношению к растению-продуценту, если воспринимать вторичные метаболиты как «вещества роскоши клеток». Сегодня такой взгляд на роль вторичных метаболитов растений подвергается критике. Еше один аргумент в пользу функциональной значимости вторичных метаболитов заключается в том, что процесс вторичного метаболизма растений безупречно организован во времени и пространстве и не может быть случайным событием.
Следующей гипотезой о роли вторичных метаболитов растений является гипотеза об их запасающей функции для растения-продуцента. Учитывая то, что в ряде случаев концентрация вторичных метаболитов в определенных органах растений необъяснимо высока, данная гипотеза не потеряла своего значения и в настоящее время. Известные к настоящему времени сведения о функциональной значимости вторичных метаболитов растений свидетельствуют в пользу гипотезы, утверждающей, что у растений данные соединения выполняют экологические функции, защищая его от вредителей и патогенов, участвуя во взаимодействии растений между собой и другими организмами. Опираясь на вышесказанное, можно отметить, что вторичные метаболиты являются «продуктом» длительной адаптивной эволюции растений к окружающей их среде, которая для разных видов растений весьма разнообразна. Это объясняет возникновение большого многообразия вторичных метаболитов растений и то, что для разных видов растений характерен своеобразный набор данных соединений.
За последние 80 лет исследований в области химии природных соединений с использованием таких аналитических методов разделения веществ, как препаративная тонкослойная хроматография (ПТСХ), жидкостная хроматография (ЖХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) исследователи выделили большое количество вторичных метаболитов природного происхождения, структуры которых определены при помощи появившихся методов масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа.
Количество известных к настоящему времени вторичных метаболитов растений составляет более 140 тыс., вероятно, это не предел, если учесть то, что в настоящее время фитохимический состав подробно изучен менее чем у 30% из 350 000 известных растений. Можно предположить, что реальное число вторичных метаболитов, присутствующих в царстве растений, намного больше. Данные соединения невозможно классифицировать как группу определенных химических соединений, так как к ним относятся абсолютно разные вещества, также нельзя классифицировать и по функциям, так как они выполняют абсолютно разные функции, а для большинства соединений они неизвестны. Но все же, согласно их структуре и путям биосинтеза, данные соединения могут быть разделены на две большие группы: азотсодержащие вторичные метаболиты и не содержащие азота (Wink, 2008) (табл. 1).
Среди разнообразных групп вторичных метаболитов большой интерес представляют сапонины, играющие роль эндогенных факторов защиты во взаимоотношении растений с другими организмами. В частности, многие сапонины обладают бактерицидным, инсектицидным и фунгицидным действием по отношению к различным фитопатогеиам, тем самым опосредованно выполняя экологическую функцию. Являясь важными экологически значимыми компонентами растений, данные соединения вполне могут быть использованы в качестве хемотаксономических маркеров видов и таксонов более высокого ранга (Wink, 2003).
Таким образом, для растений характерно наличие большого числа вторичных метаболитов различной природы, появившихся в результате их адаптивной эволюции (Harborne, 1993). Среди всего многообразия вторичных метаболитов растений большой интерес для изучения представляют сапонины.
Распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России
Семейство Fabaceae - одно из самых обширных семейств цветковых растений, насчитывающее около 550 родов и более 12000 видов, распространенных почти по всему Земному шару. Семейство делится на три подсемейства: Caesalpinioideae, Mimosoideae и Faboideae (Тахтаджян, 1987). Жизненные формы семейства Fabaceae весьма разнообразны. Подсемейства Caesalpinioideae и Mimosoidae представлены в основном древесными и кустарниковыми формами и лианами, травы в них крайне редки (Neptunia, Senna, Chamaecrista и Hoffman-seggia). Среди Faboideae около половины видов относятся к травянистым растениям, многие высокоспециализированные трибы, такие как Vicieae и Trifo-lieae, практически полностью представлены травянистыми растениями (Яковлев, 1991). Во флоре европейского северо-востока России встречаются представители только подсемейства Faboideae, представленные в основном травянистыми растениями, за исключением интродуцента Caragana arborescens Lam. (кустарник).
По распространению сапонинов в растениях известно, что данные соединения обнаружены во многих представителях семейства Fabaceae, в основном это тритерпеновые гликозиды (Sparg et al., 2004), стероидные гликозиды обнаружены в растениях рода Trigonella (Т. foenum-graecum L. и Т. caerulea (L.) Ser.) и Anthyllis macrocephala Wend, из флоры Средиземноморья и Melilotus tau-ricus (Bieb.) Ser. из флоры Крыма (Галкин, 1980; Khodakov et al., 1996). Сведения, касающиеся распространения сапонинов в растениях семейства Fabaceae изучаемой нами флоры европейского северо-востока России, немногочисленны и представлены в табл. 4.
Семейство Fabaceae во флоре европейского северо-востока России насчитывает 61 вид из 16 родов. Нами на содержание тритерпенових и стероидных сапонинов были проанализированы 178 образцов растений 108 видов из 35 родов, относящихся к 14 трибам (см. Приложение), из которых 32 вида из 13 родов являются представителями флоры европейского северо-востока России (табл. 5).
Нами установлено, что практически все исследованные виды изучаемой флоры содержат только тритерпеновые гликозиды (29 видов). По результатам использованных тестов в образцах растений трех видов (Lathyrus sylvestris L., Vicia sepium L., Trifolium hybridum L.) сапонины не обнаружены.
Мы ожидали обнаружить стероидные гликозиды в образцах видов растений из местной флоры, принадлежащих трибе Trifolieae, к которой относятся известные виды-продуценты из родов Trigonella и Melilotus, и в трибе Loteae, которой принадлежат известные по литературным данным продуценты стероидных гликозидов из родов Anthyllis (A. macrocephala) и СогопШа (С. varid). Однако стероидные гликозиды не были обнаружены ни в одном из образцов видов растений изучаемой флоры из указанных выше триб Trifolieae и Loteae. В общей выборке растений (108 видов) стероидные гликозиды были обнаружены в образцах двух степных видов рода Thermopsis TpH6bfThermopsideae. В соответствии с методологией биохимического скрининга для поиска продуцентов стероидных гликозидов были привлечены и виды из неисследованных триб и родов местной флоры, однако и эти попытки не привели к положительному результату. Следует отметить, что тритерпеновые гликозиды были обнаружены у большинства представителей семейства Fabaceae изучаемой флоры. С помощью метода тонкослойной хроматографии были выявлены перспективные виды-продуценты с высоким содержанием тритерпеновых гликозидов. Ими оказались горные виды родов Hedysaram, Astragalus и Oxytropis, а также заносный вид, Anthyllis vulneraria.
Для разработки хемотаксономического прогноза обнаружения новых источников сапонинов нами была произведена филогенетическая реконструкция семейства Fabaceae на основании сравнения полученных нами и взятых из базы данных GenBank (табл. 7) нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спенсеров ITS1 и ITS2. Данные последовательности широко используются для оценки внутривидовой и межвидовой вариабельности у представителей многих родов растений. Выравнивание ITS последовательностей, а именно идентификация вставок и делеций, имевших место в их эволю ционной истории, проводили автоматически и вручную, максимально сопоставляя последовательности путем внесения минимального числа «пробелов». Несмотря на то, что объективных способов оценки выравнивания на сегодняшний день не существует, сочетание автоматического и ручного метода выравнивания нуклеотидных последовательностей считается максимально эффективным (Антонов, 2006). Данный этап позволил нам посчитать число постоянных и вариабельных позиций, соотношение числа транзиций к числу трансверсий, а также выявить гомологичные позиции анализируемых последовательностей ГШиГГЗгСгабл. 6).
После выравнивания нуклеотидных последовательностей нами установлено, что соотношение транзиций и трансверсий меньше единицы, а содержание четырех нуклеотидов значительно отличается от 25% (табл. 6). На этом основании для расчета генетических (эволюционных) дистанций (расстояний) была выбрана модель Таджимы-Неи (Лукашов, 2009). Анализ генетических расстояний между двумя последовательностями показывает, насколько в эволюционном отношении общий предок далек от изучаемых нами последовательностей, т.е. чем меньше эволюционное расстояние между двумя последовательностями, тем недавнее они имели общего предка, что указывает на филогенетическую близость или отдаленность исследуемых видов друг от друга.
Учитывая то, что каждый из существующих методов реконструкции филогении имеет свои недостатки и то, что любое построенное древо является лишь филогенетической гипотезой, мы для верификации топологии молекуляр но-филогенетического древа использовали два метода, принадлежащих к раз ным группам методов - это метод ближайшего связывания (NJ) и метод максимальной парсимонии (MP) (рис. 7). Первый принадлежит к группе дистанционных методов, основанных на том, что для всех изучаемых нуклеотидных последовательностей определяются попарные эволюционные расстояния, и филогенетические древа строятся по определенным алгоритмам с использованием одной из существующих математических моделей эволюции (Антонов, 2006). При использовании метода NJ филогенетическую реконструкцию начали с определения генетических расстояний между парами выровненных нами нуклеотидных последовательностей ITS1 и ITS2 исследуемых видов семейства Faba-сеае, используя модель Таджимы-Неи. В результате данной реконструкции получили филогенетическое древо, для которого сумма длин всех ветвей минимальна (рис. 7а). Метод MP входит в группу методов, анализирующих дискретные признаки, основан на рассмотрении различий между последовательностями нуклеотидов в конкретных позициях. Суть метода заключается в иллюстрации сценария, наиболее вероятно отражающего порядок нуклеотидных замен в эволюционной истории анализируемой группы последовательностей. Филогенетическое древо, построенное методом MP, представлено на рис. 76.
На рис. 7 показано, что значительных отличий в топологии филогенетических деревьев, построенных методом NJ и методом MP, на основании сравнения нуклеотидных последовательностей ITS1 и ITS2 не наблюдается. Следовательно, можно говорить о высокой степени достоверности филогенетической гипотезы взаимоотношений между исследуемыми видами семейства Fabaceae, отраженной на построенном нами филогенетическом древе. Для статистической оценки надежности узлов и каждой ветви реконструированного нами древа использовали бутстреп-метод основанный на методе повторных выборок (Nei, Kumar, 2002).
Химический анализ растений A. vulneraria L
Недавними исследованиями показано, что A. vulneraria содержит тритер-пеновые гликозиды - производные олеаноловой кислоты, которые, по всей видимости, и обуславливают его целебные свойства (Nartowska et al., 2001). Однако сведения о количественном содержании тритерпеновых гликозидов в растениях A. vulneraria, произрастающих на европейском северо-востоке России, отсутствуют. Также отсутствуют сведения о его аминокислотном и микроэлементном составе.
Поскольку известно, что методы определения сапонинов основаны на физико-химических свойствах их агликонов, как наиболее реакционноспособных и фармакологически активных структурных фрагментов, то в качестве стандартного образца при количественном определении тритерпеновых сапонинов A. vulneraria нами была использована олеаноловая кислота, являющаяся их аг-ликоном. В основу количественного определения тритерпеновых сапонинов в образцах A. vulneraria в пересчете на олеаноловую кислоту положен метод прямой спектрофотометрии. Данный метод позволяет количественно определить всю сумму тритерпенових гликозидов - производных олеаноловой кислоты, независимо от числа и структуры углеводных остатков в составе их молекул. Ранее этот метод был опробован на примере определения сапонинов в корневищах аралии маньчжурской (Писарев и др., 2009).
В связи с возможностью использования A. vulneraria в качестве сырья для получения тритерпеновых гликозидов было изучено содержание этих соединений в разных частях растений второго года жизни, отобраных в местообитании 1 (рис. 21).
На анализ отбирались листья, стебли, корни растения на различных фазах его развития: бутонизации, цветения, плодоношения и отмирания. Анализ растений на содержание СТГ в пересчете на олеаноловую кислоту показал, что наибольшее их количество содержится в корнях в фазу бутонизации и цветения, составляя 3.20 и 3.46% соответственно. В надземной части растений A. vulneraria наибольшее содержание СТГ обнаружено в листьях в фазу бутонизации и цветения, составляя 2.60 и 1.90% соответственно, что несколько уступает содержанию СТГ в корнях. В семенах содержание СТГ составило 2.74%.
Поскольку массовая доля корней в структуре урожая мала, а содержание СТГ максимально, в качестве сырья для получения тритерпеновых гликозидов целесообразно использовать всю биомассу растений.
Качественный анализ белка растений A. vulneraria, позволил обнаружить наличие 16-и протеиногеных аминокислот, девять из которых являются незаменимыми: треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гисти-дин, лизин, аргенин (табл. 9).
Суммарное содержание аминокислот составило 10.94 г в 100 г сухого вещества. Показано, что содержание исследуемых аминокислот в растениях этого вида сопоставимо с их содержанием в таких известных кормовых растениях, как клевер, люцерна и кострец безостный, а по содержанию аланина и лизина превосходит их.
Элементный анализ растений Л. vulneraria показал, что надземная часть особенно богата магнием, железом и марганцем (табл. 10). Содержание меди и цинка в растениях этого вида находится на одном уровне с другими известными кормовыми и лекарственными растениями (Постников, 1995; Головко и др., 1996; Андрусенко и Ходько, 2010). Содержание алюминия и тяжелых металлов не превышает максимально допустимый уровень, установленный для кормовых и лекарственных растений, за исключением хрома, содержание которого несколько превышает его (табл. 10) (Тютюнников и Цугкиев, 1995).
Язвенник обыкновенный рекомендуется для более углубленных интро-дукционных и биохимических исследований в качестве кормового и лекарственного растения - источника ценных биологически активных веществ и микроэлементов. Язвенник обыкновенный является не требовательным к почвенно-климатическим условиям и может быть введенно в культуру как одино из компонентов пастбищных травосмесей на бедных песчаных почвах.
Динамика содержания диосцина и протодиосцина в растении Trigonella foenum-graecum L. в культуре на Севере
Считается, что сапонины распределены в системе целого растения неравномерно и в течение вегетационного периода находятся в динамическом состоянии, т.е. по мере развития растений их количество изменяется. Имеющиеся в литературе сведения по локализации биосинтеза стероидных гликозидов в растениях указывают на то, что стероидные гликозиды синтезируются в листьях в виде фуростаноловых производных, а при транспорте в подземные органы трансформируются в спиростаноловые аналоги (рис. 23).
На примере Dioscorea deltoidea Wall, было показано, что этот процесс катализирует эндогенная специфичная (і-глюкозидаза, обнаруженная в листьях (The biosynthesis..., 1969). Этот фермент в тканях корневищ и проростков Cosus speciosus (J. Konig) Sm. в системе in vitro также трансформирует фуростано-ловый гликозид протограцилин в его спиростаноловый аналог грацилин. Ц.А. Гиоргадзе из Института фармакохимии им. И.Г. Кутателадзе (ГАН, г. Тбилиси) опубликованы данные о том, что в растениях Yucca gloriosa L. стероидные гли-козиды накапливаются в листьях в фуростаноловой форме, однако при этом имеют разную тканевую и внутриклеточную компартментацию с расщепляющим их ферментом Р-глюкозидазой. Фермент локализован в мезофильной ткани листа, а субстрат - в клетках эпидермиса (Гиоргадзе, 2006). Предполагается, что различная тканевая и внутриклеточная локализация субстрата и фермента обеспечивает в листьях сохранность фуростаноловой структуры, в форме которой происходит транспорт в центры аккумуляции. Повреждение тканей влечет за собой превращение фуростаноловой формы в спиростаноловую, которая благодаря высокой мембранолитической активности представляет собой эндогенный фактор защиты растений против фитопатогенов. В свою очередь фуроста ноловые гликозиды, имеющие слабо выраженные мембранолитические свойства, стимулируют ростовые процессы в растениях (Васильева, Пасешниченко, 2000).
Установление характера распределения изучаемых стероидных гликози-дов по органам растений является важной предпосылкой понимания их роли в растении, а также может иметь практическое значение для определения оптимальных сроков заготовки растительного сырья.
Нами был исследован характер распределения диосцина и протодиосцина в различных органах растения Trigonella foenum-graecum по фазам его развития. На первой фазе (прорастание) анализировали растение целиком. На второй (бутонизация), третьей (начало цветения) и четвертой (цветения) анализировали листья, стебли и корни. На пятой фазе (плодоношение) анализировали листья, стебли, корни и семена (рис. 24).
При исследовании характера распределения протодиосцина и диосцина в различных органах растения пажитника сенного по фазам развития установлено, что содержание протодиосцина и диосцина в проростках составило 1.37 и 0.62% соответственно.
Исследование динамики содержания протодиосцина (от сухой массы) по органам и фазам развития растения показало, что его содержание в листьях в фазе бутонизации растения составляет 1.65%. В фазе начала цветения его содержание в листьях уменьшилось в четыре раза (р 0.001) по сравнению с предыдущей фазой и составило 0.41%. В фазе цветения содержание протодиосцина возросло в среднем в полтора раза (р 0.05) и составило 0.76%, при этом практически не изменяясь в фазе плодоношения (табл. 15). Нами установленно, что в стеблях и корнях содержание протодиосцина на всех фазах его развития не превышает 0.10%. При этом в стеблях и корнях содержание протодиосцина в фазе бутонизации приблизительно одинаково. В фазе начала цветения в стеблях его содержание увеличилось в четыре раза (р 0.001), а в корнях, наоборот, снизилось более чем в три раза (р 0.001). В фазе цветения содержание протодиосцина в стеблях незначительно уменьшается, а в корнях увеличивается более чем на порядок (р 0.001) В фазе плодоношения в стеблях содержание протодиосцина по сравнению с предыдущей фазой уменьшилось на 44% (р 0.05), а в корнях, наоборот, возросло на 56% (р 0.05). В семенах содержание протодиосцина составило 1.96% (табл. 15).
Содержание диосцина в листьях растения в фазах бутонизации и начала цветения приблизительно одинаково и составляет в среднем 0.5% (табл. 15). В фазе цветения его содержание в листьях составляет 1.27%, что более чем в два раза больше предыдущей фазы (р 0.001). В фазе плодоношения содержание диосцина в листьях пажитника сенного резко падает до 0.15% - это в восемь раз ниже, чем в фазе цветения (р 0.001). В стеблях в фазе бутонизации и начала цветения содержание диосцина составляет в среднем 0.43%, в фазе цветения оно увеличивается в полтора раза (р 0.05) и составляет 0.65%. В фазе плодоношения его содержание уменьшается более чем в четыре раза по сравнению с предыдущей фазой (р 0.001). В корнях содержание диосцина в фазе начала цветения по сравнению с фазой бутонизации уменьшилось более чем в шесть раз (р 0.001), составив 0.10%. В фазе цветения по сравнению с фазой начала цветения содержание диосцина в корнях уменьшилось еще в три раза (р 0.001) и составило 0.03%. В фазе плодоношения в сравнении с предыдущей стадией содержание диосцина в корнях возросло в 10 раз (р 0.001) и составило 0.33%. В семенах содержание диосцина составило 1.12% (табл. 15). Таким образом, при изучении особенностей онтогенеза растений Trigonel-la foenum-graecum на европейском северо-востоке России и накопления в них стероидных гликозидов установленно, что за вегетационный период пажитник сенной проходит все стадии своего развития и образует полноценные жизнеспособные семена с высоким содержанием стероидных гликозидов фуростано-лового (протодиосцин) и спиростанолового (диосцин) рядов. Установлено, что наибольшее количество протодиосцина и диосцина содержится в семенах, проростках (основную часть которых составляют первые два листа) и листьях. При этом в листьях наибольшее количество протодиосцина наблюдается в фазе бутонизации, а диосцина - в фазе цветения. Полученные данные полностью соответствуют представлению о том, что максимальное количество соединений, ответственных за защиту растений от фитопатогенов, сосредотачивается в жизненно важных органах растений - в физиологически молодых тканях растений и семенах.
