Содержание к диссертации
ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1. Общая характеристика биотических и абиотических компонентов экосистем рыбохозяйственных водоемов Азово-Донского бассейна
2. Состояние биоресурсов в условиях загрязнения водной среды генотоксичными ксенобиотиками
3. Генотоксичность компонентов водной среды Азово- Донского бассейна
4. Методология биотестирования генетической активности 38
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 62
5. Материалы исследований 62
6. Методы исследований 63
7. Получение рекомбинантных штаммов Е. Coli для SOS-lux теста
8. Протокол тестирования генотоксичности в SOS-lux тесте 65
9. Определение антимутагенного потенциала 66
10. Приготовление экстрактов природных проб для тестирования генотоксичности
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 70
11. Оценка адекватности методов при тестировании генотоксичности
12. Оценка потенциальной опасности генотоксичности донных отложений разных участков Нижнего Дона и Азовского моря для состояния биологических ресурсов
3.3. Оценка генотоксичности в тканях гидробионтов Азово Донского бассейна и ее взаимосвязь с физиолого- биохимическими характеристиками
3.4. Оценка устойчивости биоресурсов Азово-Донского бассейна к загрязнению на основе анализа антимутагенного потенциала тканей гидробионтов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Прогноз состояния биоресурсного потенциала рыбохозяйственных водоемов Азово-Донского бассейна на основе анализа генотоксичности их компонентов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Развитие научно-технического прогресса в течение 20 века принесло человечеству кроме новых возможностей и дополнительных благ, проблему загрязнения окружающей среды. На протяжении веков отходы деятельности человека утилизировались с помощью естественных природных процессов. Но эта стабильность была нарушена по ряду причин. Демографический взрыв и возрастание расходов энергии и сырья привели к бесконтрольному поступлению в окружающую среду всё больших объёмов антропогенных загрязняющих веществ. Каждый год регистрируется до полумиллиона новых химических соединений, многие из которых не поддаются биодеградации. В этот объём входят около 1500 пестицидов, 4000 лекарственных препаратов, 38000 потенциально токсичных веществ и 50000 промышленных химикатов (Бочков, Чеботарев, 1989). Такое количество соединений создает множество проблем, в том числе необходимость прогнозирования последствий их широкого применения. Следует отметить, что в окружающей среде многие соединения могут длительно циркулировать в биосфере и, включаясь в пищевые цепи, накапливаться в различных компонентах экосистем.
В настоящее время токсикологические характеристики становятся неотъемлемой частью описания многих водоемов. Антропогенное загрязнение оказывает растущее негативное воздействие на биологические ресурсы водоемов и является одним из главных факторов нанесения ущерба рыбному хозяйству. Для сохранения водных биоресурсов, как основы благополучия промысловых запасов, необходим постоянный мониторинг состояния водных экосистем (Воловик, 2000; 2002).
Для Азовского моря, биоресурсы которого существенно сократились, проблема накопления токсикантов, в частности, веществ, вызывающих повреждение наследственного аппарата гидробионтов, особенно актуальна. Бассейны двух больших рек - Кубани и Дона, впадающих в море, расположены в районах с интенсивно развитыми сельским хозяйством, химической, горнодобывающей промышленностью и машиностроением. Спектр попадающих в море токсикантов необычайно широк, что, безусловно, затрудняет применение для мониторинга загрязнения методов химического анализа. Поэтому использование методов интегральной оценки токсикологических характеристик компонентов экосистем является важнейшей частью экологических исследований биологических ресурсов. Особого внимания заслуживает способность многих соединений повреждать наследственный аппарат живых организмов. Известно, что действие мутагенов - веществ, вызывающих мутации или иные генетические повреждения, приводит к росту числа наследственных заболеваний, врожденных уродств и развитию злокачественных опухолей (Арефьев, 1998).
Особая опасность мутагенных соединений заключается в том, что они могут вызывать значительное увеличение числа рецессивных мутаций, ведущих к тяжелым заболеваниям, которые не проявляются в первом поколении, но, постепенно накапливаясь, могут через несколько поколений вызвать "взрыв" заболеваемости у различных живых объектов.
В оценке опасности и направленности происходящих изменений качества водной среды значительную информативную ценность представляет биотестирование генетической опасности различных компонентов экосистемы при помощи экспресс-тестов на микроорганизмах, дрозофиле, растениях. Первоначально применяли тест-системы для определения частоты мутаций, поэтому использовали термин "мутагенность". Однако мутации - далеко не единственный феномен, вызываемый повреждением генетического аппарата и поскольку применение тестов, основанных на других генетических эффектах, зачастую оказывается более информативным, в настоящее время чаще применяют близкий, но не идентичный, термин "генотоксичность" (Muller et al., 1999).
Анализ литературы, а также данных, полученных нами в 1989-2000 годах по Азово-Донскому бассейну, показал, что загрязнение гидросферы генотоксикантами носит масштабный характер. Практически все компоненты водных экосистем Азовского моря в большей или меньшей степени подвержены действию ксенобиотиков, вызывающих повреждение наследственного аппарата гидробионтов, что негативно сказывается на состоянии биоресурсов бассейна (Воловик, 2000; 2002). Причем уровни загрязнения настолько высоки, что эффекты регистрируются без концентрирования образцов.
Однако из-за недостаточно высокой производительности методов, использованных при исследовании Азово-Донского бассейна (Тихонова, Чистяков, 1996; Корниенко и др., 1998; Дехта и др., 2000), данные по корреляции генотоксичности с результатами химического анализа поллютантов, а также по воздействию генотоксикантов, накопившихся в тканях рыб, на их физиолого-биохимическое состояние, в достаточной степени фрагментарны.
В последние годы особое внимание уделяется люминесцентным биосенсорам, которые реагируют на специфические молекулярные изменения в клетке. Перспективность и преимущества использования методов, основанных на применении биосенсоров, очевидны. Они исключительно чувствительны, объективны и на их количественное выражение не влияет эндогенная активность клеток - хозяев. В настоящее время разработан ряд биолюминесцентных тестов на генотоксичность, в том числе на SOS-индукцию. Эти тесты способны регистрировать генетическую активность широкого спектра химически чистых соединений, однако их применение для природных объектов, в которых эти вещества содержатся в виде сложных комплексов, ограничено опасностью возникновения ряда артефактов (Ржевский и др., 1998).
При анализе исследований по генотоксичности тканей обитателей Азово-Донского бассейна, не менее интересным является вопрос о механизмах адаптации гидробионтов к выявляемому загрязнению. Определение уровня антимутагенной защиты может стать важным показателем для оценки адаптивного потенциала популяций гидробионтов из экологически неблагополучных водоемов. Для изучения этого вопроса необходим специальный тест на антимутагенную активность экстрактов тканей гидробионтов. Поэтому целью данной работы было: 1) разработать метод адекватной оценки генетической активности и исследовать генотоксичность компонентов водной экосистемы Азово-Донского бассейна, определяющих ее биоресурсный потенциал; 2) выявить связь с результатами биохимических исследований тканей биообъектов; 3) оценить антимутагенную активность тканей гидробионтов Азово-Донского бассейна, как показатель, определяющий устойчивость биоресурсов к загрязнению генотоксинами; 4) оценить перспективы использования показателей генотоксичности для оценки биоресурсного потенциала.
Основные задачи исследований.
Одной из главных экспериментальных задач была разработка теста для мониторинга генотоксических факторов компонентов водных экосистем, защищенного от наиболее вероятных артефактов, и теста для оценки антимутагенной активности тканей гидробионтов. Для ее осуществления необходимо было провести ряд методических разработок:
получить рекомбинантные штаммы Е. coli для SOS-lux теста;
разработать вариант метаболической активации, оптимальный для SOS-lux теста;
разработать оптимальный метод экстракции для извлечения генотоксинов из донных отложений и тканей гидробионтов;
К задачам мониторинга состояния биологических ресурсов относятся следующие:
- оценить генотоксичность воды и донных отложений водных объектов некоторых районов Азово-Донского бассейна при помощи SOS-lux теста, найти связь генотоксичности и данных химического анализа поллютантов в них;
- оценить генотоксичность тканей гидробионтов Азово-Донского бассейна в SOS-lux тесте; найти возможную корреляцию с характеристиками функционального состояния гидробионтов.
- оценить антимутагенную способность тканей гидробионтов водоемов Азово- Донского бассейна, составляющих их биоресурсный потенциал;
- оценить возможность использования данных по генотоксичности для прогноза биопродуктивности водоемов Азово-Донского бассейна в условиях антропогенной нагрузки.
Научная новизна.
Впервые предложена более корректная модификация SOS-lux теста, позволяющая избежать ряда артефактов, связанных с влиянием тестируемых соединений на активность люциферазы, что особенно важно при работе с тканями гидробионтов.
Подобраны оптимальные условия метаболической активации для выявления промутагенов. Выявлены эффективные методы пробоподготовки воды, донных отложений и тканей гидробионтов.
Новизной отличаются исследования генотоксичности экстрактов донных отложений Нижнего Дона от места впадения р. Дон в Таганрогский залив (створ, 0 км), до устья р. Северский Донец в разные сезоны 2001 и 2002 гг. Выявлены места стабильного загрязнения генотоксинами, что позволяет прогнозировать в этих районах деградацию биоресурсов.
Новыми являются данные о повышенной загрязненности генотоксинами донных отложений Азовского моря по сравнению с р. Дон, проведен анализ корреляции обнаруженных генотоксических эффектов с результатами химического мониторинга. На основании полученных данных проведено картирование генотоксичности донных отложений Нижнего Дона и Азовского моря.
Впервые проведен анализ корреляции генотоксичности тканей и биохимических характеристик функционального состояния осетровых рыб.
Впервые исследован антимутагенный потенциал тканей рыб Азово-Донского бассейна (русский осетр, севрюга, пиленгас, чехонь, тарань), как показатель, позволяющий оценить сравнительную устойчивость биоресурсов к генотоксическому прессингу.
Теоретическая и практическая значимость работы и реализация результатов исследований.
Разработан вариант биолюминесцентного теста на SOS-индукцию, позволяющий корректировать артефакты, связанные с подавлением активности люциферазы, что дает возможность оперативно оценивать генотоксичность основных компонентов, определяющих биоресурсный потенциал водных экосистем. Полученные результаты могут служить сигналом существования негативных тенденций в развитии биоресурсного потенциала водных экосистем.
На репрезентативном материале изучены статистические взаимосвязи между биохимическими и генетико-токсикологическими характеристиками ценнейшего вида биоресурсов Азовского моря - осетровых рыб. Показано, что негативные последствия индукции микросомальных оксигеназ не исчерпываются истощением токоферола. Взаимодействие промутагенов с этими ферментами ведет не только к детоксикации, а часто к превращению в генотоксиканты прямого действия, способные вызывать повреждение клеточной ДНК.
Показано, что ткани осетровых рыб (Acipenseridae) Азовского моря обладают более высокими, по сравнению с костистыми (Teleostei), уровнями низкомолекулярных антимутагенов, что может являться одним из механизмов, обеспечивающих высокую адаптационную способность хрящевых ганоидов, в том числе и к загрязнению водной среды.
Выявлены районы нижнего Дона, для которых характерно хроническое загрязнение генотоксинами, показана тенденция к аккумуляции этого класса токсикантов в Азовском море.
Выявление элементов-доминантов загрязнения природной среды позволит проводить направленный поиск источников загрязнения -предприятий, технологических звеньев и пр., которые несут ответственность за формирование высокой техногенной нагрузки в экосистемах.
Разработанный метод оценки антимутагенного эффекта позволяет определять антимутагенный потенциал гидробионтов, опосредованный содержанием в их тканях антиоксидантов, что позволяет оценивать адаптационный потенциал разных видов биоресурсов, в том числе и устойчивость к загрязнению генотоксическими веществами.
Возможно применение метода как для массового мониторинга антимутагенного потенциала гидробионтов, который может стать важным показателем для оценки адаптивных возможностей популяций обитателей загрязненных водоемов и сохранения биологических ресурсов, так и для поиска новых природных антимутагенов. Выявление антимутагенов имеет также практическое значение, поскольку они являются основой большого числа лекарственных препаратов и пищевых добавок.
На основании данных, полученных в результате проведенных исследований, можно полагать, что осетровые рыбы могут служить не только пищевым объектом, но и возможным источником веществ, защищающих генетический аппарат человека от деструктивных воздействий экзо - и эндогенных факторов.
Разработанный для целей данного исследования тест используется для мониторинга среды обитания и оценки биоресурсного потенциала промысловых рыб Азово-Донского бассейна, а также для оценки отдаленных последствий влияния загрязнения среды на биологические ресурсы при проведении нефтеразведки и нефтедобычи на Северном Каспии.
Апробация работы.
Результаты диссертации доложены на 2 съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Санкт - Петербург, 2000); на научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития аквакультуры в России» (Краснодар, 20 01); на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002) и Ученых Советах Азовского НИИ рыбного хозяйства.
Публикация результатов исследований.
По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе получен патент РФ №2179581.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 таблицами, 9 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 90 источников отечественных и 128 зарубежных авторов. Личный вклад автора.
Автором самостоятельно выполнена экспериментальная часть работы, статистически обработаны и обсуждены все результаты, имеются самостоятельные публикации.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Генотоксичность основных компонентов водных экосистем, определяющих их биоресурсный потенциал, может быть адекватно оценена с помощью разработанного варианта SOS-lux теста в комплексе с соответствующими методами пробоподготовки.
2. Загрязнение водоемов Азово-Донского бассейна генотоксичными веществами вызывает у ряда ценных промысловых рыб функциональные изменения, ведущие к деградации соответствующих видов биологических ресурсов.
3. Антимутагенный потенциал позволяет сравнить устойчивость разных видов биоресурсов к загрязнению генотоксинами.
Работа проводилась в лаборатории комплексной экологической экспертизы АзНИИРХа в соответствии с планом научно-исследовательских работ согласно научно-технической отраслевой программе Государственного Комитета РФ по рыболовству «Провести комплексные исследования биоресурсов Азово-Черноморского бассейна с целью их рациональной эксплуатации, сохранения и разработки долгосрочных перспектив развития рыболовства» (проект «Биоресурсы»).
